一种水稻工程保持系的构建方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种水稻工程保持系的构建方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 水稻杂种优势利用是提高水稻产量最有效的途径。"三系法"杂交水稻对种质资源 利用率低以及"两系法"杂交水稻杂交制种安全性约束是影响杂交水稻种植推广面积进一 步扩大的重要因素。发明新的育种技术，开发出对种质资源利用率高、杂交制种安全的水稻 杂种优势利用方法是杂交水稻发展的方向。普通隐性核不育材料不育性稳定、杂交制种安 全，易于配制高产、优质、多抗组合；共同的缺点是无法实现不育系种子的批量繁殖。
[0003] 针对隐性核雄性不育材料的繁殖问题，育种家也先后提出多种解决方案，主要包 括：（1)根据雄性不育机理，通过施加缺失的代谢中间物质（如氨基酸、黄酮、脂肪酸等物 质），使突变不育株恢复育性而得以繁殖；(2)在雄性不育株中，利用条件控制（如诱导性） 启动子驱动育性恢复基因表达，给予适合的启动子表达条件时，育性恢复基因表达，育性恢 复而得以繁殖；而不给予适合启动子表达的条件时，育性恢复基因不表达，即为不育系。此 外，也可以利用条件控制启动子驱动作物内源育性基因的抑制因子表达而达到上述同样的 目的。以上这些方案在不同作物的实际生产中得到了不同程度的应用，但由于不育系的育 性转换不能被完全精确地控制，或者不育系中含有转基因成分并因而造成杂交种中含有转 基因等问题，都没有得到广泛的应用。
[0004] 随着分子设计育种思想和技术的进步，开发能够精确控制的不带转基因成分的不 育系的繁殖技术，成为分子设计杂交育种技术领域亟需解决的问题。1993年6月11日，国 外生物技术公司PLANT GENETIC SYSTEM提出了一项PCT专利申请，该专利提出以下技术思 想：在隐性雄性不育植株中导入连锁表达的育性恢复基因、花粉致死（败育）基因以及筛 选标记基因（如荧光蛋白基因）三套元件，可以获得该雄性不育植株的保持系，保持系通 过自交就可以实现不育系和保持系的繁殖。2002年，Perez-Prat等人提出，可以通过在纯 合的雄性不育植株中导入连锁表达的育性恢复基因和筛选标记基因两套元件，由此获得该 雄性不育植株的保持系，保持系与不育株杂交即可繁殖不育系和保持系。两种方法提出了 利用精确的分子生物技术手段，解决隐性核雄性不育基因及不育材料的应用问题，为开展 分子设计杂交育种提供了技术框架。相比较而言，三元件系统考虑到花粉逃逸和转基因生 态风险的问题，较双元件系统思路更加缜密。2006年，美国杜邦先锋公司在三元件系统技 术思路基础上，首先在玉米中实现了基于核不育突变材料的种子生产技术，并命名为Seed Production Technology(SPT)技术。2010年9月，在中国科技部"国家高技术研宄发展计 划"的支持下，三元件系统技术思想在水稻中得到了证实和应用，并被称之为"智能不育杂 交育种技术"或"第三代杂交水稻技术"。通过项目的实施，将有力推动智能不育分子设计 技术在作物育种中的研宄应用，使我国在水稻杂交育种领域继续保持国际领先优势，为促 进生物育种产业的发展提供技术和产品支持。
[0005] 从思路上来说，SPT技术几乎完美，既可以实现普通核不育系的繁殖，又可以消除 人们对于转基因风险的担忧，因为杂交后代植株中没有外源的转基因元件，不存在转基因 生物安全问题。但是在实际操作过程中会遇到以下几个问题：（1)转化受体取材受到限制， 因为互补载体要转化到不育植株中去，因此只有选择不育水稻植株的幼穗诱导愈伤组织； 取材受到很大限制，并且有效取材时间很短；(2)育性恢复基因的导入对突变不育株的表 型恢复并不十分理想，对于后续的制种产量影响很大。原因可能与载体序列在受体基因组 上的插入位点有关，侧翼序列的特征对育性恢复基因的表达水平可能会有影响。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的克服现有技术的不足，并提供至少后面将说明的优点。
[0007] 本发明另一个目的是提供一种水稻工程保持系的构建方法，本发明通过CRISPR/ Cas9系统将外源报告基因整合到野生型水稻的染色体上，解决了转化受体材料受限制的问 题。
[0008] 本发明还有一个目的提高水稻工程保持系在水稻育种中的应用，本发明的水稻工 程保持系可用于水稻普通隐性雄性核不育系繁殖中，培育后的水稻工程保持系产品可机械 化、规模化应用于水稻普通核不育系的繁殖制种中，且过程简单、操作方便。
[0009] 为此，本发明提供的技术方案为：
[0010] 一种水稻工程保持系的构建方法，包括：
[0011] 步骤一、将外源报告基因定点整合到野生型水稻的染色体上得到含有外源报告基 因的转基因株系，其中，该外源报告基因与野生型育性调控基因能够紧密连锁遗传；以及， 之后进入步骤二，
[0012] 步骤二、将步骤一中得到的转基因株系与纯合隐性水稻普通雄性核不育株系杂 交，筛选含有所述外源报告基因的株系即为所需要的水稻工程保持系，其中，该纯合隐性水 稻普通雄性核不育株系为所述育性调控基因突变体株系。
[0013] 优选的是，所述的水稻工程保持系的构建方法，在所述步骤一之前还包括：通过图 位克隆确定出纯合隐性水稻普通雄性核不育株系中突变型育性调控基因在染色体上的位 置。
[0014] 优选的是，所述的水稻工程保持系的构建方法中，所述步骤一中，将外源报告基 因定点整合到野生型水稻的染色体上获得含有外源报告基因的转基因株系的具体方法包 括：
[0015] (1. 1)分析野生型水稻染色体上育性调控基因的上下游序列区域，取该区域内 NGG前面的20bp作为靶位点区域，并设计与该靶位点区域配对的引物序列，在引物上游序 列前加GCAA，在引物下游序列前加AAAC，得到引物
[0016] 上游序列：5' -GCAA NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'（SEQ ID NO :1)
[0017] 下游序列：5' -AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'（SEQ ID NO :2);
[0018] (1. 2)根据CRISPR/Cas9系统，将步骤（1. 1)中的引物序列构建到pPIC. 1载体上 得到基因整合载体；
[0019] (1. 3)将外源报告基因构建到表达载体上得到重组表达载体；
[0020] (1. 4)将所述重组表达载体和所述基因整合载体共转化野生型水稻，得到转基因 植株；
[0021] (1. 5)在靶位点两翼设计引物，以转基因植株基因组进行扩增，若扩增产物片段大 小与外源报告基因片段大小大致相等，则判定该植株为含有外源报告基因的水稻转基因株 系，并且在靶位点定点插入整合。
[0022] 优选的是，所述的水稻工程保持系的构建方法中，所述步骤（1. 3)中，所述表达载 体采用过表达载体。
[0023] 优选的是，所述的水稻工程保持系的构建方法中，所述重组表达载体中，所述外源 报告基因的核苷酸序列前构建有水稻胚乳特异性启动子Gtl。
[0024] 较优选的是，所述的水稻工程保持系的构建方法中，所述育性调控基因为水稻 EAT1基因。
[0025] 较优选的是，所述的水稻工程保持系的构建方法中，所述步骤（1. 1)中的引物序 列为：
[0026] 上游序列：5' -GCAAGAGCGAGAGGGGAAGCAITT-3'（SEQ ID NO :3)
[0027] 下游序列：5' -AAACAAATGCTTCCCCTCTCGCTC-3'（SEQ ID NO :4)。
[0028] 较优选的是，所述的水稻工程保持系的构建方法中，所述外源报告基因为红色荧 光标记基因、红色荧光蛋白标记基因、绿色荧光蛋白基因、或蓝色荧光标记基因中的任意一 种。
[0029] 水稻工程保持系在水稻育种中的应用，所述水稻工程保持系由任一所述的方法获 得。
[0030] 本发明至少包括以下有益效果：
[0031] 本发明通过CRISPR/Cas9系统将外源报告基因整合到野生型水稻的染色体上，解 决了转化受体材料受限制的问题。外源片段的定点整合综合考虑了育性调控基因和筛选报 告基因的表达，避免了以前转基因的随机整合位点导致的目的基因表达的不确定性。
[0032] 本发明的水稻工程保持系可用于水稻普通隐性雄性核不育系繁殖中，培育后的水 稻工程保持系产品可机械化、规模化应用于水稻普通核不育系的繁殖制种中，且过程简单、 操作方便。
[0033] 定义
[0034] 为了便于理解本发明，定义了大量术语和短语
[0035] 本发明中的"反向互补"，指通过碱基配对原则关联的核苷酸序列。例如，序列 ''5' -A-T-G-3"' 与序列 "5' -C-A-T-3"' 反向互补。
[0036] 术语"基因"是指一种DNA分子，基因是遗传变异的主要物质，是控制生物性状的 基本遗传单位，基因中编码RNA或蛋白质的碱基序列成为结构基因，本发明中所称的基因 为结构基因。
[0037] "野生型基因"是指一种从来源中分离的基因，本发明的"野生型基因"是首先利用 水稻不育突变体通过图位克隆方法得到突变基因的位置，然后从水稻野生型中获得该位置 处的对应的基因的序列，即为"野生型基因"。而"突变的基因"是指一种基因，与"野生型基 因"相比，其具有序列和/或功能性质的修饰（即改变的特征）。
[0038] "等位基因"一般指位于一