g/ L，2,4-D 2. 5mg/L，麦芽糖 30g/L，琼脂粉 8. 5g/L，乙酰丁香酮 0? ImM，调节 pH 5. 6
[0083] 筛选培养基J3S :继代培养基J3,头胞霉素500mg/L，羧变青霉素400mg/L，潮霉素 50mg/L
[0084] 预分化培养基Y :N6大量，CuS043mg/L，N6铁盐，B5维生素，谷胺酰氨0. 5g/L，脯 氨酸0? 5g/L，水解酪蛋白0? 3g/L，BA 3mg/L，NAA lmg/L，蔗糖30g/L，山梨醇20g/L，琼脂粉 8. 5g/L，pH 6. 0,头胞霉素 500mg/L，羧变青霉素 400mg/L
[0085] 分化培养基D :N6大量盐分，10倍B5微量盐分，D铁盐（FeS04 ? 7H20 55. 9mg/L， Na2EDTA 74. 5mg/L)，DL维生素，谷胺酰氨0? 5g/L，脯氨酸0? 5g/L，水解酪蛋白0? 8g/L，BA 2mg/L，IAA 0? 2mg/L，NAA 0? 2mg/L，KT 2mg/L，麦芽糖 30g/L，琼脂粉 8. 5g/L，调节 pH 6. 0， 头胞霉素500mg/L，羧变青霉素400mg/L
[0086] 生根培养基R :MS盐分和维生素，蔗糖15g/L，IAA 0? 5mg/L，NAA 0? 5mg/L，琼脂粉 8g/L，pH 6. 0
[0087] 在本实施例中，该育性调控基因为EATl(L0C_0s04g51070)基因，纯合隐性水稻 普通雄性核不育突变体中的序列和野生型的相比，发生了碱基插入。通过CRISPR/Cas9 系统实现定点插入，将报告基因定点插入到育性调控基因侧翼序列，理论上是百分之百连 锁。在水稻中，如果连锁率为99%，则报告基因和育性恢复基因的物理距离为250X 103(约 250Kb)，本实施例中整合位点选择在育性基因下游lOOObp范围内，即lkb之内，两个基因之 间没有间隔，遗传表现共分离。
[0088] 整合位点的设计和合成具体包括：
[0089] 1、分析育性调控基因EAT1下游序列，设计引物F和R
[0090] 分析育性基因下游序列lOOObp范围内，在该区序列中找到NGG(N为A，T，C或G)， 最好是AGG，取NGG前面的20bp作为target序列。
[0091] Target序列的正链在5'加GCAA，负链在5'加AAAC。
[0092] 其中上游的GCAA，下游的CAAA为Bbsl酶切形成的粘性末端。
[0093] 艮P :
[0094] 其中一个整合位点的合成引物为；
[0095] 上游 F :5'-GCAAGAGCGAGAGGGGAAGCATTT-3'（SEQ ID NO :3)
[0096]下游R :5' -AAACAAATGCTTCCCCTCTCGCTC-3'（SEQ ID NO :4)
[0097] 将设计后的序列送到值得信赖的公司合成，纯化级别为PAGE。
[0098] 2、线性化pPIC. 2载体，pPIC. 2载体的图谱如图3所示
[0099] 使用Bbsl酶切pPIC. 2 (氨苄抗性）载体，回收3. 2kb的片段；
[0100] 3、重组pPIC. 2载体的构建
[0101] 将引物上下游（SEQ ID NO :3和4)正负链oligos(lOOyM)等比例混合后，加热到 95°C，3min，自然冷却至40°C以下，制备得到双链DNA ;将双链DNA与酶切纯化后的pPIC. 2 载体片段连接、转化大肠杆菌，构建得到重组pPIC. 2载体。对重组载体进行测序，确认插入 序列的正确性。
[0102] 然后EcoRI、Nhel双酶切重组载体pPIC. 2,回收约520bp的DNA片段；
[0103] 4、重组pPIC. 1载体的构建
[0104]pPIC. 1载体的图谱如图4所示，使用EcoRI、Xbal双酶切pPIC. 1 (卡那霉素 抗性）载体，回收载体片段；将步骤3中得到的520bp DNA片段与酶切后的pPIC. 1进 行T4DNA酶连接，转化大肠杆菌，得到重组载体pPIC. 1，重组载体pPIC. 1即为构建好的 CRISPR/Cas9系统植物基因整合载体。后续进行重组载体pPIC. 1转化农杆菌，然后与 pCAMBIA1300-Gtl-DsRED-CaMVTerm载体共转化水稻愈伤组织，筛选阳性克隆，测序验证，整 合位点分析等。
[0105] 实施例2
[0106] 水稻Gtl启动子的克隆和连接
[0107] 以水稻基因组 DNA 为模板，利用引物 GT1-F :5-aaAAGCTTCACCCTCAATAITTGG-3 (含 Hind III 酶切位点）（SEQ ID NO :5)，GT1-R :5-aaGGATCCGITGTTGTAGGACTAATG-3(含 BamH I酶切位点）（SEQ ID NO :6)，通过PCR克隆扩增得到Gtl启动子的基因序列，Gtl启动子的 碱基序列如SEQ ID NO :7所示，其中，
[0108] PCR扩增体系及程序如下：
[0109]
【主权项】
1. 一种水稻工程保持系的构建方法，其特征在于，包括： 步骤一、将外源报告基因定点整合到野生型水稻的染色体上得到含有外源报告基因的 转基因株系，其中，该外源报告基因与野生型育性调控基因能够紧密连锁遗传；以及，之后 进入步骤二， 步骤二、将步骤一中得到的转基因株系与纯合隐性水稻普通雄性核不育株系杂交，筛 选含有所述外源报告基因的株系即为所需要的水稻工程保持系，其中，该纯合隐性水稻普 通雄性核不育株系为所述育性调控基因突变体株系。
2. 如权利要求1所述的水稻工程保持系的构建方法，其特征在于，在所述步骤一之前 还包括：通过图位克隆确定出纯合隐性水稻普通雄性核不育株系中突变型育性调控基因在 染色体上的位置。
3. 如权利要求1或2任一所述的水稻工程保持系的构建方法，其特征在于，所述步骤一 中，获得含有外源报告基因的转基因株系的具体方法包括： (I. 1)分析野生型水稻染色体上育性调控基因的上下游序列区域，取该区域内NGG前 面的20bp作为靶位点区域，并设计与该靶位点区域配对的引物序列，在引物上游序列前加 GCAA，在引物下游序列前加AAAC，得到引物 上游序列：5' -GCAANNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3' 下游序列：5' -AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3' ； (1. 2)根据CRISPR/Cas9系统，将步骤（I. 1)中的引物序列构建到pPIC. 1载体上得到 基因整合载体； (1. 3)将外源报告基因构建到植物表达载体上得到重组表达载体； (1. 4)将所述重组表达载体和所述基因整合载体共转化野生型水稻，得到转基因植 株； (1. 5)在靶位点两翼设计引物，以转基因植株基因组进行扩增，若扩增产物片段大小与 外源报告基因片段大小大致相等，则判定该植株为含有外源报告基因的水稻转基因株系， 并且在靶位点定点插入整合。
4. 如权利要求3所述的水稻工程保持系的构建方法，其特征在于，所述步骤（1.3)中， 所述表达载体采用植物表达载体。
5. 如权利要求3所述的水稻工程保持系的构建方法，其特征在于，所述重组表达载体 中，所述外源报告基因的核苷酸序列前构建有水稻胚乳特异性启动子Gtl。
6. 如权利要求3所述的水稻工程保持系的构建方法，其特征在于，所述育性调控基因 为水稻EATl基因。
7. 如权利要求6所述的水稻工程保持系的构建方法，其特征在于，所述步骤（I. 1)中的 引物序列为： 上游序列：5' -GCAAGAGCGAGAGGGGAAGCAITT-3' 下游序列：5' -AAACAAATGCTTCCCCTCTCGCTC-3'。
8. 如权利要求1所述的水稻工程保持系的构建方法，其特征在于，所述外源报告基因 为红色荧光标记基因、红色荧光蛋白标记基因、绿色荧光蛋白基因、或蓝色荧光标记基因中 的任意一种。
9. 水稻工程保持系在水稻育种中的应用，其特征在于，所述水稻工程保持系由如权利 要求1至8任一所述的方法获得。
【专利摘要】本发明公开了一种水稻工程保持系的构建方法，包括：步骤一、将外源报告基因定点整合到野生型水稻的染色体上得到含有外源报告基因的转基因株系，其中，该外源报告基因与野生型育性调控基因能够紧密连锁遗传；以及，之后进入步骤二，步骤二、将步骤一中得到的转基因株系与纯合隐性水稻普通雄性核不育株系杂交，筛选含有外源报告基因的株系即为所需要的水稻工程保持系，其中，该纯合隐性水稻普通雄性核不育株系为育性调控基因突变体株系。本发明还公开了水稻工程保持系在水稻育种中的应用。本发明将外源报告基因定点整合到野生型水稻的染色体上，解决了转化受体材料受限制的问题。本发明的水稻工程保持系可用于水稻普通隐性雄性核不育系繁殖中。
【IPC分类】A01H1-02, C12N15-82, A01H5-00, C12N15-65
【公开号】CN104846009
【申请号】CN201510253259
【发明人】宋书锋, 李新奇, 李莉, 张大兵, 符习勤, 袁定阳, 袁隆平
【申请人】湖南杂交水稻研究中心
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年5月18日