一种以油脂为原料生产甲羟戊酸的方法及其构建的基因工程菌的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种以油脂为原料生产甲羟戊酸的方法及其构建的基因工程菌，是在敲除phaC1基因的真养产碱杆菌中导入外源羟甲基戊二酸单酰辅酶A合成酶基因和羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因。该菌株以油脂为底物发酵生产甲羟戊酸，具有转化率较高的优点，有效的降低了生产成本，该方法为甲羟戊酸生物合成的工业化应用打下了坚实的基础。
【专利说明】一种以油脂为原料生产甲羟戊酸的方法及其构建的基因工程菌
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种经过遗传修饰的真养产碱杆菌，以及利用真养产碱杆菌发酵生产甲羟戊酸的方法。
【背景技术】
[0002]甲羟戊酸代谢途径广泛存在于多种生物中，甲羟戊酸是甲羟戊酸代谢途径中一个重要的中间代谢物，可作为前体进一步合成多种具有重要生理功能的类异戊二烯化合物如异戊二烯、类胡萝卜素，辅酶Q10，青蒿素，紫杉醇等。
[0003]作为类异戊二烯化合物的前体化合物，甲羟戊酸具备越来越重要的商业价值，目前可以通过微生物发酵法来生产甲羟戊酸。如可以在工程菌中表达甲羟戊酸代谢途径的重组酶来实现甲轻戍酸的发酵(Tabata et al., 2004BiotechnologyLetters, 26:1487-1491 ；Piteta et al., 2007Metabolic Engineering, 9:193-207),尽管上述研究利用不同的工程菌和不同的重组酶进行甲羟戊酸及其下游衍生物的发酵，但是均有一个共同点，就是以糖为原料进行发酵。从理论上来讲1.5分子的糖生成3分子的乙酰辅酶a，再生成I分子的甲羟戊酸，该过程中每生产I分子甲羟戊酸就损失3个碳原子，因此理论质量转化率只有52%。而在实际生物发酵的过程中糖至甲羟戊酸的转化率要低于这个理论值，因此以糖为原料进行甲羟戊酸发酵的转化率较低，限制了其商业化应用。
【发明内容】
[0004]本发明提供了一种经过遗传修饰的真养产碱杆菌，降低真养产碱杆菌将油脂类底物合成PHA的能力，提高油脂类底物经乙酰辅酶A至甲羟戊酸的碳代谢流比率。
[0005]所述降低真养产碱`杆菌将油脂类底物合成PHA的能力是通过敲除phaCl基因实现的。
[0006]具体而言，所述经过遗传修饰的真养产碱杆菌，是在敲除phaCl基因的真养产碱杆菌中导入外源羟甲基戊二酸单酰辅酶A (HMG-CoA)合成酶基因和羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因。
[0007]优选地,幾肠球菌(Enterococcus faecalis)轻甲基戍二酸单酸辅酶A (HMG-CoA)合成酶基因和羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因的全长序列信息已经公开。(Tabata etal.,2004Biotechnology Letters, 26:1487-1491)
[0008]所述羟甲基戊二酸单酰辅酶A合成酶基因和羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因来自于Enterococcus菌属，为原核苷酸序列或在原序列中引入一处或多处改变以适应在真养产碱杆菌中表达的需要。
[0009]所述真养产碱杆菌优选真养产碱杆菌Ralstonia eutropha H16(来自德国微生物菌种保藏中心，编号DSM428 )。
[0010]本发明还提供了一种经过遗传修饰真养产碱杆菌的构建方法，是在敲除phaCl基因的真养产碱杆菌中导入外源羟甲基戊二酸单酰辅酶A (HMG-CoA)合成酶基因和羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因。
[0011]更进一步，经过遗传修饰真养产碱杆菌的构建方法:
[0012]I)敲除真养产碱杆菌基因组上的phaCl基因(PHA合成酶基因)；
[0013]2)以质粒pBBRMCS-2为出发质粒构建穿梭质粒，将用于合成甲羟戊酸的羟甲基戊二酸单酰辅酶A (HMG-CoA)合成酶基因和羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因引入穿梭质粒;
[0014]3)将步骤2)构建的穿梭质粒导入步骤I)经过遗传修饰的真养产碱杆菌得到重组菌。
[0015]优选地，经过遗传修饰真养产碱杆菌的构建方法:
[0016]I)从野生型真养产碱杆菌H16出发，通过基因敲除技术敲除其基因组上的phaCl基因(PHA合成酶基因)，降低其利用油脂类碳源合成PHA的能力。
[0017]2)以质粒pBBRMCS-2为出发质粒构建穿梭质粒，将用于合成甲羟戊酸的羟甲基戊二酸单酰辅酶A (HMG-CoA)合成酶基因和羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因引入穿梭质粒并导入大肠杆菌S17-1 ；
[0018]3)通过转导将穿梭质粒导入遗传修饰的真养产碱杆菌。
[0019]本发明还提供了一种利用经过遗传修饰真养产碱杆菌发酵生产甲羟戊酸的方法，技术方案如下:
[0020]I)敲除真养产碱杆菌基因组上的phaCl基因(PHA合成酶基因)；
[0021]2)以质粒pBBRMCS-2为出发质粒构建穿梭质粒，将用于合成甲羟戊酸的羟甲基戊二酸单酰辅酶A (HMG-CoA)合成酶基因和羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因引入穿梭质粒;
[0022]3)将步骤2)构建的穿梭质粒导入步骤I)经过遗传修饰的真养产碱杆菌得到重组菌；
[0023]4)利用步骤4)得到的重组菌以油脂为原料发酵生产甲羟戊酸。
[0024]更进一步，本发明还提供了一种以甲羟戊酸为中间产物，生产目的产物的方法。是在高产甲羟戊酸的基础上，进一步利用甲羟戊酸发酵生产目的产物异戊二烯以及异戊二烯基单元合成的萜类化合物。
[0025]本发明要解决的问题是通过构建遗传修饰的真养产碱杆菌使之适用于将油脂类底物发酵转化为甲羟戊酸，遗传修饰后的真养产碱杆菌降低将油脂类底物合成PHA的能力，提高油脂类底物经乙酰辅酶A至甲羟戊酸的碳代谢流比率。目前未有研究报导利用工程真养产碱杆菌发酵甲羟戊酸的报导，也未有研究利用工程菌以油脂为底物发酵甲羟戊酸的报导。
[0026]由于遗传修饰后的真养产碱杆菌能够以油脂类底物为原料发酵生产甲羟戊酸，其转化率要高于现有的以糖为原料转化甲羟戊酸的常见发酵方法，使得整体的生产成本得到降低，经济性得到提高。
[0027]本发明中的工程真养产碱杆菌能够高效的转化油脂类底物生成甲羟戊酸，该转化过程在温和的条件下(30_37°C)进行，且由底物至甲羟戊酸的转化率较高，有效的降低了生产成本，该方法为甲羟戊酸生物合成的工业化应用打下了坚实的基础。【具体实施方式】
[0028]实施例1:针对真养产碱杆菌H16基因组的遗传修饰，即phaCl基因的敲除。
[0029]phaCl基因的敲除。真养产碱杆菌Ralstonia eutropha H16 (来自德国微生物菌种保藏中心，编号DSM428)被用作基本菌株来进一步进行遗传修饰。根据已经公布的真养产碱杆菌Ralstonia eutropha H16基因组信息(NCBI登陆号:NC_008313.1),找到phaCl基因(NCBI登陆号为NC_008313.1基因组中Locus tag编号:H16_A1437)上下游各500个碱基的基因序列合并为I千个碱基的序列，根据序列信息化学合成约I千碱基的线性DNA片段(SEQ ID N0.1)，序列两端含有15bp和质粒pJQ200mpl8Km相同的同源臂。利用 In-Fusion HD 试剂盒(Takara,货号 639648)将通用自杀质粒 pJQ200mpl8Km (York etal., 2001Journal of Bacteriology 183:2394,麻省理工学院 Sinskey 实验室提供)和合成的线性DNA片段重组为新质粒pGY46，将pGY46通过传统的热激转化法转入大肠杆菌S17-1(来自德国微生物菌种保藏中心，编号DSM9079)。而后通过细菌转导的方式将pGY46通过大肠杆菌S17-1导入Ralstonia eutropha H16进行phaCl基因敲除，该操作步骤和使用自杀质粒进行基因敲除的标准方法一致(Lindenkamp et al., 2012Applied and EnvironmentalMicrobiology, 78:5375)。
[0030]实施例2:含外源羟甲基戊二酸单酰辅酶A (HMG-CoA)合成酶基因和羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因的表达载体的和工程真养产碱杆菌的构建。
[0031]根据已经公布的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)轻甲基戍二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)合成酶基因和羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因的全长序列信息(Tabata etal., 2004Biotechnology Letters, 26:1487-1491),对两个序列进行优化使之适用于在真养产碱杆菌中进行表达，优化后的序列为mvaZl。根据mvaZl进行化学合成，合成时分别在序列的两端分别加上15bp和质粒pBBRlMCS-2相同的同源臂序列。然后利用In-Fusion HD试剂盒(Takara，货号639648)重组mvaZl片段和通用表达质粒pBBRlMCS_2 (荷兰菌种保藏中心，编号NCCB3434)的部分`序列(不含IacZ基因的序列)，重组为新表达载体pBBR-mvaRZ(SEQ ID N0.2)。
[0032]将表达载体pBBR-mvaRZ通过传统的热激转化法转入大肠杆菌S17-1。而后通过细菌转导的方式将表达载体pBBR-mvaRZ通过大肠杆菌S17-1导入遗传修饰过的真养产碱杆菌(敲除phaCl基因)来构建产甲羟戊酸的工程真养产碱杆菌。
[0033]实施例3:利用构建的工程真养产碱杆菌以植物油如花生油或橄榄油为碳源发酵生产甲羟戊酸。
[0034]使用工程真养产碱杆菌以植物油(花生油或橄榄油)为碳源发酵生产甲羟戊酸。使用该菌株发酵甲羟戊酸的条件为:在500毫升摇瓶体系中使用100毫升装液量，接种量5%，发酵温度30°C，pH值控制在6.8，培养基组分见表1，初始植物油添加量为10克/升(花生油或橄榄油)，搅拌速度为300至600rpm，溶氧控制在20%至40%，发酵96小时后，以不同植物油为碳源发酵甲羟戊酸的产量见表2。
[0035]表1工程真养产碱杆菌发酵培养基组分表
[0036]
【权利要求】
1.一种产甲羟戊酸的真养产碱杆菌，是降低真养产碱杆菌将油脂类底物合成PHA的能力，提高油脂类底物经乙酰辅酶A至甲羟戊酸的碳代谢流比率。
2.如权利要求1所述真养产碱杆菌，其特征在于，是在敲除PhaCl基因的真养产碱杆菌中导入外源羟甲基戊二酸单酰辅酶A合成酶基因和羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因。
3.如权利要求1所述真养产碱杆菌，其特征在于，所述真养产碱杆菌为真养产碱杆菌Ralstonia eutropha H16,所述轻甲基戍二酸单酰辅酶A合成酶基因和轻甲基戍二酸单酰辅酶A还原酶基因来自于Enterococcus菌属，为原核苷酸序列或在原序列中引入一处或多处改变以适应在真养产碱杆菌中表达的需要。
4.如权利要求3所述真养产碱杆菌，其特征在于，所述羟甲基戊二酸单酰辅酶A合成酶基因和羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因来自粪肠球菌。
5.权利要求1所述真养产碱杆菌用于发酵生产甲羟戊酸。
6.如权利要求5所述方法，其特征在于，步骤如下: I)敲除真养产碱杆菌基因组上的PhaCl基因； 2 )将羟甲基戊二酸单酰辅酶A合成酶基因和羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因引入穿梭质粒； 3)将步骤2)构建的穿梭质粒导入步骤I)经过步骤I)遗传修饰的真养产碱杆菌得到重组菌； 4)步骤3)得到的重组菌利用油脂发酵生产甲羟戊酸。
7.如权利要求6所述方法，其特征在于，所述羟甲基戊二酸单酰辅酶A合成酶基因和羟甲基戍二酸单酰辅酶A还原酶基因来自于Enterococcus菌属，为原基因序列或在原序列中引入一处或多处突变以适应在真养产碱杆菌中表达的需要。
8.如权利要求7所述方法，其特征在于，所述真养产碱杆菌为真养产碱杆菌RalstoniaeutrophaH16。
9.如权利要求6所述方法，其特征在于，具体步骤如下: 1)根据已经公布的真养产碱杆菌Ralstoniaeutropha H16基因组信息，找到phaCl基因上下游各500个碱基的基因序列合并为I千个碱基的序列，根据序列信息化学合成约I千碱基的线性DNA片段如SEQ ID N0.1所示，序列两端含有15bp和质粒pJQ200mpl8Km相同的同源臂；将通用质粒pJQ200mpl8Km和合成的线性DNA片段重组为新质粒pGY46，将pGY46通过传统的热激转化法转入大肠杆菌S17-1，而后通过细菌转导的方式将pGY46通过大肠杆菌 S17-1 导入 Ralstonia eutropha H16 进行 phaCl 基因敲除； 2)根据已经公布的粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)轻甲基戍二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)合成酶基因和羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因的全长序列信息，对两个序列进行优化使之适用于在真养产碱杆菌中进行表达，优化后的序列为mvaZl ;根据mvaZl进行化学合成，合成时分别在序列的两端分别加上15bp和质粒pBBRlMCS-2相同的同源臂序列；将重组mvaZl片段和通用表达质粒pBBRlMCS-2不含IacZ基因的序列重组为新表达载体pBBR-mvaRZ，重组载体pBBR-mvaRZ核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示； 3)将表达载体pBBR-mvaRZ通过传统的热激转化法转入大肠杆菌S17-1，而后通过细菌转导的方式将表达载体pBBR-mvaRZ通过大肠杆菌S17-1导入遗传修饰过的真养产碱杆菌来构建产甲羟戊酸的工程真养产碱杆菌；4)利用步骤3)得到的重组菌以油脂为原料发酵生产甲羟戊酸。
10.权利要 求5所述方法在发酵生产以甲羟戊酸为中间代谢产物产品中的应用。
【文档编号】C12R1/01GK103602626SQ201310473745
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年10月12日 优先权日:2013年10月12日
【发明者】咸漠, 邹慧斌, 程涛, 徐鑫 申请人:中国科学院青岛生物能源与过程研究所