一种优化的耐高温甘露聚糖酶MAN5gy及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种优化的耐高温甘露聚糖酶MAN5gy及其制备方法和应用。本发明突变了来源于黑曲霉的甘露聚糖酶MAN5gy，获得的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，且本发明提供了编码上述阿拉甘露聚糖酶的编码基因man5gy。本发明突变后的甘露聚糖酶的具有以下性质：最适pH4.0，最适温度65℃。所述甘露聚糖酶适用于饲料工业，可与木聚糖酶协同作用，有效消除或降低因粘度增加而引起的抗营养作用。在石油及天然气开采业中，甘露聚糖酶能够很好的降解半乳甘露聚糖，继而增强石油或天然气流动的流速。由于在石油开采过程中的温度较高(>80℃)，所以高温的甘露聚糖酶能够很好的发挥作用。
【专利说明】—种优化的耐高温甘露聚糖酶MAN5gy及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程与酶工程领域，具体涉及一种优化的耐高温甘露聚糖酶MAN5gy及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]甘露聚糖和木聚糖是半纤维素中最重要的两种多糖，在软木和一些特殊组织如果实和种子中甘露聚糖占据主导地位。甘露聚糖是以β-1，4-甘露糖甘键键聚合而成的线状多糖。依据主链组成的不同可以分为两大类:线状甘露聚糖和葡甘露聚糖。甘露聚糖酶(EC3.2.1.78)是一类催化水解β -1, 4-甘露聚糖苷键的内切水解酶，作用底物比较广泛，属于半纤维素酶类。
[0003]甘露聚糖酶的来源比较广泛，植物中的甘露聚糖酶存在于种子和果实等储藏器官中；在一些低等动物如海洋软体动物:滨螺、亮大蜗牛和淡菜等动物中也发现含有甘露聚糖酶；微生物来源的甘露聚糖酶最多，其中细菌、真菌、放线菌等都是其主要的来源，到目前为止，发现产甘露聚糖酶的微生物已经近百余种，它们中绝大多数微生物生活在水环境或土壤里，也有一些微生物分布在反刍动物的瘤胃里。微生物来源的甘露聚糖酶具有高活性、方便提取，且随着微生物工程和基因工程的发展，甘露聚糖酶在食品、饲料、药品、造纸及石油和天然气开采等行业中得到了广泛应用。
[0004]在饲料行业中，甘露聚糖酶的添加主要作用是降低食糜粘度，提高动物对饲料的利用率等。主要因为β_甘露聚糖在豆柏等常用的植物蛋白原料中的含量比其它的常用饲料都高，作为一种抗营养因子β_甘露聚糖在动物的消化道内形成凝胶状，使消化道内容物具有较强的黏性，从而影响动物的营养吸收。甘露聚糖酶在饲料行业应用的一个关键问题需要有较好耐高温特性`，饲料制粒时需要在高温环境下进行，不耐高温的甘露聚糖酶酶的活性将受到较大损失。目前许多研究者从不同的方面对甘露聚糖酶的耐热性进行了研究，如通过筛选产耐热植酸酶的菌株、运用蛋白质工程等现代分子生物学方法等方法来获得耐高温甘露聚糖酶，效果不是很理想。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种通过定点突变得到的优化的耐高温甘露聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示，本发明通过定点突变甘露聚糖酶氨基酸序列来提高其热稳定性，本发明的另一目的是提供编码上述突变的耐高温甘露聚糖酶的基因和优化后的编码基因。
[0006]本发明还提供了包含上述突变得到耐高温甘露聚糖酶姻ASkF的重组载体，优选为pPICZaA-MAN5gy。将突变得到的耐高温甘露聚糖酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的甘露聚糖酶基因插入到质粒pPICZa A上的I和I限制性酶切位点之间，得到重组酵母表达质粒pPICZaA-MAN5gy。
[0007]本发明还提供了包含上述耐高温甘露聚糖酶姻ASkF的重组菌株，所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌，优选为重组菌株pPICZa A /man5gy。[0008]本发明还提供了一种制备耐高温甘露聚糖酶MAN5gy的方法，包括以下步骤:
1)用含有甘露聚糖酶MAN5gy的编码基因的重组载体转化宿主细胞，得重组菌
株;
2)培养重组菌株，诱导重组甘露聚糖酶表达；
3)回收并纯化所表达的甘露聚糖酶MAN5gy。
[0009]本发明的另一目的提供上述耐高温甘露聚糖酶MAN5gy在制备饲料添加剂中的应用。
[0010]所述饲料为玉米-豆柏型日粮、小麦-豆柏型日粮、杂粮杂柏型日粮。
[0011]与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是:本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术中的不足，通过定点突变提供一种具有耐高温特性的、适合于在饲料、石油及天然气开采工业中应用新的甘露聚糖酶。
[0012]本发明通过定点突变黑曲霉甘露聚糖酶氨基酸序列，来提高甘露聚糖酶的热稳定性，并在不改变氨基酸情况下按照毕赤酵母密码子偏好性改造其基因，以获得甘露聚糖酶突变体的高效表达。本发明得到了突变后的黑曲霉来源的甘露聚糖酶MAN5gy，具有以下性质:最适温度65°C，50°C _75°C之间仍具有80%以上的酶活性，具有较高的酶活，具有良好的热稳定性，90°C处理10 min还可保持40%以上最大酶活力；最适pH4.0，并在pH3.0~
5.5范围内具有70%以上的酶活力，具有很好的宽泛的pH稳定性，37°C下作用I h后，在pH
2.0~6.5之间,最大酶活力几乎不变。
[0013]本发明所述甘露聚糖酶耐高温特性较好，可使其在需求高温环境的工业如饲料制粒上应用。所述甘露聚糖酶适用于饲料工业，可与木聚糖酶协同作用，有效消除或降低因粘度增加而引起的抗营养作用。在石油及天然气开采业中，甘露聚糖酶能够很好的降解半乳甘露聚糖，继而增强石油或天然气流动的流速。由于在石油开采过程中的温度较高(>80°c )，所以高温的甘露聚糖酶能够很好的发挥作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1是本发明重组甘露聚糖酶的结构图。
[0015]图2是本发明重组甘露聚糖酶的蛋白电泳图。
[0016]图3是本发明重组甘露聚糖酶的最适温度。
[0017]图4是本发明重组甘露聚糖酶的热稳定性。
[0018]图5是本发明重组甘露聚糖酶的最适pH。
[0019]图6是本发明重组甘露聚糖酶的pH稳定性。
【具体实施方式】
[0020]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明的技术方案作进一步详细的说明
以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J-萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。[0021]实施例1、黑曲霉甘露聚糖酶蛋白质突变体基因的获得
1、选择黑曲霉niger中的甘露聚糖酶氨基酸序列，如SEQ ID N0.1所示。
[0022]SEQ ID N0.1:
【权利要求】
1.一种优化的耐高温甘露聚糖酶MAN5gy，其特征在于:其氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
2.根据权利要求1所述的耐高温甘露聚糖酶MAN5gy，其特征在于，所述甘露聚糖酶在PH3.0~5.5有较高的酶活性，在50°C _75°C之间具有较高的酶活。
3.根据权利要求2所述的耐高温甘露聚糖酶MAN5gy，其特征在于，所述甘露聚糖酶的最适温度65°C,最适pH为4.0。
4.权利要求1所述的耐高温甘露聚糖酶MAN5gy的编码基因man5gy,其特征在于,其核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
5.权利要求1所述的耐高温甘露聚糖酶MAN5gy的优化的编码基因man5gy,其特征在于，其碱基序列如SEQ ID N0.5所示。
6.包含权利要求4或5所述编码基因man5gy的重组载体。
7.根据权利要求6所述的含有编码基因man5gy的重组载体，其特征在于，所述重组载体为 pPICZ a A- man5gy。
8.一种根据权利要求1所述的优化的耐高温甘露聚糖酶MAN5gy的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)用含有甘露聚糖酶MAN5gy的编码基因man5gy的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株; 2)培养重组菌株，诱导重`组甘露聚糖酶的表达； 3)回收并纯化所表达的耐高温甘露聚糖酶MAN5gy。
9.权利要求1所述的耐高温甘露聚糖酶MAN5gy在制备饲料添加剂中的应用。
10.根据权利要求9所述的耐高温甘露聚糖酶MAN5gy在制备饲料添加剂中的应用，其特征在于所述饲料为玉米-豆柏型日粮、小麦-豆柏型日粮、杂粮杂柏型日粮。
【文档编号】C12N9/42GK103525790SQ201310473865
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月12日 优先权日:2013年10月12日
【发明者】张大伟, 杜彦龙 申请人:青岛根源生物技术集团有限公司