一种耐有机溶剂半乳糖苷酶高产菌以及该半乳糖苷酶的基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种耐有机溶剂半乳糖苷酶高产菌，其耐有机溶剂半乳糖苷酶，以及 一种以乳糖为供体酶法半乳糖基化核苷类化合物的方法，属于生物制药技术领域。 技术背景
[0002] 叠氮胸苷、阿昔洛韦等核苷类药物是一类重要的抗肿瘤、抗病毒药物，广泛应用于 临床治疗各种癌症。叠氮胸苷是第一个抗HIV病毒药物，阿昔洛韦则是目前临床上最有效 的抗I型和II型单纯疱瘆病毒之一，对急性视网膜坏死水痘带状疱瘆病毒和EB病毒等其 他疱瘆病毒也有疗效。然而，叠氮胸苷由于高血浆浓度而引发较强的毒副作用，阿昔洛韦则 会对血液系统、神经系统、消化系统等具有一定的毒副作用。为了获得最佳治疗效果和较小 毒副作用，可以对叠氮胸苷等核苷类药物进行糖基化修饰。糖基化是一类重要的改性修饰 反应，不仅会改变化合物的生物活性、水溶性、稳定性、在细胞内的运输特性、亚细胞定位以 及特异性传递等特性，另外还能降低化合物的毒性。研宄表明（Abram R.，Aman N.，von Borstel R.，Cell Biophysics, 1994，24-25 (I) :127-133) 5-氟尿苷的半乳糖衍 生物（5' -半乳糖基-5-氟尿苷）的毒副作用比母药5-氟尿苷低100倍。Bonina等 (Bonina, F. , Puglia, C. ; Rimoli, M. G. ; Aval lone, L. , Abignente, E. ; Boatto, G. ; Nieddu, Μ. ; Meli, R. ; Amorena Μ. ; de Caprariis, Ρ. Eur. J. Pharm. Sci., 2002，16(3): 167-174)也报道了叠氮胸苷的半乳糖基衍生物不仅可以降低叠氮胸苷的血 浆浓度，而且可以保持有效浓度更长时间，避免频繁给药。
[0003] 目前，核苷糖基化衍生物主要通过化学法合成，但由于两底物中均存在多个活 性羟基或氨基，化学法的选择性并不理想，所以二糖核苷的合成需要多步的保护/脱保 护步骤，工艺非常复杂。而酶法糖基化一般只需一步反应，反应条件温和，具有很高的 区域选择性和化学选择性。然而，有关用糖苷酶催化核苷糖基化反应的报道并不多。 Binder 等(Binder ff.H. , Kiihlig Η. , Schmid ff. Tetrahedron:Asymmetry, 1995, 6(7):1703-1710)利用来源于米曲霉的β-半乳糖苷酶通过转糖基反应催化底物对硝基 苯基-β-D-半乳糖苷（/7NPG)和四种天然核苷（2' -脱氧尿苷、尿苷、胸苷和腺苷）合成 了一系列含半乳糖基的二糖核苷衍生物，但收率仅为3-7 %，区域选择性很差。Andreotti 等（Andreotti G. , Trincone A. , Giordano A. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2007，47(1-2) :8-32)利用来源于海洋软体动物黑指纹海兔胰腺的β-半乳 糖苷酶，以邻硝基苯基-β-D-半乳糖苷（〇NPG)为糖基供体，催化叠氮胸苷半乳糖基化生成 5'-仏β-半乳糖基-叠氮胸苷，产率达到了 43 %，但其对底物的转化率仅为21. 5 %。颜丽 强等人（Yan L Q, Li Ν, Zong M Η. Journal of Biotechnology, 2012，164(2):371-375) 利用牛肝β-半乳糖苷酶以oNPG为供体进行了阿昔洛韦等无环核苷的半乳糖基化反应，但 是对底物的转化率仅有13 %，而且底物浓度仅为0.01 M。
[0004] 虽然说在过去几年中生物法糖基化修饰核苷类药物取得了一定的突破与进展，但 仍存在一些问题亟需解决。目前酶法糖基化修饰核苷类药物的糖基供体主要是oNPG或者 是/7NPG，这些相比较于寡糖来说，其价格昂贵，实际的应用价值较低。而通常的酶法催化在 水中进行，而要修饰阿昔洛韦等不溶于水或者难溶于水的化合物时，低产率及低转化率也 成为糖基化修饰的另一瓶颈。近年来不断发展的非水相催化可以很好的克服底物水溶性差 的问题，还可以对产物进行一定程度的调控，如果再以寡糖为糖基供体，将能很好地克服目 前生物法糖基化修饰核苷类药物存在的问题。因此，筛选以寡糖为糖基供体在非水相中糖 基化修饰核苷类药物的半乳糖苷酶具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的针对目前糖基化修饰核苷类药物存在的糖基供体价格昂贵、糖基化 反应转化前底物浓度低、产物摩尔转化率也较低等问题，提供一种有机溶剂耐受性好、以乳 糖为糖基供体的β -半乳糖苷酶及其产生菌，含有编码该酶基因的重组表达载体、重组表 达转化体及其高效制备方法，以及一种以乳糖为供体酶法半乳糖基化核苷类化合物的方 法。
[0006] 为了实现本发明的目的，本发明首先从本实验室耐有机溶剂菌库中筛选获得一株 耐有机溶剂β -半乳糖苷酶产生菌，分类命名为干酪乳杆菌YZ09(L3cic^aciT7w5· casei YZ09)，其保藏编号为 CCTCC :M 2014540。
[0007] 本发明对干酪乳杆菌casei YZ09的生物学特征进行鉴定，该菌株 为革兰氏阳性菌株，无芽孢的杆菌，兼性厌氧，最适生长温度为30~40°C。其生理生化特性 表现在：过氧化氢酶反应结果为阴性，明胶反应结果为阴性，无运动，氧化葡萄糖产酸，可利 用乳糖、蔗糖、山梨醇、木糖、果糖、麦芽糖、甘露醇等。
[0008] 经16S rDNA序列分析，该菌株鉴定为ZacioAaciBw1S casei。
[0009] 本发明对该耐有机溶剂半乳糖苷酶产生菌YZ09进行了产酶优化，优化后产酶量 达到了 6. 58 U/mL 本发明分离克隆到c<asi?iYZ09菌株所产耐有机溶剂半乳糖苷酶GAL的 编码基因，它具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，为此基因的改造并在各种外源基因表达 系统中高效表达提供了优良的基因材料。通过PCR法分离克隆了这一耐有机溶剂半乳糖苷 酶GAL基因，DNA全序列分析结果表明，该耐有机溶剂糖苷酶GAL基因全长1797个核苷酸， 编码598个氨基酸。
[0010] 本发明构建了耐有机溶剂半乳糖苷酶GAL基因的表达载体。它可以通过本领域常 规方法将本发明所述基因连接于各种载体上构建而成。所述的载体可为本领域常规的各种 载体，如市售的质粒、粘粒、菌体或病毒载体等，优选pET28a。较佳的，可通过下述方法制 得本发明的重组表达载体：将通过PCR扩增所得的产物用限制性内切酶BamH I和Sal I 进行双酶切，形成互补的粘性末端，同时将载体pET28a用限制性内切酶BamH I和Sal I 双酶切，经T4 DNA连接酶连接，形成含有本发明的β-半乳糖苷酶基因的重组表达载体 ρΕ?-galo
[0011] 本发明将上述重组表达载体转化至宿主细胞制得重组表达转化体。所述的宿主可 为本领域常规的各种宿主，只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制，且所携带的本发 明的β-半乳糖苷酶基因可被有效表发即可。本发明优选大肠杆菌，更优选大肠埃希氏菌 (万.co7i) JM109 (DE3)。将前述重组表达质粒pET-^a7转化至（万.co7i) JM109 (DE3)中， 即可得本发明优选的基因工程菌株，即大肠埃希氏菌（万.cWi) JM109 (DE3)/pET-辟人
[0012] 本发明还提供一种重组β-半乳糖苷酶的制备方法，其包括如下步骤：培养本发 明前述的重组表达转化体，获得重组表达的β_半乳糖苷酶。其中，所述的培养重组表达 转化体中所用的培养基可为本领域常规的任何可使转化体生长并产生本发明的β-半乳 糖苷酶的培养基，优选LB培养基：蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L，pH7. 0。培 养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域 普通知识进行适当的选择，只要是转化体能够生长并产生本发明所述的β -半乳糖苷酶即 可。其他培养转化体的具体操作均可按本领域常规操作进行，优选下述方法：将本发明涉及 的重组大肠杆菌JM109 (DE3) /pET-gW接种至含卡那霉素的LB培养基中培养，当培养液的 光密度〇D_达到0. 6-1. 0时，在终浓度为0. 1-1. 0 mmol/L的异丙基-β -D-硫代吡喃半乳 糖苷（IPTG)的诱导下，高效表达本发明的重组β-半乳糖苷酶。
[0013] 本发明中催化乳糖和核苷类药物转糖基得到半乳糖基核苷类衍生物的催化剂，可 以是上述产生的重组β -半乳糖苷酶的转化体的培养物，也可以是通过将培养基离心分离 后得到的转化体细胞。
[0014] 另一方面，本发明提供一种以乳糖为供体酶法半乳糖基化核苷类化合物的方法。 该方法包括将具有本发明半乳糖基化酶活力的物质加入含有核苷类化合物的转化夜中，进 行生物转化反应，使核苷类化合物转化为半乳糖基核苷类衍生物，所述转化液中含有核苷 类化合物和糖基供体，所述核苷类化合物为叠氮胸苷、阿昔洛韦，所述糖基供体为乳糖。
[0015] 优选地，所述具有半乳糖基化酶活力物质包括具有半乳糖基化酶活力的发酵液、 发酵液上清、纯化的半乳糖基化酶和半乳糖基化酶重组表达蛋白。
[0016] 优选地，所述半乳糖基化酶为半乳糖苷酶，更优选地，所述半乳糖苷酶为 本发明中菌株ΥΖ09所产β-半乳糖苷酶或其重组表达蛋白。
[0017] 优选地，所述反应在非水