专利名称：从流感疫苗制剂中去除内毒素的方法
技术领域：
本发明涉及重组蛋白质药物的生产过程，特别提供了一种从流感疫苗制剂中去除内毒素的方法。
背景技术：
随着基因工程技术的日益成熟，越来越多的重组蛋白质药物被开发利用。由于生产过程中涉及到革兰氏阴性的大肠杆菌以及分离纯化过程复杂，因此会造成内毒素的污染。
亲和技术是分离纯化生物大分子的有效手段，主要利用配基与生物大分子之间的亲和作用原理。将配基通过化学键共价键合到多孔介质上就得到亲和介质，可以用来选择性地吸附内毒素，实现从重组蛋白质溶液中去除内毒素的目标。已有的亲和配基和亲和介质包括单克隆抗体，多克隆抗体，抗生素，多粘菌素B，聚乙烯亚胺，组氨酸，凝胶过滤柱，亲和膜，颗粒吸附剂等。如专利EP0800862，采用含有磺酸基的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，利用离子交换的原理，来去除重组蛋白质肿瘤坏死因子或白介素中的内毒素，主要吸附重组蛋白质。
专利EP0337243，使用串联的两只反相液相色谱柱，来纯化重组人IL-2。在纯化重组人白介素-2的同时，去除内毒素杂质，流速低，介质昂贵。
专利US4885168，采用低分子量壳聚糖，利用壳聚糖上带正电荷的氨基来与带负电荷的核酸与内毒素作用，达到除去核酸与内毒素的目的。但壳聚糖的利用率低。
专利00123290.6，魏桂林等的一种用于内毒素去除的疏水荷正电亲和膜，将胺类疏水荷正电亲和配基键合到纤维素膜上，得到相应的亲和膜。胺类疏水荷正电亲和配基包括2～12碳的烃基二胺、带有乙烯基的不饱和杂环化合物、带有环氧基团的季铵盐及带有多个疏水基团的季铵盐。
D.Petsch，T.C.Beeskow等(1997，Journal of Chromatography B.693，79-91.)采用去氧胆酸钠，或己二胺作为亲和配基，以微孔尼龙膜为介质，制成亲和膜。采用单张亲和膜，可以去除缓冲液或牛血清白蛋白中的内毒素。但流速低，阻力高，处理量少，不易放大。
由于重组蛋白质种类较多，其分离纯化步骤各不相同，生产过程中对其中的内毒素含量要求也有差异，因此去除内毒素的方法和效果无法完全通用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从流感疫苗制剂中去除内毒素的方法，用该方法可以达到既去除内毒素，又尽可能减少流感疫苗活性损失的目的。
本发明提供了一种从流感疫苗制剂中去除内毒素的方法，以亲和介质装填成层析柱或膜过滤器，以静态吸附或过滤的方式去除流感疫苗制剂中的内毒素，其特征在于所述亲和介质为聚丙烯。
本发明从流感疫苗制剂中去除内毒素的方法中，亲和介质可以为聚丙烯丝，直径为0.13微米-40微米。
本发明从流感疫苗制剂中去除内毒素的方法中，亲和介质也可以为由聚丙烯丝构成的膜片，膜的密度为20g/m2-90g/m2。
本发明从流感疫苗制剂中去除内毒素的方法中，可以用聚丙烯丝装填层析柱，装填密度为0.13g/cm3-0.5g/cm3。
本发明从流感疫苗制剂中去除内毒素的方法中，流感疫苗与聚丙烯介质的比例最好为20-200毫升/克。
本发明针对流感疫苗制剂生产过程中的内毒素，根据其分子量大小、等电点的范围、溶液中其它物质的含量和种类的需要，判断和选择了聚丙烯为亲和介质。
使用聚丙烯丝构成的膜，膜在疫苗中浸泡， 流感疫苗与聚丙烯介质的比例为20毫升/克，在8度的温度下，以200rpm的频率振荡吸附3小时，溶液中的内毒素浓度从＞8000EU/ml降低到＜150EU/ml，流感疫苗的活性成分回收率为95％以上。
使用聚丙烯丝构成的膜，组装成装填密度为0.20g/cm3的膜过滤器，流感疫苗与聚丙烯介质的比例为200毫升/克，在7度的温度下，反复过滤吸附2小时，处理后疫苗溶液的内毒素浓度从＞3000EU/ml降低到＜450EU/ml，流感疫苗的有效成分回收率为85％以上。
总之，本发明的从流感疫苗制剂中去除内毒素的方法，可以在不改变疫苗原有性质的条件下，有效地去除流感疫苗制剂生产中含有的内毒素污染物，保留疫苗中的有效成分。可以用于流感疫苗的生产过程中，提高其生产质量。
具体实施例方式实施例1.
取直径为0.13微米的聚丙烯丝构成的膜，膜的密度为20g/m2，，在8度的温度下，膜在疫苗中浸泡，流感疫苗与聚丙烯介质的比例为20毫升/克，以200rpm的频率振荡吸附3小时，溶液中的内毒素浓度从＞8000EU/ml降低到＜150EU/ml，流感疫苗的活性成分回收率为95％以上。
实施例2.
取直径为0.26微米的聚丙烯丝构成的膜，膜的密度为90g/m2，在8度的温度下，膜在疫苗中浸泡，流感疫苗与聚丙烯介质的比例为200毫升/克，以200rpm的频率振荡吸附3小时，溶液中的内毒素浓度从＞5000EU/ml降低到＜1250EU/ml，流感疫苗的活性成分回收率为80％以上。
实施例3.
取直径为40微米的聚丙烯丝，组装成层析柱，装填密度为0.5g/cm3，在8度的温度下，丝在疫苗中浸泡，流感疫苗与聚丙烯介质的比例为90毫升/克，以0.5ml/min的流速反复过滤吸附3小时，内毒素的浓度从430EU/ml降低到250EU/ml，流感疫苗的活性成分回收率为85％以上。
实施例4.
取直径为0.13微米的聚丙烯丝构成的膜，膜的密度为60g/m2，组装成膜过滤器，装填密度为0.39g/cm3，流感疫苗与聚丙烯介质的比例为200毫升/克，在7度的温度下，以1ml/min的流速反复过滤吸附2小时，处理后疫苗溶液的内毒素浓度从＞3000EU/ml降低到＜450EU/ml，流感疫苗的有效成分回收率为85％以上。
实施例5.
取直径为0.13微米的聚丙烯丝构成的膜，膜的密度为85g/m2，组装成膜过滤器的装填密度为0.13g/cm3，流感疫苗与聚丙烯介质的比例为100毫升/克，在7度的温度下，以1ml/min的流速反复过滤吸附2小时，处理后疫苗溶液的内毒素浓度从＞400EU/ml降低到＜100EU/ml，流感疫苗的有效成分回收率为53％以上。
权利要求
1.一种从流感疫苗制剂中去除内毒素的方法，以亲和介质装填成层析柱或膜过滤器，以静态吸附或过滤的方式去除流感疫苗制剂中的内毒素，其特征在于所述亲和介质为聚丙烯。
2.按照权利要求1所述从流感疫苗制剂中去除内毒素的方法，其特征在于所述亲和介质为聚丙烯丝，直径为0.13微米-40微米。
3.按照权利要求2所述从流感疫苗制剂中去除内毒素的方法，其特征在于所述介质为由聚丙烯丝构成的膜片，膜的密度为20g/m2-90g/m2。
4.按照权利要求2所述从流感疫苗制剂中去除内毒素的方法，其特征在于所述层析柱，装填密度为0.13g/cm3-0.5g/cm3。
5.按照权利要求1所述的从流感疫苗制剂中去除内毒素的方法，其特征在于流感疫苗与聚丙烯介质的比例为20-200毫升/克。
全文摘要
一种从流感疫苗制剂中去除内毒素的方法，以亲和介质装填成层析柱或膜过滤器，以静态吸附或过滤的方式去除流感疫苗制剂中的内毒素，其特征在于所述亲和介质为聚丙烯。本发明的从流感疫苗制剂中去除内毒素的方法，可以在不改变疫苗原有性质的条件下，有效地去除流感疫苗制剂生产中含有的内毒素污染物，保留疫苗中的有效成分。可以用于流感疫苗的生产过程中，提高其生产质量。
文档编号A61P31/16GK1621089SQ200310119269
公开日2005年6月1日 申请日期2003年11月26日 优先权日2003年11月26日
发明者李京华, 邵英光, 丛润滋, 王俊德 申请人:中国科学院大连化学物理研究所