Msp纳米微孔和相关方法
【专利说明】MSP纳米微孔和相关方法
[0001] 本申请是申请日为2009年9月22日、发明名称为"MSP纳米微孔和相关方法"的 中国发明专利申请200980142855. 5的分案申请。
[0002] 交叉参考相关申请
[0003] 本申请要求2008年9月22日提交的美国临时申请系列案61/098, 938的权益，所 述临时申请系列案以其全文通过引用合并入本文。
[0004] 政府许可权利的声明
[0005] 本发明是利用在由国立卫生研宄院授予的基金号5R21HG004145下的政府资助进 行的。政府在本发明中具有某些权利。
[0006] 背景
[0007] 已建立的DNA测序技术需要大量DNA和若干冗长的步骤来仅构建全长序列的数十 个碱基。然后必须以"鸟枪法"方式（非线性地依赖于基因组的大小和依赖于从其构建全 长基因组的片段的长度的工作）装配该信息。这些步骤很昂贵且费时，尤其当测定哺乳动 物基因组的序列时。
[0008] 概述
[0009] 本文中提供了包括对具有界定通道（tunnel)的前厅（vestibule)和纟益缩区 (constrictionzone)的耻垢分枝杆菌（Mycobacteriumsmegmatis)孔蛋白（Msp)孔蛋白 施加电场的方法，其中Msp孔蛋白位于第一导电液体介质与第二导电液体介质之间。
[0010] 还提供了改进通过Msp孔蛋白的通道（tunnel)的电导的方法，包括除去、添加或 置换野生型Msp孔蛋白的前厅或缢缩区中的至少一个氨基酸。
[0011] 还提供了包括具有界定通道的前厅和缢缩区的Msp孔蛋白的系统，其中所述通道 位于第一液体介质与第二液体介质之间，其中至少一种液体介质包含分析物，以及其中系 统对于检测分析物的性质是有效的。
[0012] 还提供了包括具有界定通道的前厅和缢缩区的Msp孔蛋白的系统，其中所述通道 位于第一液体介质与第二液体介质之间的脂双层中，并且其中第一与第二液体介质之间的 液体连通的唯一点存在于通道中。
[0013]还提供了突变的Msp孔蛋白。例如，提供了突变的耻垢分枝杆菌孔蛋白A(MspA)， 其包含界定通道的前厅和缢缩区，以及至少第一突变MspA单体，所述单体包含位置93上的 突变和位置90、位置91或位置90及91上的突变。还提供了突变的MspA孔蛋白，其包含 具有约2至约6nm的长度和约2至约6nm的直径的前厅，和具有约0. 3至约3nm的长度和 约0. 3至约3nm的直径的缢缩区，其中所述前厅和缢缩区一起界定了通道，以及还包含至少 第一突变MspA旁系同源物或（paralog)同系物（homolog)单体。还提供了突变MspA旁系 同源物或同系物，其包含具有约2至约6nm的长度和约2至约6nm的直径的前厅，和具有约 0. 3至约3nm的长度和约0. 3至约3nm的直径的缢缩区，其中所述前厅和缢缩区一起界定了 通道。
[0014] 描述了产生突变的Msp孔蛋白的方法。例如，本文中提供了产生突变的MspA孔蛋 白的方法，包括在位置93上和位置90、位置91或位置90及91上修饰野生型MspA单体。 还提供了产生具有界定了通道的前厅和缢缩区的突变MspA孔蛋白的方法，包括在野生型MspA旁系同源物或同系物单体的前厅或缢缩区中缺失、添加或置换任何氨基酸以便所得的 突变MspA孔蛋白能够在施加电场后将分析物转位通过通道。
[0015] 还提供了一种方法，所述方法包括在不使用电场的情况下使分析物转位通过耻垢 分枝杆菌孔蛋白（Msp)孔蛋白的通道。
[0016] 本文中提供了核酸序列。任选地，核酸序列可包含第一和第二核苷酸序列，其中所 述第一核苷酸序列编码第一Msp单体序列并且第二核苷酸序列编码第二Msp单体序列。该 核酸序列还可包含编码氨基酸连接体序列的第三核苷酸序列。任选地，该核酸序列还包含 编码第三或更多Msp单体序列的第三或更多核苷酸序列。例如，所述核酸序列还可包含第 3、第4、第5、第6、第7和第8核苷酸序列。所述第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7和第8 核苷酸序列编码第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7和第8Msp单体序列，并且该核酸序列 还包含编码氨基酸连接体序列的第9核苷酸序列。还提供了包含两个或更多个单链Msp的 Msp孔蛋白。
[0017] 还提供了由本文中所述的核酸编码的多肽。还提供了包含本文中描述的多肽的载 体。还提供了用本文中描述的任何载体转染的培养细胞或其后代，其中所述细胞能够表达Msp孔蛋白或Msp孔蛋白单体。还提供了包含本文中描述的任何载体的耻垢分枝杆菌菌株。
[0018] 还提供了能够诱导Msp单体表达的突变的细菌菌株，所述细菌菌株包含：(a)野生 型MspA的缺失；(b)野生型MspC的缺失；（c)野生型MspD的缺失；和⑷包含有效地连接 于Msp单体核酸序列的诱导型启动子的载体。
[0019] 还提供了产生单链Msp孔蛋白的方法，所述方法包括：（a)用包含能够编码单链 Msp孔蛋白的核酸序列的载体转化突变的细菌菌株；和任选地（b)从所述细菌纯化单链Msp 孔蛋白。该突变的菌株可包含野生型MspA、野生型MspB、野生型MspC和野生型MspD的缺 失，以及包含有效地连接于Msp核酸序列的诱导型启动子的载体。可用包含能够编码单链 Msp孔蛋白的核酸序列的载体转化该突变的菌株。
[0020] 还提供了使用Mps孔蛋白例如单链Msp孔蛋白的方法。例如，所述方法可包括产 生具有第一侧面和第二侧面的脂双层，向脂双层的第一侧面加入Msp孔蛋白例如纯化的单 链Msp孔蛋白，对双分子层的第二侧面施加正电位，使实验性核酸序列或多肽序列转位通 过Msp孔蛋白，测量使序列转位通过Msp孔蛋白的阻塞电流，以及将该实验性阻塞电流与阻 塞电流标准相比较，确定该实验性序列。
[0021] 附图概述
[0022] 上述方面和许多附带的有利方面将变得更容易理解，因为当与下列附图结合，参 考下列详述，上述方面和许多附带的有利方面可得到更好地理解。
[0023] 图1显示野生型MspA(WTMspA)孔蛋白的结构和电荷分布。在pH 8时，预期酸性 残基主要带负电荷并且碱性残基主要带正电荷。突变的位置和残基由箭头和标记指示。参 见Faller等人，Science，303:1189 (2004)〇
[0024]图 2 显示WTMspA、突变体D90N/D91N/D93N(MlMspA，也称为M1-NNN)和突变体 D90N/D91N/D93N/D118R/E139K/D134R(M2MspA，也称为M2-NNN)孔蛋白的通道形成活性和 单通道电导的测定结果。左图显示当MspA孔蛋白存在于水浴双分子层的溶液（1MKC1， 20°C)中时，双分子层的电导随时间的变化。电导的逐步增加被解释为MspA孔蛋白至双 分子层内的插入。右边是这些电导步长（conductancestep)的大小的直方图。WTMspA、MIMspA和M2MspA孔蛋白的直方图分别概括了来自3个重复实验的40个插入、来自3个重 复实验的144个插入和来自5个重复实验的169个插入。
[0025] 图3A和3B显示了WTMspA孔蛋白的自发阻塞行为。图3A是实验的示意图。图3B 显示在DNA不存在的情况下在60mV(左）和100mV(右）下对于WTMspA孔蛋白观察到的代 表性离子电流信号。负电流的间隔时间相应于施加的电压的反转，这通常是重建未被阻塞 的离子电流水平所需的。
[0026] 图4显示电泳凝胶中突变的MspA单体的表达。向各泳道中加入粗制提取物 (13yL)。用考马斯蓝染色凝胶。泳道1:蛋白质分子量标准；泳道2:WTMspA;泳道3:无 MspA;泳道4:突变体MIMspA;泳道5:突变体D90N/D91N/D93N/D118R;泳道6:突变体D90N/ D91N/D93N/D118R/E139R;泳道 7:突变体D90N/D91N/D93N/D118R/E139K;泳道 8:突变体 M2MspA。构建、提取和测定泳道5至7中的突变体以确保对于每一个连续氨基酸置换保持 表达和通道形成活性。凝胶上方的简图示意性显示在该实验中突变的氨基酸的大致位置和 极性。
[0027] 图5A-5C显示利用MIMspA孔蛋白进行的ssDNA发夹构建体的检测。图5A是实验 的示意图。图5B显示在180和140mV下在DNA不存在和在8yMhp08(SEQIDN0:4)发夹 DNA存在的情况下对于MIMspA孔蛋白观察到的代表性离子电流信号。图5C显示在放大的 时标（expandedtimescale)上来自图5B中的描记线的已编号的阻塞。
[0028] 图6显示MIMspA孔蛋白中来自发夹构建体的深度阻塞的特征。每一个点 的坐标给出了 1个深度阻塞的持续时间和平均电流。分别在140和180mV获得黑色 和灰色数据。对于每一个数据集，标出深度阻塞驻留时间tD的loglO模式。右边的 简图显示每一个发夹构建体的序列：hp08CGCTGTTGCTCTCTCGCAACAGCA503r ) (SEQIDN0:4)、hpl0(5 'GCTCTGTTGCTCTCTCGCAACAGAGCA5(l3 ' )(SEQIDNO:5)和 hpl2(5'GCTGTCTGTTGCTCTCTCGCAACAGACAGCA5(l-3，）（SEQIDNO:6)。
[0029] 图7是显示MIMspA孔蛋白中针对hp08(SEQIDN0:4)的部分阻塞驻留时间分布 的图。分布十分拟合单指数模式。在180mV下的部分阻塞具有约比在140mV上长3倍的时 间常数。
[0030] 图8提供了MIMspA孔蛋白中发夹构建体深度阻塞的驻留时间分布的详细外观。 左边的图框显示具有驻留时间（x)的loglO的概率分布的对数二进制图（阶梯图）和相应 核平滑密度估计的驻留时间直方图。将这些平滑的密度估计值的最大值tD用于参数化驻 留时间分布。垂直线显示tD值。右边的图框显示来源于驻留时间数据（实线）和单衰减 指数（singledecayingexponential)的存活概率曲线，时间常数设置为每一个数据组的 tD值（虚线）。数据明显偏离单指数变动形态（simpleexponentialbehavior)。然而， 进行tD值与用于其他观察的指数时间常数之间的定性比较是合理的（Kasianowicz等人， Proc.NatlAcad.Sci.USA，93:13770(1996))，因为这两个参数均反映了驻留时间分布的相 似方面。
[0031] 图9A-9G显示获自跨双层探针实验（transbilayerprobeexperiment)的数据。 图9A显示分子构型的动画（animation) : (1)未被阻塞的孔；（2)具有阻止nA-ssDNA复合 物转位的neutravidin(nA)的丝状ssDNA; (3)与nA-ssDNA杂交的革EDNA在负电压下分离； 和⑷nA-ssDNA复合物在某一电压下（依赖于靶DNA的杂交）从孔排出。图9B是外施电 压的时间序列。电流阻塞在约200ms的延迟后触发从180mV捕捉电压至40mV的维持电压的 变化。维持电压维持5秒以允许杂交，然后向负电压下降。图9C和9D各自显示表明nA-ssDNA分别在负和正电压下排出的电流时间序列。由于瞬间电压改变和在大的负电压下自 发的孔关闭，大电流尖脉冲产生。图9E-9G是排出电压（exitvoltage) (Vexit)直方图。 图9E显示一个实验，在该实验中，探针5'-C6A54-CTCTAITCTTATCTC-3'（SEQIDN0:7)与靶 ssDNA分子 5' -GAGATAAGAATAGAG-3'（SEQIDN0:9)互补。图 9F显示与图 9E中相同的孔， 但其使用不与靶0嫩互补的探针5'-(^54-04040404040404〇3'（5￡0 10吣:8)。图96显示 来自使用与图9E中的探针相同的探针（SEQIDN0:7)但在反面区室（transcompartment) 中不存在靶DNA的单独的对照的结果。只在图9E中观察到大量负Vexit事件，其中探针 (SEQIDN0:7)与靶互补。图9F和9G中负Vexit事