]PAQVSVPFMSPASAY
[0155] 中和表位PEP91氨基酸序列（SEQIDNO. :7):
[0156]YLFKTNPNYKGNDIK
[0157]HBcPEP32 氨基酸序列（SEQIDNO. :8):
[0158]MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLA TffVGNNLETMPTMGTQNTDGYANGDLVVNYVNTNVGLKIRQLLffFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVffIRTPPAYRPP NAPILSTLPETTVVRRRDRGRSPRRRTPSPRRRRSPSPRRRRSQSRESQC；
[0159]HBcPEP37氨基酸序列（SEQIDNO. :9):
[0160]MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLA TffVGNNLENffDIDLMGYAQLRRKGDLVVNYVNTNVGLKIRQLLffFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVffIRTPPAYRPP NAPILSTLPETTVVRRRDRGRSPRRRTPSPRRRRSPSPRRRRSQSRESQC
[0161]HBcPEP63氨基酸序列（SEQIDNO. : 10):
[0162]MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLA TffVGNNLEPAQVSVPFMSPASAYGDLVVNYVNTNVGLKIRQLLffFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVffIRTPPAYRPP NAPILSTLPETTVVRRRDRGRSPRRRTPSPRRRRSPSPRRRRSQSRESQC
[0163]HBcPEP91氨基酸序列（SEQIDNO. :11):
[0164]MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLA TffVGNNLEYLFKTNPNYKGNDIKGDLVVNYVNTNVGLKIRQLLffFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVffIRTPPAYRPP NAPILSTLPETTVVRRRDRGRSPRRRTPSPRRRRSPSPRRRRSQSRESQC
[0165] 在低温（18°C)和低IPTG浓度（0. 025mM)条件下诱导表达含CA16中和表位的各 融合蛋白，并用SDS-PAGE进行，结果显示，HBcPEP32,HBcPEP63和HBcPEP71在菌体可溶性 组分中有大量富集，而HBcPEP37和HBcPEP91则几乎只存在于包涵体中。
[0166] 融合蛋白的组装及表位展示
[0167] 为了鉴定融合蛋白的组装情况，对融合蛋白进行纯化并将纯化后的蛋白用HBc特 异性单抗进行WesternBlot检测，实验结果显示，各融合蛋白都组装成了颗粒形态。然后 用表位肽特异性血清做ELISA检测，实验结果，HBcPEP32,HBcPEP63和HBcPEP71可分别被 各自所展示多肽的特异性血清所识别，并且都与WesternBlot检测的结果一致。经透射电 镜分析，可清晰看到各融合蛋白形成了直径约为30nm的颗粒。这些结果证明，插入CA16中 和表位PEP32和PEP63的HBc融合蛋白都能组装成颗粒，并且将外源表位成功展示在颗粒 表面。
[0168] 免疫原性及抗血清在体外的中和活性
[0169] 用雌性ICR小鼠检测嵌合VLPs的免疫原性，实验证明，HBcPEP32和HBcPEP63VLPs 抗血清对CA16/SZ05毒株没有任何中和活性，但是对EV71/G082却有较弱的中和。
[0170] 表2.第四次免疫后各组小鼠混合血清的中和测定
[0172] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
[0173] 参考文献
[0174]I.YeX,KuZ,LiuQ,WangX,ShiJ,ZhangY,KongL,CongY,HuangZiChimeric virus-likeparticlevaccinesdisplayingconservedenterovirus71epitopeselicit protectiveneutralizingantibodiesinmicethroughdivergentmechanisms.J Virol2014, 88(1) :72-81.
[0175] 2.ShiJ，HuangX，LiuQ，HuangZ:Identificationofconserved neutralizinglinearepitopeswithintheVPlproteinofcoxsackievirusA16. Vaccine2013, 31 (17):2130-2136.
[0176] 3.KuZ,YeX,HuangX,CaiY，LiuQ，LiY，SuZ,HuangZ:Neutralizing antibodiesinducedbyrecombinantvirus-likeparticlesofenterovirus7lgenotype C4inhibitinfectionatpre-andpost-attachmentsteps.PLoS0ne2013, 8 (2):e57601.
[0177] 4.LiuQ，YanK，FengY，HuangX,KuZ,CaiY，LiuF，ShiJ，HuangZ:A virus-likeparticlevaccineforcoxsackievirusA16potentIyelicits neutralizingantibodiesthatprotectmiceagainstlethalchallenge. Vaccine2012, 30(47) :6642-6648.
[0178] 5.LiuQ，KuZ,CaiY，SunB，LengQ，HuangZ:Detection,characterization andquantitationofcoxsackievirusA16usingpolyclonalantibodiesagainst recombinantcapsidsubunitproteins.JVirolMethods2011, 173(I):115-120.
【主权项】
1. 一种抗原表位肽，其特征在于，所述抗原表位肽源自柯萨奇病毒的中和表位PEP71， 并且所述的抗原表位肽长度为5-15个氨基酸，并且所述抗原表位肽与载体蛋白融合后所 形成的重组蛋白可诱发哺乳动物产生针对该抗原表位肽的免疫反应。2. 如权利要求1所述的抗原表位肽，其特征在于，所述抗原表位肽选自下组： (a) 具有SEQ ID NO: 1氨基酸序列的多肽； (b) 将SEQ ID NO: 1氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成 的，且与载体蛋白融合后所形成的重组蛋白可诱发哺乳动物产生针对该抗原表位肽的免疫 反应的由（a)衍生的多肽。3. -种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白是如权利要求1中所述的抗原表位肽与 载体蛋白融合所形成的。4. 一种结合分子，其特征在于，所述结合分子能可特异性结合权利要求1所述的的抗 原表位肽或权利要求3所述的融合蛋白。5. -种分离的核酸分子，其特征在于，它编码权利要求1的抗原表位肽或权利要求3所 述的融合蛋白。6. -种组合物，其特征在于，它含有： (a) 权利要求1所述的抗原肽或其药学上可接受的盐、或权利要求3所述的融合蛋白； 和 (b) 药学上可接受的载体或赋形剂。7. 如权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述的组合物包括药物组合物和疫苗组 合物。8. 如权利要求1所述的抗原肽、权利要求3所述的融合蛋白或权利要求4所述的结合 分子的用途，其特征在于，用于制备检测手足口病病毒的试剂或试剂盒；或 用于制备预防或治疗手足口病病毒感染的药物。9. 一种免疫检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括根据权利要求1-2任一所述的 抗原表位肽、权利要求3所述融合蛋白或权利要求4所述的结合分子。10. -种制备权利要求3所述融合蛋白的方法，包括步骤： (1) 构建表达质粒 所述表达质粒中含有编码所述融合蛋白的核酸序列； (2) 融合蛋白的表达； 将所述质粒转入大肠杆菌BL21的感受态细胞进行表达。
【专利摘要】本发明提供了一种抗原表位肽，该抗原表位肽源自柯萨奇病毒的中和表位PEP71，并且所述的抗原表位肽长度为5-15个氨基酸，并且所述抗原表位肽与载体蛋白融合后所形成的重组蛋白可诱发哺乳动物产生针对该抗原表位肽的免疫反应。实验证明，包含该抗原表位肽的融合蛋白可以作为兼抗EV71和CA16的基因工程疫苗。
【IPC分类】C07K7/06, A61K39/125, C07K19/00, G01N33/68, A61K38/10, C12N15/62, A61K38/08, A61P31/14, C07K7/08
【公开号】CN105085625
【申请号】CN201410218963
【发明人】黄忠, 叶晓华
【申请人】中国科学院上海巴斯德研究所
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2014年5月22日