的抗体相结合的功能或活性 的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是（i)有一个或几个保守或非保守性氨 基酸残基（优选保守性氨基酸残基）被取代的多肽，或（ii)在一个或多个氨基酸残基中具 有取代基团的多肽，或（iii)抗原肽与另一个化合物（比如延长多肽半衰期的化合物，例如 聚乙二醇）融合所形成的多肽，或（iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽 (与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的融合蛋白）。根据本文的教导，这 些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
[0055] -类优选的活性衍生物指与式I或式II的氨基酸序列相比，有至多3个，较佳地 至多2个，更佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保 守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
[0056]表1
[0057]
[0058]
[0059] 发明还提供柯萨奇病毒抗原肽的类似物。这些类似物与SEQ ID NO: 1所示的多肽 的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而 有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基（如D-氨基酸）的类似物，以及具 有非天然存在的或合成的氨基酸（如P、Y-氨基酸）的类似物。应理解，本发明的多肽并 不限于上述例举的代表性的多肽。
[0060] 修饰（通常不改变一级结构）形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙 酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进 行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶（如哺乳动 物的糖基化酶或去糖基化酶）而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基（如磷酸酪 氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸）的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优 化了溶解性能的多肽。
[0061]本发明多肽还可以以由药学上或生理学可接受的酸或碱衍生的盐形式使用。这 些盐包括（但不限于）与如下酸形成的盐：氢氯酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳 酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、或羟乙 磺酸。其他盐包括：与碱金属或碱土金属（如钠、钾、钙或镁）形成的盐，以及以酯、氨基甲 酸酯或其他常规的"前体药物"的形式。
[0062]编码序列
[0063]本发明还涉及编码柯萨奇病毒抗原肽的多核苷酸。
[0064]本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是编码链或非编码链。 编码成熟多肽的编码区序列可以与编码SEQ ID NO: 1或3所示的多肽的序列相同或者是简 并的变异体。如本文所用，"简并的变异体"在本发明中是指编码具有SEQ ID N0:1或3所 示的多肽，但相应编码区序列有差别的核酸序列。
[0065]本发明的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的 方法获得。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽（或其片段，或其衍生 物）的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子（或如载 体）和细胞中。
[0066] 本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或多肽编码序 列经基因工程产生的宿主细胞。
[0067] 制备方法
[0068] 本发明多肽可以是重组多肽或合成多肽。本发明的多肽可以是化学合成的，或重 组的。相应地，本发明多肽可用常规方法人工合成，也可用重组方法生产。
[0069] -种优选的方法是使用液相合成技术或固相合成技术，如Boc固相法、Fmoc固相 法或是两种方法联合使用。固相合成可快速获得样品，可根据目的肽的序列特征选用适当 的树脂载体及合成系统。例如，Fmoc系统中优选的固相载体如连接有肽中C端氨基酸的 Wang树脂，Wang树脂结构为聚苯乙烯，与氨基酸间的手臂是4-烷氧基苄醇；用25%六氢吡 啶/二甲基甲酰胺室温处理20分钟，以除去Fmoc保护基团，并按照给定的氨基酸序列由C 端逐个向N端延伸。合成完成后，用含4%对甲基苯酚的三氟乙酸将合成的胰岛素原相关 肽从树脂上切割下来并除去保护基，可过滤除树脂后乙醚沉淀分离得到粗肽。将所得产物 的溶液冻干后，用凝胶过滤和反相高压液相层析法纯化所需的肽。当使用Boc系统进行固 相合成时，优选树脂为连接有肽中C端氨基酸的PAM树脂，PAM树脂结构为聚苯乙烯，与氨 基酸间的手臂是4-羟甲基苯乙酰胺；在Boc合成系统中，在去保护、中和、偶联的循环中，用 TFA/二氯甲烷（DCM)除去保护基团Boc并用二异丙基乙胺（DIEA/二氯甲烷中和。肽链缩 合完成后，用含对甲苯酚（5-10% )的氟化氢（HF)，在0°C下处理1小时，将肽链从树脂上 切下，同时除去保护基团。以50-80%乙酸（含少量巯基乙醇）抽提肽，溶液冻干后进一步 用分子筛SephadexGlO或Tsk_40f分离纯化，然后再经高压液相纯化得到所需的肽。可以 使用肽化学领域内已知的各种偶联剂和偶联方法偶联各氨基酸残基，例如可使用二环己基 碳二亚胺（DCC)，羟基苯骈三氮唑（HOBt)或1，1，3, 3-四脲六氟磷酸酯（HBTU)进行直接偶 联。对于合成得到的短肽，其纯度与结构可用反相高效液相和质谱分析进行确证。
[0070] 在一优选例中，本发明柯萨奇病毒抗原肽，按其序列，采用固相合成的方法制备， 行高效液相色谱纯化，获得高纯度目的肽冻干粉，-20°C贮存。
[0071] 另一种方法是用重组技术产生本发明多肽。通过常规的重组DNA技术，可利用本 发明的多核苷酸来表达或生产本发明的柯萨奇病毒抗原肽。一般来说有以下步骤：
[0072] (1).用本发明的编码柯萨奇病毒抗原肽的多核苷酸（或变异体），或用含有该多 核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
[0073] (2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
[0074] (3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
[0075] 重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其 物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域 技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理 (盐析方法）、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析（凝胶过滤）、吸附层析、离子交 换层析、高效液相层析（HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
[0076] 由于本发明多肽较短，因此可以考虑将多个多肽串联在一起，重组表达后获得多 聚体形式的表达产物，然后通过酶切等方法形成所需的小肽。
[0077] 药物组合物和施用方法
[0078] 本发明的抗原肽或融合蛋白可作为免疫原在体内诱导产生抗柯萨奇病毒的抗体 及淋巴T细胞活性，从而达到治疗效果。此外，本发明抗原肽具有优异的特异性和免疫活 性，故可用于制备免疫治疗或预防的疫苗。
[0079] 另一方面，本发明还提供了一种药物组合物（包括疫苗组合物），它含有（a)安全 有效量的本发明多肽（包括抗原肽和含有抗原肽的融合蛋白）或其药学上可接受的盐（或 其编码序列）；以及（b)药学上可接受的载体或赋形剂。本发明多肽的数量通常为10微 克-100毫克/剂，较佳地为100-1000微克/剂。
[0080] 为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0. 01毫克/千克至50毫克/千克， 较佳地0. 05毫克/千克至10毫克/千克体重的本发明多肽。此外，本发明的多肽可以单 用，也可与其他治疗剂一起使用（如配制在同一药物组合物中）。
[0081] 药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语"药学上可接受的载体"指用于治 疗剂给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个 体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在 Remington'sPharmaceuticalSciences(MackPub.Co.，N.J. 1991)中可找到关于药学上 可接受的赋形剂的充分讨论。这类载体包括（但并不限于）：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘 油、乙醇、佐剂及其组合。
[0082] 治疗性组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外， 这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、PH缓冲物质等。
[0083] 通常，可将治疗性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前 适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。
[0084] 一旦配成本发明的组合物，可将其通过常规途径进行给药，其中包括（但并不限 于）：肌内、静脉内、皮下、皮内或局部给药。待预防或治疗的对象可以是动物；尤其是人。[0085] 当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，可根据使用情况而采用各种不同剂型 的药物组合物。较佳地为注射剂。
[0086] 这些药物组合物可根据常规方法通过混合、稀释或溶解而进行配制，并且偶 尔添加合适的药物添加剂，如赋形剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、稀释剂、缓冲剂、等渗剂(isotonicities)、防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、稳定剂和助溶剂，而且该配制过程可根 据剂型用惯常方式进行。
[0087] 本发明的药物组合物还可以缓释剂形式给药。例如，柯萨奇病毒抗原肽或其盐可 被掺入以缓释聚合物为载体的药丸或微囊中，然后将该药丸或微囊通过手术植入人的组 织。作为缓释聚合物的例子，可例举的有乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物、聚羟基甲基丙烯酸 酯（polyhydrometaacrylate)、聚丙烯酰胺、聚乙烯批略烧酮、甲基纤维素、乳酸聚合物、乳 酸-乙醇酸共聚物等，较佳地可例举的是可生物降解的聚合物如