乳酸聚合物和乳酸-乙醇 酸共聚物。
[0088] 当本发明的药物组合物被用于预防或治疗时，作为活性成分的柯萨奇病毒抗原肽 或其药学上可接受的盐的剂量，可根据待预防或治疗的每个对象（病人）的体重、年龄、性 另Ij、症状程度而合理地加以确定。
[0089] 本发明的主要优点在于：
[0090] (1)首次发现了CA16病毒的保守中和表位PEP71 ;
[0091] (2)成功制备了展示CA16保守中和表位PEP71的嵌合病毒样颗粒，命名为 HBcPEP71。
[0092] (3)HBcPEP71免疫小鼠所产生的抗体在体外能够中和CA16病毒。
[0093] (4)HBcPEP71免疫小鼠所产生的抗体在体内能够抵抗致死剂量CA16病毒攻击。
[0094] (5)HBcPEP71免疫小鼠所产生的抗体在体外还能够中和EV71病毒。
[0095] (6)HBcPEP71是一个兼抗EV71和CA16的双价疫苗。
[0096] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（NewYork:ColdSpringHarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和 份数按重量计算。
[0097] 材料和方法
[0098] 1细胞和毒株
[0099]RD细胞和Vero细胞均购自中国科学院细胞库，培养方法参见文献[3]。所用病毒株 包括，CA16/SZ05(GeneBankID:EU262658) [4]，CA16/G08(GenBankID:KC342228) [4]和EV71/ G082[3]，所有毒株均在Vero细胞上扩增，并在RD细胞上进行滴度测定，方法参见文献[4]。
[0100] 2引物，多肽和病毒颗粒
[0101] 所有引物均在英俊公司合成。PEP71多肽（FGEHLQANDLDYGQ，SEQIDNO. :1)在 上海吉尔生化有限公司合成，PEP71多肽的鼠源抗血清由本实验室制备，详情参见文献[2]。 ELISA实验包被板子用的EV71/G082和CA16/SZ05灭活病毒的制备方法参见文献[1'5]，将浓 缩后的灭活病毒分别用WesternBlot定量[5]后待用。
[0102] 3表达质粒的构建
[0103] 质粒pET28b-HBc参见文献[1]。融合蛋白HBcPEP71表达质粒通过如下方法得到： 先将PEP71表位（氨基酸序列为：FGEHLQANDLDYGQ)的基因序列设计为含有XbaI和BglII 限制酶切位点悬臂的互补寡聚核苷酸：
[0104]PEP71-XbaI -F
[0105](CTAGAGACCTTTGGCGAACATCTGCAGGCGAATGATCTGGATTATGGCCAGGGA)和 PEP71-BglII -R
[0106] (GATCTccCTGGCCATAATCCAGATCATTCGCCTGCAGATGTTCGCCAAAGGTCT)，再将互补寡聚 核苷酸退火，形成含有XbaI和BglII限制性内切酶粘性末端的双链，然后连接到用XbaI 和BglII酶切过的pIBT-HBc载体上[1]，得到中间体质粒pIBT-HBcPEP71。然后通过PCR方 法将HBcPEP71的基因片段用引物
[0107]HBc-F-NcoI(CTGCCATGGACATTGACCCTTACAAAG)和
[0108]HBc-R-XhoI(GGCCTCGAGACATTGAG-ATTCCCTAGA)
[0109] 从质粒pIBT-HBcPEP71扩增出来，用限制内切酶NcoI和XhoI酶切后，连接到表 达载体pET-28b(+)，得到重组表达质粒pET28b-HBcPEP71，质粒表达图谱如图I-A所示。
[0110] 4融合蛋白的表达和纯化
[0111] 将重组质粒pET28b-HBcPEP71转入大肠杆菌BL21感受态细胞，挑取单菌落转 化子接入5ml含卡那霉素（50iig/ml)的LB培养基，于37°C，250rpm培养18h。然后按 1:100 (V/V)转接双份5ml含卡那霉素（50iig/ml)的LB培养基，继续在37°C，250rpm培养， 待0D600nm读数达到0. 8-1. 0,转移至18°C，200rpm摇床，在其中一管添加IPTG(终浓度为 25iiM)后继续培养8-12h。之后分别取10illIPTG诱导的和未诱导的菌液，用HBc特异性 的小鼠单抗（货号：ab8638 ;Abcam)和PEP71抗血清通过WesternBlot检测目的蛋白的表 达。再分别取ImlIPTG诱导的和未诱导的菌液，将菌体重悬到100illPBS进行超声破碎， 分为可溶性组分和包涵体（用100PIPBS重悬）两个组分，并用12%SDS-PAGE检测目的 蛋白。WesternBlot和SDS-PAGE的实验方法参见文献[1]。
[0112] 按照以上培养条件，将HBc和HBcPEP71融合蛋白放大到500ml表达，以进行纯 化。将诱导好的培养物在4°C，8000rpm离心8min，收集菌体，用适量预冷的PBS将菌体洗 一遍以除去残余培养基。再次将菌体重悬到PBS溶液，进行超声破碎，在4°C，12000rpm离 心30min后收集上清，用孔径为0. 45ym的滤膜过滤后，铺到20 %蔗糖垫上面，进行超速离 心（SW28Ti转子，27, 000rpm，4°C，3h)。沉淀下来的蛋白用PBS充分溶解，低速离心除去不 溶物，将上清用凝胶过滤层析法（Superdex20010/300GL，GE)做进一步纯化。
[0113] 5蔗糖密度梯度和电镜分析
[0114] 先用10%，20%，30%，40%及50%(1八）的蔗糖溶液制备梯度，将401^纯化的 HBc和HBcPEP71铺到最上层，进行超速离心（SW60Ti转子，4°C，39,OOOrpm)，之后从上至下 等体积收集10个组分，并对各组分样品分别进行WesternBlot和ELISA分析。从各组分 取20ii1样品，用HBc特异性单抗（货号：ab8638 ;Abcam)进行Westernblot分析，方法参 见文献[1]。从各组分取Iul样品稀释到50iUPBS后，包被到96孔ELISA板的单孔，每 个样品两个重复，用5%脱脂奶粉（溶于PBST)在37°C封闭lh，以下每步操作后，都需要用 PBST洗三次板子以除去非特异性结合。先添加1/1000稀释的PEP71抗血清（50iil/孔）， 37°C孵育2h，再添加1/5000稀释的HRP标记的抗鼠IgG(50iil/孔），37°C孵育lh，最后用 TMB溶液显色，用酶标仪测定0D450nm读值，方法参见文献[1]。
[0115] 对于电镜分析，将纯化的蛋白稀释为0.lmg/ml，用0. 75% (W/V)的甲酸铀染色后， 用TecnaiG2Spirit电镜，在120kV电压，X67,000放大倍数下观察并采集图像。
[0116] 6小鼠免疫及血清抗体测定
[0117] 动物免疫实验采用6-8周龄的雌性ICR小鼠，每组6只小鼠。将铝佐剂（Imject Alum，Pierce)与纯化的HBc或HBcPEP71按1:3 (V/V)混合，涡旋振荡30min后进行腹腔注 射，每只小鼠注射100P1抗原佐剂混合物（含10Pg抗原），添加同样体积佐剂的PBS作 为阴性对照组。各组小鼠分别免疫四次，间隔两周。在第一次免疫前两周和每次免疫后两 周分别采血。通过ELISA法测定血清中的抗体水平，主要步骤为：用PBS稀释的合成多肽 PEP71 (200ng/孔），灭活CA16病毒（IOng/孔）或者灭活EV71病毒（IOng/孔）包被96孔 ELISA板（50iil/孔），4°C孵育12h;将板子用5%脱脂奶粉（200iil/孔）在37°C封闭Ih; 添加1/500稀释的血清样本，每孔加50iU，做两个重复；ELISA实验的其它操作步骤与前面 相同。
[0118] 7中和试验
[0119] 中和试验的操作步骤及评判标准请参见文献[3]。EV71/G082和CA16/G08毒株每 个孔添加100个TCID50的病毒，CA16/SZ05毒株每个孔添加50个TCID50的病毒。
[0120] 8被动免疫及攻毒实验
[0121] 两组初生ICR小鼠（年龄小于12h，每组小鼠均来自同一母鼠）分别腹腔注射 (100ill/ 只）抗PBS或抗HBCPEP71 血清。24h后，腹腔注射 8X107TCID50 的CA16/G08 毒 株。对攻毒后的小鼠连续观察16天，每天记录其存亡情况并进行临床症状打分，临床症状 评定标准为：〇级，健康；1级，反应迟缓；2级，平衡失调，肌无力；3级，瘫痪；4级，死亡。
[0122] 实施例1HBCPEP71融合蛋白的表达及纯化
[0123]HBc分子的第77-83位氨基酸位于其a螺旋发夹结构的顶端，是形成HBc病毒样 颗粒表面刺突的部分，也是Jffic蛋白的主要免疫显性区（MajorImmunodominantRegion, MIR)。如图I-A所示，HBc分子MIR区的第77-83位氨基酸被替换为CA16的中和表位 PEP71(FGEHLQANDLDYGQ;SEQIDNO. :1)，得到表达融合蛋白HBcPEP71的重组质粒，经测序 确定序列正确。
[0124]Hbc的氨基酸序列为：
[0125]MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSV