专利名称：：番茄抗黄化曲叶病毒病育种的分子标记辅助选择方法
技术领域：
：本发明属于蔬菜抗病育种
技术领域：
，尤其属于一种用于番茄抗黄化曲叶病毒病育种的分子标记辅助选择的方法。
背景技术：
：番茄ayco^ra/cw7eycw/ewft/mMi11.)是世界上重要的蔬菜作物。它品种多，产量高，营养丰富，用途广泛。限制番茄生产发展和产量的主要原因在于病害的流行危害和逆境条件的制约。番茄黄化曲叶病毒病(TYLCVD)是限制番茄生产的重要病害之一，该病害是由双生病毒科(Gem/"/v/n^^)菜豆金色花叶病毒属(Segomov,my)的番琉黄化曲叶病毒(7b附ato_y￡〃cwcwr/.v/ms，TYLCV)引起的，并通过烟粉虱(fiem/s/atokcO传播，早在19世纪60年代，以色列等国就有报道。随着全球气候的变化、农业耕作制度的改变、国际贸易活动的迅速加强和烟粉虱介体在世界各地空前扩展，TYLCVD在世界范围内大面积爆发流行，在番茄生产上引起严重危害，据初步统计，至少已有39个国家的番茄正在遭受此类病毒的毁灭性危害。自20世纪90年代起，我国的浙江、山东、上海、广西、云南、江苏、河南、广东、福建、海南和台湾等地也相继在番茄上发现有双生病毒的危害。番茄黄化曲叶病毒病在首次暴发后，数年内便迅速蔓延开来并导致大暴发，故须立即采取措施进行积极有效的防控，其中防治该番茄黄化曲叶病毒病最有效的途径就是培育优良的抗病品种。传统的抗病育种主要是通过抗性鉴定与植株表型选择来进行，但这种方法不仅需要育种家具有丰富的育种经验，同时也还存在有诸如工作量大、周期长、易受环境条件的影响、育种效率低等的限制因素。分子标记辅助选择(marker-assistedselection,MAS)是一禾中通过分析与该抗病基因紧密连锁的分子标记有否存在，从而来确定该基因是否存在的一种方法。这种间接的选择方法不受环境条件的限制，并在育种早期世代材料的苗期阶段即可实现，这既大大减少了工作量，又加快了育种的进程，从而明显提高了抗该病害品种的育种效率。以往的研究表明，在番茄普通栽培种(Z_ycopers/co"escw/ewfww)中是不存在抗TYLCV基因的，仅有少量的品系对TYLCV表现出一定的耐性，而在野生番茄材料中含有抗TYLCV的基因。因此，在番茄育种体系中，找到与抗TYLCV基因紧密连锁的标记，对于抗病植株筛选和基因克隆都是必要和有益的。其中，Hanson等(2002)(HansonPM,BernacchiD,GreenS，TanksleySD，MuniyappaV,PadmajaAS,ChenHM,KuoQFangD,ChenJT.Mappingofawildtomatointrogressionassociatedwithtomatoyellowleafcurlvirusresistanceinacultivatedtomatoline.JournaloftheAmericanSocietyofHorticulturalScience,2000,125:15-20)利用92个RFLP标记作为探针对来自野生番茄抗黄化曲叶病毒的抗性基因进行定位分析，将其定位在11号染色体长臂的TG36(84cM)和TG393(103cM)标记之间约14.6cM的范围之内，2006年该基因被命名为7^-2，并定位在TG36(84cM)禾tlTG26(92cM)标记之间。Garcia等(2007)(GarciaBE,MartinCT，MaxwellDP.Detectionmethodsforthe2^-7geneforresistancetobegomovirusesonchromosome6oftomato.2007,http:〃www.plantpath.wise.edu/GeminivirusResistantTomatoes/Markers/MAS-Protocols/IntroTyl.pdf)根据T0302(89cM)标记设计的2对引物T0302F/T0302R和T0302F/TY2R1能够有效的检测基因型/>^/&2和&2/3>2，但由于不知道这个标记与基因的连锁程度，所以该标记或许不能检测所有含3>-2基因的材料。Ji等(2007)(JiY，SchusterDJ，ScottJW.7)/-3，abegomovirusresistancelocusneartheTomatoyellowleafcurlvirusresistancelocusJonchromosome6oftomato.MolecularBreeding,2007，20:271-284)利用易感品种7781x抗病自交系021108(来自丄yco;e^/cowc/H7mseLA2779)和易感品种8248x抗病自交系034611(来自Z^copera/cowc/2//emeLA1932)杂交后的F2分离群体进行连锁遗传分析和QTL定位分析；源于LA2779的F2群体，抗性位点定位在番茄6号染色体长臂上，源于LA1932的F2群体，抗性位点定位7>-3位点。2007年Maxwell等进一步发现，来自于LA2779禾卩LA1932的G8基因序列不同，并且把来自LA2779的基因命名为7>-3，来自LA1932的基因命名为7>-&。在上述抗性分子遗传基础的研究已证实，在6号染色体和11号染色体上存在抗性位点，并已找到相应的分子标记，如的标记有TG36、TG393、C2—At4g32930、TG105A、T0302、C2一At5g25760、Hba78A16T7、T0386A等；7>-3的标记有T1079、TG590、cLET画l画I13、P169C、C2—At3gl1210、C2—At5g05690、T0507、C2—At5g41480、TG118、C2—At4g27700、FLUW25、P6-25、FER-G8、UBC621、UBC697、UBC169等，这为分子标记辅助选择(MAS)方法在番茄抗黄化曲叶病毒病育种上的应用打下了基础。今后的一个方向将是研究各个位点的具体功能，进行不同效应基因的聚合育种。如果把7>-2及7>-3聚合到同一个品系中，将会产生更加稳定持久的抗性。
发明内容本发明目的是，针对番茄抗病育种中常规采用的抗性鉴定与植株表型相结合方法所存在的工作量大、进程慢、周期长、易受环境条件的限制、育种效率低、成本高等的缺陷，提供一种在番茄抗黄化曲叶病毒病育种进程中，用于早期分离世代与苗期抗病性鉴定，能准确、快速、高效选择出含有抗黄化曲叶病毒病基因材料的分子标记辅助选择的方法。本发明目的通过以下技术方案得以实现番茄抗黄化曲叶病毒病育种的分子标记辅助选择方法，该方法按以下步骤进行(1)从育种分离世代材料提取DNA:将番茄抗黄化曲叶病毒病育种分离世代材料的种子，播种；待幼苗长至34片真叶时，每植株取l片幼叶，用改进的CTAB法提取DNA;(2)筛选抗TYLCVD基因的SCAR分子标记根据已发表(HansonPM，BernacchiD,GreenS，TanksleySD，MuniyappaV，PadmajaAS,ChenHM,KuoGFangD，ChenJT.Mappingofawildtomatointrogressionassociatedwithtomatoyellowleafcurlvirusresistanceinacultivatedtomatoline.JournaloftheAmericanSocietyofHorticulturalScience,2000,125:15-20;JiY,BetterayBV,SmeetsJ，JensenKS，MejiaL，ScottJW，HaveyMJ,MaxwellDRCo-dominantSCARMarker,P6-25,forDetectionof3^-3，！^-3",and3^-36introgressionsfromthreeSolanumchilenseaccessionsat25cMofChromosome6ofBegomovirus-ResistantTomatoes.http:〃www.plantpath.wisc.edu/GeminivirusResistantTomatoes/Markers/MAS-Protocols/P6-25-locus.pdf)的文献资料，初选出抗番茄黄化曲叶病毒病基因的分子标记，合成引物后进行PCR扩增；并根据PCR扩增的纯合和杂合带型以及人工苗期接种鉴定结果，从中筛选出适合自己育种材料的抗番茄黄化曲叶病毒病基因和的SCAR分子标记；ry-2和？>-3SCAR标记的引物序列为引物1:5，-TGGCTCATCCTGAAGCTGATAGCGC-3，，引物2:5，-AGTGTACATCCTTGCCATTGACT誦3，，弓1物3:5,-GGTAGTGGAAATGATGCTGCTC誦3，，引物4:5，-GCTCTGCCTATTGTCCCATATATAACC-3，；(3)双重PCR反应体系的建立与电泳分析检测2>-2和7>-3基因的双重PCR反应体系为扩增反应的总体积为IO微升，0.7(iLDNA模板，0.2pL10mmol'L"dNTPs，50ng卞L—1的2上、下游引物各0.125(iL，50ng.[iL"的3>画3上、下游引物各0.125pL，1^L含20mmol'L"Mg2+的10x反应缓冲液，2U卞L"的ra酶0.25juL，无菌纯水7.35pL;PCR反应程序为94°C2min预变性后，接着94。C变性30s，54。C复性lmin，72。C延伸1min，40个扩增循环，最后72。C延伸10min;PCR产物于1.2%琼脂糖凝胶上进行电泳分离分析、EB染色，在Bio-RAD凝胶成像系统上自动成像；(4)依据检测结果对育种分离世代材料抗性的评价依据成像对育种分离世代材料抗性进行评价，若扩增条带中含有900bp和/或450bp大小的DNA条带，则该材料中含有抗番茄黄化曲叶病毒病的r,2和/或r,3基因；若反之，则该材料中没有和/或5>-3基因。所述的育种分离世代材料为高度分离的F2后代群体或者高度分离的Bd后代群体。所述改进的CTAB法提取DNA为，配制CTAB缓冲液100mL1mol.L/1TrispH7.5，140mL5mol丄"NaCl，20mL0.5mol'L國1EDTApH8.0，740mLMiliQH20，20gCTAB;10mg的新鲜叶片放入研钵中，加入150pLCTAB缓冲液，用钵杵轻轻研磨，然后再加入150pLCTAB缓冲液混匀；65'C水浴40min;加入300|iL24:1氯仿/异戊醇，上下混匀5min，使样品与氯仿充分混和；13000rmin"离心5min;取上清液150)iL，加入在-20。C预冷的异丙醇200pL，轻轻上下颠倒混匀；10000~12000rmin"离心34min，弃上清液；让异丙醇挥发干净，加入50100含RNase的ddH20溶解DNA;然后用1%的琼脂糖电泳所述的双重PCR反应体系，其Mg^浓度为2mmol丄—、引物浓度为0.625ng卞L—1，退火温度为54'C，循环数为40;本发明的有益效果是(1)本发明采用了目标材料DNA的双重PCR技术，二对引物在同一反应体系中同时扩增，这样大大地简化了实验操作。双重PCR扩增中消耗的试剂和准备的时间比使用2个试管的单一PCR少一半，因此该技术具有高效率和低成本的特点，适合对大量样本材料进行分析与鉴定，大大縮短时间和减少工作量，对标记材料的筛选效率提高一倍。(2)采用本发明改进的CTAB法提取DNA，既能简易、快速地提取出番茄DNA，又不需要经过液氮处理，且在提取过程中也不利用特殊化学药品如巯基乙醇及PVP等，降低了成本；(3)本发明可在实验室对抗番茄黄化曲叶病毒病育种进程中任何世代的材料，均可对其是否聚合抗TYLCV的基因进行准确、快速的直接检测，这既不受环境条件的影响，又可在任何时期进行，且不影响植株的正常生长。(4)本发明分子标记辅助选择聚合番茄抗黄化曲叶病毒病育种方法，与常规抗病育种、鉴定方法相比较，具有周期短、规模小、操作简便、省时、省力、省成本等优点。图1利用双重PCR技术对(2698BCr6X07-027)F2部分分离世代材料的电泳检测注M:Marker;1:(2698BC1-6X07-027)F2-l;2:(2698BC1-6X07-027)F2-6;3:(2698BC1-6X07-027)F2-8;4:(2698BC1-6X07-027)F2-12;5:(2698BCh6X07-027)F2-13;6:(2698BC1-6X07-027)F2-18;7:(2698BCl-6X07-027)F2-22;8:(2698BCl-6X07-027)F2-27;9:(2698BCl-6X07-027)F2-29;10:(2698BC1-6X07-027)Fr30;11:(2698BC1-6X07-027)F2-41;12:(2698BC1-6X07-027)F2-52;13:(2698BC1-6X07-027)F2-53;14:(2698BC1-6X07-027)F2-55;15:(2698BC1-6X07-027)F2-61;16:(2698BC1-6X07-027)F2-67;17:(2698BC1-6X07-027)F2-68;18:(2698BC1-6X07-027)F2-71;19:(2698BC1-6X907-027)F2-72;20:(2698BC卜6X07-027)F2-79:21:(2698BC1-6X07-027)Fr80;22:(2698BC1-6X07-027)F2-83;23:(2698BCl-6X07-027)F2-84;24:(2698BC1-6X07-027)F2-89;图2利用双重PCR技术对((9179x07-027)x07-026)F2部分分离世代材料的电泳检测注M:Marker;1:((9179x07-027)x07-026)F2-12;2:((9179x07-027)x07-026)F2-54;3:((9179x07-027)x07-026)F2-88;4:((9179x07-027)x。7-026)Fr67;5:((9179><07-027)x07-026)F2-112;6:((9179x07-027)x07-026)F2-193:7:((9〗79x07-027)x07-026)F2-13;8:((9179x07-027)x07-026)F2-105;9:((9179x07-027)x07-026)F2-5;10:((9179x07-027)x07-026)F2-48;具体实施例方式通过以下实施例并结合附图对本发明作进一步的详细说明，但应该理解本发明并不受这些内容所限制。实施例1:(利用分子标记辅助选择方法对杂交后代材料的抗性检测1)本例的具体实施步骤是1、亲本材料与杂交方法①亲本材料番茄优良株系T01-198:由浙江省农科院蔬菜研究所育成并保存，该株系无限，大红，中果，耐贮运，抗叶霉病，感番茄黄花曲叶病毒病，分离于荷兰弓1进杂交一代'TomatoSerrei，；07-026:含抗番茄黄化曲叶病毒病抗性基因7V-3，由亚洲蔬菜研究发展中心(AVRDC)提供；07-027:含抗番茄黄化曲叶病毒病抗性基因7V-2，由亚洲蔬菜研究发展中心(AVRDC)提供；②杂交方法以T07-026为母本，T01-198为父本，获得Ft杂交组合07-026xT0卜198;10再以T01-198为父本对Fi进行回交，获得回交世代Bd;对BC,分离后代进行分子标记检测，筛选出07-026XT01-198BC广6，命名为2698BC广6;以2698BCr6为母本，07-027为父本进行巧-3和^-2抗性基因聚合，获得F!杂交组合2698Bd-6X07-027，通过自交，获得高度分离的F2后代群体。2、利用SCAR分子标记辅助选择方法，从上述育种分离世代材料中检测、筛选出抗性材料(1)从育种分离世代材料提取DNA:将番茄抗黄化曲叶病毒病育种分离世代材料Bd及F2的种子，播种于基质为草炭蛭石=2:l(体积比)的育苗穴盘中，待幼苗长出3~4片真叶时，每个植株分别取1片幼叶，然后用改进的CTAB法提取DNA;首先配制CTAB缓冲液lOOmL1mol.L"TrispH7.5，140mL5mol.L"NaCl，20mL0.5mol.L-1EDTApH8.0，740mLMiliQH20，20gCTAB。DNA提取是取10mg的新鲜叶片放入研钵中，加入150liLCTAB缓冲液，用钵杵轻轻研磨，然后再加入150pLCTAB缓冲液混匀；65。C水浴40min;加入300pL24:l氯仿/异戊醇，上下混匀5min，使样品与氯仿充分混和；13000rmin"离心5min;取上清液150pL，加入在-20。C预冷的异丙醇200^L，轻轻上下颠倒混匀；1000012000rmin"离心34min，弃上清液；让异丙醇挥发干净，加入50~100nL含RNase的ddH20溶解DNA;然后用1%的琼脂糖电泳检测；(2)筛选抗TYLCVD基因的SCAR分子标记根据已发表(HansonPM,BemacchiD,GreenS，TanksleySD，MuniyappaV，PadmajaAS，ChenHM,KuoQFangD,ChenJT.Mappingofawildtomatointrogressionassociatedwithtomatoyellowleafcurlvirusresistanceinacultivatedtomatoline.JournaloftheAmericanSocietyofHorticulturalScience,2000,125:15-20;JiY，BetterayBV，SmeetsJ,JensenKS,MejiaL,ScottJW,HaveyMJ,MaxwellDP.Co-dominantSCARMarker,P6-25,forDetectionof2^-3,and7^-36introgressionsfromthreeSolatiumchilenseaccessionsat25cMofChromosome6ofBegomovims國ResistantTomatoes.http:〃www.plantpath.wise.edu/GeminivimsResistantTomatoes/Markers/MAS-Protoc0ls/P6-25-locus.pdf)的文献资料，选择18个抗番茄黄化曲叶病毒病基因的分子标记，合成引物，进行PCR扩增；再根据PCR扩增的纯合和杂合带型以及人工苗期接种鉴定结果，筛选出适合自己育种材料的抗番茄黄化曲叶病毒病和7^5基因的SCAR分子标记&-2和5^-3SCAR标记的引物序列引物1:5'-TGGCTCATCCTGAAGCTGATAGCGC國3，，引物2:5，画AGTGTACATCCTTGCCATTGACT函3,，引物3:5，-GGTAGTGGAAATGATGCTGCTC-3'，引物4:5，-GCTCTGCCTATTGTCCCATATATAACC-3，。(3)双重PCR方法的建立与检测建立一步法可同时检测r,2和2>-3基因，优化反应体系及条件，获得最佳的扩增和检测效果，r,2和r少-3基因的混合引物在同一反应体系中同时扩增，双重PCR反应体系扩增反应总体积为IO微升；0.7)iLDNA模板，0.2pL10mmol-L"dNTPs，50ng卞L"的2>-2上、下游引物各0.125[iL，50ng卞L'1的t,3上、下游引物各0.125(jL，l)iL含20mmol丄"Mg2+的10x反应缓冲液，2U卞L"的rag酶0.25(iL，无菌纯水7.35pL。PCR反应程序为94°C2min预变性后，接着94'C变性30s，54。C复性lmin，72'C延伸1min，40个扩增循环，最后72。C延伸10min;该反应体系中，最佳Mg"浓度为2mmol丄'1，引物浓度为0.625ng^U1，退火温度为54。C，循环数为40;PCR产物于1.2%琼脂糖凝胶上进行电泳分离分析，电泳结束后用EB染色，并在Bio-RAD凝胶成像系统上自动成像，即可依据此分析检测结果对育种分离12世代材料的抗性进行评价；经反复验证，结果可靠，可以用于在同一PCR反应体系中对7>2和r,3基因进行同时检测。3、结果与分析在所用的番茄材料中优良株系T01-198，没有扩增出900bp和/或450bp大小的DNA条带，说明该材料中没有^-2和/或^-3基因；在07-026材料中扩增出一条450bp大小的条带，说明该材料是基因型；在07-027材料中扩增出一条900bp大小的条带，说明该材料是^-2/:^-2基因型。获得的目标中间材料07-026xT01-198和07-026XTO1-198BC广6，都扩增出320bp和450bp大小的两条DNA条带，说明这些材料是7>-3/&-3基因型；中间材料2698BC广6X07-027，扩增出320bp、450bp、800bp和卯0bp的4条DNA条带，说明该材料是7>-27V-3/^-3基因型。对2698Bd-6X07-027高度分离的F2后代群体进行和^-3分子标记检测(图1)，其中18份是^-2基因型，7份是3>-3/5>-3基因型，12份是^v-2/y-3^-2基因型，10份r,20^/0^^-3基因型，其它的是2&-3//>^0^基因型。实施例2:(利用分子标记辅助选择方法对杂交后代材料的抗性检测2)本例的具体实施步骤是1、亲本材料与杂交方法①亲本材料9179是从欧洲引进的高抗叶霉病的鲜销杂交一代品种9502和亚洲蔬菜研究发展中心引进材料9132杂交后，在高度分离后代中经8代株系选择而成的稳定株系，该株系无限，粉红，大果，抗叶霉病，感番茄黄花曲叶病毒病；07-026和07-027材料同实施例1;②杂交方法以9179为母本，07-027为父本，获得F！杂交组合9179x07-027;以07-026为父本对该Ft进行杂交，获得三交组合"(9179x07-027)x07-026";利用^-2和分子标记对三交组合高度自交分离后代进行检测。2、利用SCAR分子标记辅助选择方法，从上述育种分离世代材料中检测、筛选出抗性材料具体从育种分离世代材料提取DNA、筛选抗TYLCVD基因的SCAR分子标记及DNA的双重PCR扩增与检测的方法同实施例1;3、结果与分析在所用的番茄材料中优良株系9179，没有扩增出900bp和/或450bp大小的DNA条带，说明该材料中没有和/或，3基因；在07-027材料中扩增出一条900bp大小的条带，说明该材料是&-2/7>-2基因型；在07-026材料中扩增出一条450bp大小的条带，说明该材料是r,3/T,3基因型；获得的目标中间材料9179x07-027，扩增出800bp和900bp大小的两条DNA条带，说明这些材料是2/^-2基因型；三交组合材料"(9179x07-027)x07-026"，扩增出320bp、450bp、800bp和900bp的4条DNA条带，说明该材料是7>-27>-3~-2/>^基因型(见图2);对三交组合高度自交分离后代进行^-2和^-3分子标记检测，其中2份是3>-基因型，8份是r,3/2>3基因型，30份是7V-2/);-3/0^^3基因型，5份是&-3^-2/^-3tv-2基因型，25份是3>-2r,3/W-2tv-3基因型，其它的是(v-2&-3~-2~-3基因型。实施例3:(应用人工苗期接种鉴定法对分子标记辅助选择抗性材料的验证)应用筛选标记的抗性纯合和杂合带型选择抗性植株，在番茄抗黄化曲叶病毒病育种过程中，采用双重PCR技术对r,2和^-3基因进行同时检测，从中筛选出含抗性基因的材料07-026XT01-198BCr6、07-026XT01-198BC广86、07-02614XT01-198BC广112、(2698BC广6X07-027)F2-53、(2698BC厂6X07-027)F2-72、((9179x07-027)x07-026)F2-88、((9179x07-027)x07-026)F2-105等，随后进一步应用人工苗期接种鉴定法对分子标记辅助选择抗性植株进行验证(表1)。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>序列表<110>浙江省农业科学院〈120〉番茄抗黄化曲叶病毒病育种的分子标记辅助选择方法〈160〉4<210〉1<211〉25<212〉腿<213〉人工序列〈220><223>根据己知序列而设计，由上海生物技术有限公司合成，用作7>-2分子标记的上游引物<400〉1tggctcatcctgaagctgatagcgc25<210〉2<211〉23<212>腿<213〉人工序列<220〉〈223〉根据己知序列而设计，由上海生物技术有限公司合成，用作7>-2分子标记的下游引物<400>2agtgt.acatccttgccattgact23<210〉3<211>22<212>DNA<213>人工序列〈220〉<223>根据已知序列而设计，由上海生物技术有限公司合成，用作7>-3分子标记的上游引物<棚〉3ggtagtggaaatgatgctgctc22<210>4<211〉27<212>DNA<213>人工序列〈220><223>根据己知序列而设计，由上海生物技术有限公司合成，用作7>-3分子标记的下游引物〈400>4gctctgcctattgtcccatatataacc271权利要求1、番茄抗黄化曲叶病毒病育种的分子标记辅助选择方法，其特征在于该方法按以下步骤进行(1)从育种分离世代材料提取DNA将番茄抗黄化曲叶病毒病育种分离世代材料的种子，播种；待幼苗长至3～4片真叶时，每植株取1片幼叶，用改进的CTAB法提取DNA；(2)筛选抗TYLCVD基因的SCAR分子标记根据已发表的文献资料，初选出抗番茄黄化曲叶病毒病基因的分子标记，合成引物后进行PCR扩增；并根据PCR扩增的纯合和杂合带型以及人工苗期接种鉴定结果，从中筛选出适合自己育种材料的抗番茄黄化曲叶病毒病基因Ty-2和Ty-3的SCAR分子标记；Ty-2上、下游引物的序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，Ty-3上、下游引物的序列分别如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示；(3)双重PCR反应体系的建立与电泳分析检测Ty-2和Ty-3基因的双重PCR反应体系为扩增反应的总体积为10微升，0.7μLDNA模板，0.2μL10mmol·L-1dNTPs，50ng·μL-1的Ty-2上、下游引物各0.125μL，50ng·μL-1的Ty-3上、下游引物各0.125μL，1μL含20mmol·L-1Mg2+的10×反应缓冲液，2U·μL-1的Taq酶0.25μL，无菌纯水7.35μL；PCR反应程序为94℃2min预变性后，接着94℃变性30s，54℃复性1min，72℃延伸1min，40个扩增循环，最后72℃延伸10min；PCR产物于1.2％琼脂糖凝胶上进行电泳分离分析、EB染色，在Bio-RAD凝胶成像系统上自动成像；(4)依据检测结果对育种分离世代材料抗性的评价依据成像对育种分离世代材料抗性进行评价，若扩增条带中含有900bp和/或450bp大小的DNA条带，则该材料中含有抗番茄黄化曲叶病毒病的Ty-2和/或Ty-3基因；若反之，则该材料中没有Ty-2和/或Ty-3基因。2、按权利要求1所述分子标记辅助选择方法，其特征在于所述的育种分离世代材料为高度分离的F2后代群体或者高度分离的Bd后代群体。3、按权利要求1所述分子标记辅助选择方法,其特征在于所述改进的CTAB法提取DNA为，配制CTAB缓冲液100mL1mol'L"TrispH7.5，140mL5molL"NaCl，20mL0.5molL國1EDTApH8.0，740mLMiliQH20，20gCTAB;10mg的新鲜叶片放入研钵中，加入150pLCTAB缓冲液，用钵杵轻轻研磨，然后再加入150pLCTAB缓冲液混匀；65。C水浴40min;加入300pL24:1氯仿/异戊醇，上下混匀5min，使样品与氯仿充分混和；13000rmin—1离心5min;取上清液150^L，加入在-2(TC预冷的异丙醇200juL，轻轻上下颠倒混匀；1000012000r.min"离心34min，弃上清液；让异丙醇挥发干净，加入50100liL含RNase的ddH20溶解DNA;然后用1%的琼脂糖电泳检测。4、按权利要求1所述分子标记辅助选择方法，其特征在于所述的双重PCR反应体系，其Mg^浓度为2mmol七"，引物浓度为0.625ng'(iL"，退火温度为54°C，循环数为40。全文摘要本发明公开了番茄抗黄化曲叶病毒病育种的分子标记辅助选择方法，属于蔬菜抗病育种
技术领域：
。该方法按以下步骤进行(1)从育种分离世代材料提取DNA；(2)筛选抗TYLCVD基因的SCAR分子标记；(3)DNA的双重PCR扩增与电泳分析检测；(4)依据检测结果对育种分离世代材料进行抗性评价。本发明可在实验室对育种进程中的任何世代材料，对其是否聚合抗TYLCV的基因进行准确、快速的检测，从而明显缩短了抗病育种的周期，缩小了育种规模，并具有操作简便、省时、省力、省成本等优点，减少了工作量，提高了对抗性材料的筛选效率，加快了抗病育种进程。该发明可在番茄育种单位推广应用。文档编号C12Q1/68GK101560566SQ200910097378公开日2009年10月21日申请日期2009年4月13日优先权日2009年4月13日发明者叶青静,周国治,姚祝平,李志邈,杨悦俭,王荣青,阮美颖申请人:浙江省农业科学院