专利名称：：一种双链特异性DNA酶介导的cDNA均一化消减杂交方法
技术领域：
：本发明涉及一种双4连特异性DNA酶介导的cDNA均一化消减杂交(Duplex-specificnuclease-mediatednormalizationandsubtractivehybridization,DNSH)方法。(二)
背景技术：
：生物体不同组织或细胞间，以及同一组织或细胞在不同发育时期、不同应激条件下会选择性地表达一部分基因，这些表达量或表达时期不同的基因称为差异表达基因(differentiallyexpressedgene)。克隆和鉴定差异表达基因能够有力地推动生物个体的发育、分化、癌变等过程的机理的研究。目前筛选差异表达基因的方法主要有差异显示(differentialdisplay,DD),^表'I"生差异分冲斤(representationaldifferenceanalysis,RDA),基因表达系列分才斤(serialanalysisofgeneexpression,SAGE)和4中制性消减杂交(suppressionsubtractivehybridization,SSH)。这些方；去分另ll具有一些缺点DD—次最多只能获得少数几个基因的cDNA部分序列，而且假阳性率较高；RDA不能有效地将非目的分子消减掉，假阳性率也较高，而且更利于表达量高的基因的富集，容易丢失低表达量的基因的信息；SAGE需要大量地测序，分析大量的序列信息，而且获得的序列长度目前最长也只有十几碱基对(bp),后期的研究仍要大量的工作；SSH相对RDA要高效，而且也能对表达量不同的cDNA的含量有一定均一化作用，但抑制性PCR的强弱受多种因素控制5，另外SSH也容易丟失低表达量的基因的信息。此外，上述的这些方法都不能得到全长的cDNA,这样在序列比对时也容易丟失信息；对于需要深入研究的基因，得到全长cDNA也是必需的。因此，需要一种能够富集差异表达基因的方法，这种方法不但能够均一化丰度不同的差异基因，而且可以得到全长cDNA。
发明内容为有效地筛选生物样品中不同丰度的差异表达基因，并获得基因的全长cDNA序列，本发明提供了一种双链特异性DNA酶介导的cDNA均一化消减杂交方法。本发明采用的技术方案是一种双链特异性DNA酶介导的cDNA均一化消减杂交方法，所述方法包括如下顺序步骤(1)第一链cDNA的合成选取两组样品tester和driver,其中tester具有差异表达基因，抽提样品的总RNA,分别利用模板转换技术(template-switching)进行逆转录,合成tester和driver的第一链cDNA，使第一链cDNA的两端分别带有已知序列TsOligo-p和Tspa，所述TsOligo-p中包含T7启动子序列，3，端包含3个以上连续G碱基，且3，末端磷酸化，以使合成的cDNA中全长cDNA的比例提高；Tspa包含一段OligodT区域和另外一段已知序列)，分别命名为tester1和driver1;样品组tester和driver中既有差异表达基因，也有共同表达(非差异)的基因。目的是筛选和克隆那些在tester里面有表达或表达量较高而在driver里无表达或表达量较低的基因，筛选到的这些基因将为研究两组样品之间产生区别的基因功能和分子机制提供基础。(2)合成双链cDNA:利用与testerl和driverl的两端已知序列TsOligo-p和Tspa相匹配的引物SP6T7和3'ap，PCR扩增合成tester和driver的双链cDNA,通过PCR扩增可以分别合成大量的tester和driver的双链cDNA，同时4吏双链cDNA上带有SP6和T7RNA聚合酶的识别序列，分别命名为tester2和driver2;(3)转录脂A:tester2用SP6RNA聚合酶转录，driver2用T7RNA聚合酶大量转录，分别得到样品RNA,命名为tester3和driver3;(4)逆转录tester3逆转录合成cDNA，形成cDNA:RNA复合物，其中cDNA两端加入已知的接头序列；(5)均一化和消减杂交将cDNA:RNA复合物与过量driver3在杂交緩沖液中混合，充分杂交；杂交緩沖液终浓度组成如下0.025MTris(pH8.0),0.5MNaCl，0.01mMEDTA,0.2M海藻糖，20%(v/v)DMSO。其中海藻糖和DMSO都具有降低双链核酸的熔解温度(meltingtemperature)的作用，使变性和杂交可以在更低的温度下进行，从而减少核酸受热水解等作用，同时增加杂交的特异性，减少核酸因形成稳定的二级结构而被双链特异性核酸酶(duplex-specificnuclease,DSN)酶切降解。具体方法为反应体系在88。C下热变性90s,然后在55。C下放置16小时使tester的cDNA和driver的RNA进行充分地杂交。由于driver相比tester是过量的，所以杂交过后，tester里面只有差异表达的目的cDNA还存在单链形式，大多数非差异cDNA与driver的RNA形成杂交双链，也有少部分自身杂交。此外由于杂交的二级反应动力学的特性(secondorderkineticsofhybridizations)，那些单链的差异表达的目的cDNA被均一化了即本来丰度不同的差异表达基因(差异表达的基因之间存在量的差别)的单链cDNA在杂交之后变得相对相等。(6)双链特异性DNA酶消化在杂交产物中加入DSN酶和DSN酶的緩冲液，进行酶切反应；(lx缓沖液的成分为50mMTris，pH8.0,7mMMgCl2，ImMDTT,0.2M海藻糖(trehalose))，具体过程反应体系在65°C反应30分钟。加入1.5juL的100mMEDTA溶液，将反应液升温到68。C并保持10分钟使反应终止。此时所有与RNA杂交的cDNA都已经被DSN酶切成小片段，差异表达基因的cDNA由于没有过量的driverRNA与之杂交，大部分还处于单链状态，因此不能被DSN酶切。(7)PCR扩增根据cDNA上的接头序列设计引物，进行PCR扩增，富集差异表达基因；由于步骤(6)中的DSN酶的作用，共同表达基因的cDNA由于被酶切而不能被PCR扩增。PCR扩增中用到了抑制性PCR的作用来调节不同分子量cDNA的扩增效率，同时可以用多至三轮PCR扩增来提高产物量。(8)克隆差异表达基因及鉴定将PCR产物直接克隆到T载体上，或者用Sail酶切后接入Sail酶切的载体上，转入大肠杆菌，构建差异表达基因富集的cDNA文库。利用这些文库分析基因表达，也可以制备基因芯片；消减杂交的PCR产物还可以标记为探针，从已有文库中筛选差异表达的基因。可以把文库中或从基因芯片分析结果中挑选的每个基因单独做Northem、半定量逆转录(RT)PCR、或荧光定量RT-PCR等方法鉴定这些基因是不是真正的差异表达基因。具体的，步骤(1)中已知序列TsOligo-p和Tspa如下TsOligo-p:GTAATACGACTCACTATAGGGGG-t3;Tspa:TGGTTGGACTCGGTTTGGACGCCATAGAATTGGTTTTTTTTTTTTTTTVN;TsOligo-p的3'末端磷酸化，下划线标示部分为T7启动子序列。V表示A、C、G的兼并碱基，N表示A、T、C、G的兼并碱基。因为polyA是一段有几百个碱基的A组成，如果用TTTTTTTTTTTTTTT逆转录的话，它可以结合到polyA的任何位点并开始逆转录，而用TtttttTTTTTTTTTVN的的话，可以让它结合到polyA的起始位点，因为兼并碱基V只能跟A之外的其它碱基结合，后面再加一个N会增强这种效果。步骤(2)中引物SP6T7和3'ap序列如下SP6T7:CATTTAGGTGACACTATAGAGTAATACGACTCACTATAGGG;3'ap:TGGTTGGACTCGGTTTGGACG;其中下划线标示部分为T7启动子序列。步骤(4)中已知的接头序列为T7启动子序列。具体的，步骤(4)方法如下在逆转录反应体系中，以tester3作为模板，加入引物T7oligodT，进行逆转录反应，然后加入EDTA使反应终止，在7(TC加热15分钟使逆转录酶失活，得到cDNA:RNA复合物，其中cDNA两端都加入了T7启动子序列；引物T7oligodT序列如下GTAATACGACTCACTATAGGGGG(T)15VN，其中下划线标示部分为T7启动子序列。步骤(5)中杂交緩冲液终浓度组成如下0.025MTris(pH8.0),0.5MNaCl，0.01mMEDTA,0.2M海藻糖，20%(v/v)DMSO。具体方法为反应体系在88。C下热变性90s,然后在55。C下放置16小时使tester的cDNA和driver的RNA进行充分地杂交。PCR扩增中用到了抑制性PCR的作用来调节不同分子量cDNA的扩增效率，同时可以用多至三轮PCR扩增来提高产物量。具体的，步骤(7)方法如下以DSN酶切过的cDNA为才莫板，以SOI和PI为引物，进行第一轮PCR;然后以第一轮PCR产物为模板，以PI为引物，进行第二轮PCR;最后以第二轮PCR产物为模板，以SalT7P为引物，进行第三轮PCR;所用引物序列如下SOI:CTGCAGCGAACCAATCCTCTGTAATACGACTCACTATAGGG;PI:CTGCAGCGAACCAATCCTCTG;SalT7P:GATCGTCGACGTAATACGACTCACTATAGGG;其中下划线标示部分为T7启动子序列。与其它方法相比本发明的有益效果主要体现在(a)对共同表达基因的高消减效率，对差异表达基因的高效富集，同时表达量很低的差异表达基因可以被有效富集；(b)能够得到全长cDNA序列。(四)图1为双链特异性DNA酶介导的cDNA均一化消减杂交实-睑流程图。(五)具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1:囟虫休眠生殖特异性表达基因的分析所用引物(10juM)序列见表1:<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注T7启动子序列用下划线表示，引物TsOligo-p的3，末端磷酸化。本实验的目的是分离卣虫(^rtow'aparf/2e打ogewe"ca,尕海湖，中国)休眠生殖特异性表达的基因。(1)、合成第一链cDNA。选取两组样品，一组样品为在短光照条件下(光照黑暗周期为4:20,卣虫以产休眠卵为主要生殖方式)生长的卣虫位于双侧嚢的卵母细胞，这组样品作为为tester;另一组样品为在长光照条件下(光照黑暗周期为16:8，卣虫以产幼虫为主要生殖方式)生长的卣虫位于双侧囊的卵母细月包，这纟且才羊品作为driver。目的是筛选和克隆那些在tester里面有表达或表达量较高而在driver里无表达或表达量较低的基因，筛选到的这些基因将为研究两组样品之间产生区别的基因功能和分子^L制提供基础。具体原理参见图1。利用TriZol抽提tester和driver的总RNA(不需要抽提mRNA),利用改进的模板转换技术(template-switching)分别合成第一链cDNA,使第一链cDNA的两端分别带有一段已知的序列(图1中TsOligo-p和Tspa的序歹ll),步骤如下在冰上分别将1昭tester和driver的总RNA，1|aL10mM的dNTPs,110TsOligo-p，及1jxL10jiMTspa混合，25x第一链合成緩冲液(250mMTris-ClpH8.3,375mMKC1,25mMMgCl2，10mMMnCl2,50mMDTT),lpL2M海藻糖(trehalose)，15M甜菜碱(betaine),0.25jaL認aseInhibitor(40U/pL，TaKaRa公司)，以及0.75逆转录酶MMLV-RT(H-)(200U/(iL,Promega公司)，力口灭菌的DEPC处理水补足到10总体积后在42。C放置1小时接着在42。C放置30分钟使逆转录完成。最后用AxyPrepPCRClean-upKit(Axygen公司)纯化逆转录产物，纯化产物溶于80|iL5mMTris,pH8.5中。(2)、合成双链cDNA。利用与第一链cDNA两端的已知序列相匹配的引物SP6T7和3，ap引物通过PCR扩增可以分别合成大量的tester和driver的双链cDNA。同时可以使新合成的双链cDNA上带有SP6和T7RNA聚合酶的识别列。每100|iL的PCR反应液成分如下50mMTris,16mM(NH4)2S04,1.55mMMgCl2，0.2mMdNTPs，4(xL纯化的第一链cDNA,SP6T70.2|iM，3,ap0.2(iM,Taq+PfuDNA聚合酶(5U/pL,Sangon公司，其中Taq和PfU的混合比例是100:3,以下同)0.8pL。PCR反应程序如下94°C1min;24循环的94°C30s,60°C30s，68°C6min。PCR产物用AxyPrepPCRClean-upKit(Axygen)纯化，并溶于35(iL5mMTris，pH8.5中。(3)、转录RNA。以步骤(2)中得到的DNA各1[ig为斗莫板进行在10体系里进行转录。其中tester组样品用SP6RNA聚合酶(Promega公司)转录，driver组样品用RiboMAXLargeScaleRNAProductionSystem-T7(Promega公司)大量转录，转录在37。C进行4小时后用0.5U的DNaseI作用20分钟去除其中的DNA。接着用酸性酚以及氯仿的方法纯化RNA。(4)、从步骤③中得到的tester样品RNA再次逆转录合成cDNA。步骤如下在10的反应体系中，以0.5昭RNA作为模板，加入2fiLM-MLVRT5xReactionBuffer(Promega公司)，1|iL10mMdNTPs,1jiLT7oligodT，1|iLbetaine(5M)，1trehalose(2M)，0.25RNaseInhibitor(40U/pL,TaKaRa公司)，以及0.75M-MLVRT(H-)(200UL，Promega公司)，在42。C放置1小时接着在42。C放置30分钟使逆转录完成。然后加入1piL100mM的EDTA使反应终止，在70。C加热15分钟使逆转录酶失活。此合成的cDNA和RNA形成cDNA:RNA复合物，其中cDNA两端都加入了已知的接头序列(T7启动子序列)。(5)、均一化和消减杂交。在10的反应体系中，将2|uL从步骤(4)中得到的cDNA:RNA复合物与15|ig(约是tester的150倍)从步骤(3)中得到的RNA在适当的杂交缓冲液中混合。混合后杂交液的成分是0.025MTris(pH8.0)，0.5MNaCl，0.01mMEDTA,0.2Mtrehalose,20%(v/v)DMSO;在88°C下热变性90s，然后在55°C下放置16小时使tester的cDNA和driver的RNA进行充分地杂交。由于driver相比tester是过量的，所以杂交过后，tester里面只有差异表达的目的cDNA还存在单链形式，大多数非差异cDNA与driver的RNA形成杂交双链，也有少部分自身杂交。此外由于杂交的二级反应动力学的特性(secondorderkineticsofhybridizations),那些单链的差异表达的目的cDNA被均一化了即本来丰度不同的差异表达基因(差异表达的基因之间存在量的差别)的单链cDNA在杂交之后变得相对相等。(6)、双链特异性DNA酶消化。在上述步骤(5)所得到的杂交产物中加入等体积的DSN酶反应緩沖液(lx緩沖液的成分为50mMTris,pH8.0，7mMMgCl2，lmMDTT，0.2Mtrehalose),在65。C时再加入1DSN酶(Evrogen公司)，反应30分钟。加入1.5(iL的lOOmMEDTA溶液，以及20灭菌去离子水，将反应液升温到68。C并保持10分钟使反应终止。此时所有与RNA杂交的cDNA都已经被DSN酶切成小片段，差异表达基因的cDNA由于没有过量的driverRNA与之杂交，大部分还处于单链状态，因此不能被DSN酶切。(7)、利用PCR扩增来富集差异表达基因。利用步骤(4)中加入cDNA上的接头序列设计的引物来扩增差异表达基因的cDNA。由于步骤(6)中的DSN酶的作用，共同表达基因的cDNA有于被酶切而不能被PCR扩增。用了三轮PCR来扩增差异表达基因的cDNA。第一轮PCR用2经过DSN处理的cDNA为模板，1(iLSOI,2pLPI作为引物；第二轮PCR用0.4pL第一轮PCR的产物做模板，用4jnLPI作为引物；第三轮PCR用0.4pL第二轮PCR的产物做模板，用1.6jiLSalT7P作为引物。PCR的反应体系均为100^L，其他的反应液成分与步骤(2)中PCR緩冲液相同。三轮PCR的循环数分别是30，30，25。第三轮PCR产物用AxyPrepPCRClean-upKit(Axygen公司)纯化，并溶于35(iL5mMTris,pH8.5中。(8)、克隆差异表达基因及鉴定。消减杂交的PCR产物用Sail酶切后接入到用Sail酶切的PUC19载体上，转入大肠杆菌，构建差异表达基因富集的cDNA文库。随机挑选了768个大肠杆菌克隆，测序结果显示其中692个含可用的cDNA(在GenBank上的序列号是GH635209GH635卯0),总共有600种不同的cDNA。挑选了其中的44种cDNA(来源于56个克隆)进行荧光定量RT-PCR方法才全测发现，其中11个cDNA(21个克隆)的表达量上调，另外这些基因之间的表达量差异也非常大，最大约3000倍。由此可以证明DNSH的有效性。SEQUENCELISTING<110>浙江大学<120>—种双链特异性DNA酶介导的cDNA均一化消减杂交方法<130><160>8<170>Patentlnversion3.4<210>1<211>23<212>DNA<213>Unknown<220><223>人工序列<400>1gtaatacgactcactataggggg23<210>2<211>40<212〉DNA<213>Unknown<220><223>人工序列<220><221>misc_feature<222>(40).r(40)<223>nisa,c,g，ort<400>2gtaatacgactcactatagggggtttttttttttttttvn40<210>3<211>41<212>DNA<213>Unknown<220><223>人工序列<400>3ctgcagcgaaccaatcctctgtaatacgactcactataggg41<210>4<211>21<212>DNA<213>Unknown<220><223>人工序列<400>4ctgcagcgaaccaatcctctg21<210>5<211>31<212>DNA<213>Unknown<220><223>人工序列<400>5gatcgtcgacgtaatacgactcactataggg31<210>6<211>41<212>DNA<213>Unknown<220><223>人工序列<400〉6catttaggtgacactatagagtaatacgactcactataggg41<210>7<211>50<212>DNA<213>Unknown<220><223>人工序列<220><221>misc—feature<222>(50):(50)<223>nisa,c,g，ort<400>7tggttggactcggtttggacgccatagaattggtttttttttttttttvn50<210>8<211>21<212>DNA<213>Unknown<220><223>人工序列<400〉8tggttggactcggtttggacg2权利要求1.一种双链特异性DNA酶介导的cDNA均一化消减杂交方法，所述方法包括如下顺序步骤(1)第一链cDNA的合成选取两组样品tester和driver，其中tester具有差异表达基因，抽提样品的总RNA，分别利用模板转换技术进行逆转录，合成tester和driver的第一链cDNA，使第一链cDNA的两端分别带有已知序列TsOligo-p和Tspa，分别命名为tester1和driver1，所述TsOligo-p中包含T7启动子序列，3’端包含3个以上连续G碱基，且3’末端磷酸化；所述Tspa包含一段OligodT区域；(2)合成双链cDNA利用与tester1和driver1的两端已知序列TsOligo-p和Tspa相匹配的引物SP6T7和3’ap，PCR扩增合成tester和driver的双链cDNA，使双链cDNA上带有SP6和T7RNA聚合酶的识别序列，分别命名为tester2和driver2；(3)转录RNAtester2用SP6RNA聚合酶转录，driver2用T7RNA聚合酶转录，分别得到样品RNA，命名为tester3和driver3；(4)逆转录tester3逆转录合成cDNA，形成cDNARNA复合物，其中cDNA两端加入已知的接头序列；(5)均一化和消减杂交将cDNARNA复合物与过量driver3在杂交缓冲液中混合，充分杂交；(6)双链特异性DNA酶消化在杂交产物中加入DSN酶和DSN酶的缓冲液，进行酶切反应；(7)PCR扩增根据cDNA上的接头序列设计引物，进行PCR扩增，富集差异表达基因；(8)克隆差异表达基因及鉴定将PCR产物直接克隆到T载体上，或者用SaII酶切后接入SaII酶切的载体上，转入大肠杆菌，构建差异表达基因富集的cDNA文库。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中已知序列TsOligo-p和Tspa如下TsOligo-p:GTAATACGACTCACTATAGGGGG-p:Tspa:TGGTTGGACTCGGTTTGGACGCCATAGAATTGGTTTTTTTTTTTTTTTVN;TsOligo-p的3'末端-畴酸化，下划线标示部分为T7启动子序列。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(2)中引物SP6T7和3'ap序列如下SP6T7:CATTTAGGTGACACTATAGAGTAATACGACTCACTATAGGG;3,ap:TGGTTGGACTCGGTTTGGACG;其中下划线标示部分为T7启动子序列。4.如权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(4)中已知的接头序列为T7启动子序列。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于步骤(4)方法如下在逆转录反应体系中，以tester3作为模板，加入引物T7oligodT,进行逆转录反应，然后加入EDTA使反应终止，在7(TC加热15分钟使逆转录酶失活，得到cDNA:RNA复合物，其中cDNA两端都加入了T7启动子序歹'J;引物T7oligodT序列如下GTAATACGACTCACTATAGGGGGTtttttTTTTTTTTTVN，其中下划线才示示部分为T7启动子序歹寸。6.如权利要求l所述的方法，其特征在于步骤(5)中杂交緩冲液终浓度组成如下0.025MTris(pH8.0)，0.5MNaCl，0.01mMEDTA,0.2M海藻糖，20%(v/v)DMSO。7.如权利要求l所述的方法，其特征在于步骤(7)方法如下以DSN酶切过的cDNA为冲莫^1,以SOI和PI为引物，进行第一4仑PCR;然后以第一轮PCR产物为模板，以PI为引物，进行第二轮PCR;最后以第二轮PCR产物为模板，以SalT7P为引物，进行第三轮PCR;所用引物序列如下SOI:CTGCAGCGAACCAATCCTCTGTAATACGACTCACTATAGGG;PI:CTGCAGCGAACCAATCCTCTG;SalT7P:GATCGTCGACGTAATACGACTCACTATAGGG;其中下划线标示部分为T7启动子序列。全文摘要本发明提供了一种双链特异性DNA酶介导的cDNA均一化消减杂交方法，依次包括第一链cDNA的合成、合成双链cDNA、转录RNA、逆转录、均一化和消减杂交、双链特异性DNA酶消化、PCR扩增、克隆差异表达基因及鉴定等步骤。与其它方法相比本发明的有益效果主要体现在(a)对共同表达基因的高消减效率，对差异表达基因的高效富集，同时表达量很低的差异表达基因可以被有效富集；(b)能够得到全长cDNA序列。文档编号C12P19/00GK101597630SQ20091009688公开日2009年12月9日申请日期2009年3月19日优先权日2009年3月19日发明者戴忠敏,杨卫军申请人:浙江大学