专利名称：预防鸭病毒性肝炎的灭活疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明属于兽医生物制品技术领域，具体涉及一种预防鸭病毒性肝炎的灭活疫苗 (细胞苗)及其制备方法。
背景技术：
养鸭业是我国水禽养殖业的重要组成部分，在我国的农业经济中占有着非常重要的地位，然而鸭病的肆虐不但制约着我国养殖业向规模化、集约化方向的迈进，而且影响着我国禽类产品的进出口等国际化多边贸易的发展，同时会给国家和地区带来巨大的社会、 经济和人类生命财产损失。鸭病毒性肝炎是鸭群的常见疾病，对雏鸭有着较大的危害。鸭病毒性肝炎的防控直接影响着我国养鸭业的发展，一直以来都是我国畜牧业生产所关注的重中之重。鸭病毒性肝炎(Duck virus hepatitis, DVH)简称鸭肝炎，是由鸭甲型肝炎病毒 (Duck hepatitis A virus, DHAV，又称鸭肝炎病毒)引起雏鸭的一种以肝脏呈现出血性炎症为特征的急性烈性传染病。本病的潜伏期为2-5d，人工感染时的潜伏期为Id。雏鸭发病时表现精神萎靡、缩头、眼半闭呈瞌睡状、不随群走动、孤立于群外或行动呆滞、常蹲卧、共济失调等，常在出现神经症状后数小时或数天死亡。有些急性病例雏鸭没有任何症状，突然倒地死亡。少数病愈雏鸭生长缓慢，达不到正常的生长体重。鸭病毒性肝炎为小RNA病毒科Avih印atovirus病毒属，无囊膜不分节段的正链 RNA病毒，无血凝性，对酸、热有较强抵抗力。该病毒RNA全长77 7799，只有一个开放阅读框，翻译产生一个含22M个氨基酸残基的多聚蛋白。因抗原性差异，DHAV可分为三个基因型，分别为DHAV-I，DHAV-2 (Taiwan)和DHAV-3 (Korea)，三个亚型之间无血清学交叉反应。目前鸭病毒性肝炎在世界多数养鸭国家均有发生和流行，我国许多养鸭的省市均有该病的流行。对鸭病毒性肝炎的防控中，目前采用康复鸭血清、高免鸭血清及免疫种鸭的卵黄抗体治疗本病可较好地控制本病流行。另外，疫苗已研制成三种氢氧化铝DHV鸡胚化弱毒苗(组织苗)、氢氧化铝DHV鸡胚化弱毒灭活苗(组织苗)及氢氧化铝DHV鸡胚化强毒灭活苗(组织苗)。从病原入手，进一步研究分子致病机理和病毒变异机理，开发相应疫苗是防控该病的关键。
发明内容
本发明的目的是提供一种预防鸭病毒性肝炎的灭活疫苗及其制备方法。本发明提供了鸭甲型肝炎病毒3 型(Duck hepatitis A virus type 3)DHAV-FS 株，是2010年10月，刘文军、周远成在北京市房山区某鸭场的发病鸭体内分离获得的一株鸭病毒性肝炎3型病毒(DHAV-3)，已于2010年12月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为 CGMCC No. 4457。鸭甲型肝炎病毒 3 型(Duck hepatitis A virus type 3) DHAV-FS ^CGMCC No. 4457简称鸭甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株。鸭甲型肝炎病毒1 型(Duck hepatitis A virus type 1) DHAV-SD 株是 2009 年 4 月，刘文军、周远成在山东省潍坊市鸭场的发病鸭体内分离获得的一株鸭病毒性肝炎I型病毒(DHAV-I)，已于2010年4月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No. 3746。 鸭甲型肝炎病毒 1 型(Duck hepatitis A virus type 1) DHAV-SD 株 CGMCC No. 3746 简称鸭甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株。本发明还保护鸭甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株在制备鸭病毒性肝炎疫苗(细胞苗)中的应用。本发明还保护鸭甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株和鸭甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株在制备鸭病毒性肝炎疫苗中的应用。本发明还保护将鸭甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株灭活得到的鸭病毒性肝炎疫苗 (细胞苗)。本发明还保护将鸭甲型肝炎病毒3型(Duck hepatitis A virus type 3)DHAV-FS 株 CGMCC No. 4457 和鸭甲型肝炎病毒 1 型(Duck hepatitis A virus type 1)DHAV_SD 株 CGMCC No. 3746灭活得到的鸭病毒性肝炎疫苗(细胞苗)。本发明还保护一种制备鸭甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株病毒液的方法，包括如下步骤将鸭甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株在宿主细胞中进行培养后破碎细胞，得到的上清即为病毒液；所述宿主细胞为BHK21细胞或DF-I细胞。所述将鸭甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株在宿主细胞中进行培养后破碎细胞，收集上清液的方法可包括如下步骤①将鸭甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株接种所述宿主细胞，进行培养后通过冻融破碎细胞，收取上清，即为生产用种毒；②将生产用种毒接种所述宿主细胞，进行培养后通过冻融破碎细胞，收取上清，即为制苗用种毒；③将制苗用种毒接种所述宿主细胞，进行培养后通过冻融破碎细胞，收集上清液。所述步骤①、步骤②和步骤③中接种所述宿主细胞时MOI均可为0. 001，培养时间均可为48-72小时；所述步骤①、步骤②和步骤③中培养时间优选为48小时；所述步骤 ③中，可通过5000rpm(Thermo legend RT离心机，角转子#333 离心30_40min收集上清液。所述宿主细胞为BHK21细胞时，在所述接种前可先进行如下扩增培养(1)将冻存的BHK21细胞37°C水浴融化，800rpm离心5min，取沉淀；用细胞培养液悬浮沉淀，得到2X IO5细胞/ml的细胞悬液，37°C,5% CO2静置培养至每毫升含有1 X IO6 MM ； (2)在步骤(1)的基础上消化细胞，然后重悬于细胞培养液中，使每毫升含有2X105 细胞，然后在如下条件下培养至每毫升含有IXlO6细胞pH7.4，溶解氧饱和度为50%、 37100转/min(Wheaton公司Micro-stir 磁力搅拌器，搅拌器货号356907 ；搅拌杆货号 356886)。所述细胞培养液具体可为95体积份的DMEM和5体积份的胎牛血清混合，加入双抗(青霉素100U/ml，链霉素100U/ml)。本发明还保护一种制备鸭病毒性肝炎疫苗(细胞苗)的方法，是将以上任一所述
4方法制备的所述病毒液作为制苗用病毒液依次进行灭活和乳化，得到鸭病毒性肝炎疫苗。所述灭活的方法具体如下在所述病毒液中加入甲醛，使甲醛的体积百分含量为 0. 1%，37°C灭活M小时，得到灭活后病毒液。所述乳化的方法具体如下将3体积份油相、 1体积份水相和(质量百分含量)硫柳汞水溶液混合，使硫柳汞的终浓度为0.01% (质量百分含量)，得到鸭病毒性肝炎疫苗；所述油相的制备方法如下将94体积份白油和6体积份司本-80混合，得到混合液，每100毫升混合液中加入1. 6 1. 8克硬脂酸铝；所述水相的制备方法如下将4体积份吐温-80和96体积份灭活后的病毒液混勻。本发明还保护另一种制备鸭病毒性肝炎疫苗(细胞苗)的方法，包括如下步骤(1)将上述方法制备的鸭甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株病毒液作为制苗用病毒液依次进行灭活和乳化，得到活性成分甲；(2)将鸭甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株的病毒液作为制苗用病毒液依次进行灭活和乳化，得到活性成分乙；(3)将活性成分甲和活性成分乙混合，得到鸭病毒性肝炎疫苗。所述灭活的方法具体如下在所述病毒液中加入甲醛，使甲醛的体积百分含量为 0. 1%，37°C灭活M小时，得到灭活后病毒液。所述乳化的方法具体如下将3体积份油相、 1体积份水相和(质量百分含量)硫柳汞水溶液混合，使硫柳汞的终浓度为0.01% (质量百分含量)，得到鸭病毒性肝炎疫苗；所述油相的制备方法如下将94体积份白油和6体积份司本-80混合，得到混合液，每100毫升混合液中加入1. 6 1. 8克硬脂酸铝；所述水相的制备方法如下将4体积份吐温-80和96体积份灭活后的病毒液混勻。本发明还保护另一种制备鸭病毒性肝炎疫苗(细胞苗)的方法，包括如下步骤将上述方法制备的鸭甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株病毒液和鸭甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株的病毒液混合后作为制苗用病毒液依次进行灭活和乳化，得到鸭病毒性肝炎疫苗。所述鸭甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株的病毒液可通过如下方法制备将鸭甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株在宿主细胞中进行培养后破碎细胞，收集上清液，该上清液即为病毒液；所述宿主细胞为BHK21细胞或DF-I细胞。所述将鸭甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株在宿主细胞中进行培养后破碎细胞，收集上清液的方法可包括如下步骤①将鸭甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株接种所述宿主细胞，进行培养后通过冻融破碎细胞，收取上清，即为生产用种毒；②将生产用种毒接种所述宿主细胞，进行培养后通过冻融破碎细胞，收取上清，即为制苗用种毒；③将制苗用种毒接种所述宿主细胞，进行培养后通过冻融破碎细胞，收集上清液。所述步骤①、步骤②和步骤③中接种所述宿主细胞时MOI均可为0. 001，培养时间均可为48-72小时；所述步骤①、步骤②和步骤③中培养时间优选为48小时；所述步骤 ③中，可通过5000rpm(Thermo legend RT离心机，角转子#333 离心30_40min收集上清液。所述宿主细胞为BHK21细胞时，在所述接种前可先进行如下扩增培养(1)将冻存的BHK21细胞37°C水浴融化，800rpm离心5min，取沉淀；用细胞培养液悬浮沉淀，得到2X IO5细胞/ml的细胞悬液，37°C,5% CO2静置培养至每毫升含有1 X IO6MM ； (2)在步骤(1)的基础上消化细胞，然后重悬于细胞培养液中，使每毫升含有2X105 细胞，然后在如下条件下培养至每毫升含有IXlO6细胞pH7.4，溶解氧饱和度为50%、 37100转/min(Wheaton公司Micro-stir 磁力搅拌器，搅拌器货号356907 ；搅拌杆货号 3568860。所述细胞培养液具体可为95体积份的DMEM和5体积份的胎牛血清混合，加入双抗(青霉素100U/ml，链霉素100U/ml)。所述灭活的方法具体如下在混合后的所述病毒液中加入甲醛，使甲醛的体积百分含量为0. 1%，37°C灭活M小时，得到灭活后病毒液。所述乳化的方法具体如下将3体积份油相、1体积份水相和(质量百分含量)硫柳汞水溶液混合，使硫柳汞的终浓度为 0.01% (质量百分含量)，得到鸭病毒性肝炎疫苗；所述油相的制备方法如下将94体积份白油和6体积份司本-80混合，得到混合液，每100毫升混合液中加入1. 6 1. 8克硬脂酸铝；所述水相的制备方法如下将4体积份吐温-80和96体积份灭活后的病毒液混勻。本发明提供的疫苗免疫雏鸭时，采用单次免疫的方式，推荐免疫剂量为0. 2mL·本发明提供的疫苗免疫种鸭时，采用单次免疫的方式，推荐免疫剂量为1ml。本发明提供了一株有优良免疫原性的鸭肝炎病毒强毒株。将该毒株接种到敏感细胞上，收获细胞液，灭活后乳化，可以得到一种安全、有效、可控的鸭病毒性肝炎灭活疫苗 (细胞苗)，有利于鸭病毒性肝炎的防控。本发明可以有针对性的防治鸭病毒性肝炎的感染与爆发，同时简化了生产工艺，可规模化生产并应用于临床。
图1为鸭甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株PCR检测结果；泳道1为阳性对照，2为鸭甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株，3为Marker5000，4为阴性对照。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复试验，结果取平均值。实施例1、鸭肝炎病毒DHAV-FS毒株的发现和鉴定一、DHAV-FS 株的发现本发明的发明人从野外某鸭场(2010年10月，在北京市房山区的鸭场，由刘文军、 周远成发现)的发病鸭体内分离获得了一株鸭病毒性肝炎3型病毒(DHAV-3)，将其命名为 DHAV-FS株，已于2010年12月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCCNo. 4457。二、DHAV-FS 株的鉴定1、病毒形态DHAV-FS株的病毒粒子呈二十面体对称，直径约40nm。2、分子生物学鉴定提取DHAV-FS的RNA，经反转录后，根据GENBANK发表的DHAV全基因序列(GU250782)设计的一对特异性引物(Pl和P2)，进行RT-PCR扩增，扩增产物为250bp的目的条带。PCR产物的电泳图见图1。测序结果如序列表的序列1所示。PCR扩增产物的序列与现有DHAV具有很高的同源性，但也有序列差异。结果表明DHAV-FS毒株为DHAV阳性。
上游引物 DHV-PGRl :5，-GGAGGTGGTGCTGAAA-3，；
下游弓丨物 DHV-PCR2 5，-CCTCAGGAACTAGTCTGGA-3，。3、血凝性DHAV-FS株对鸡、兔、猪、豚鼠红细胞均不凝集。4、对细胞的半数感染量(TCID5tl)DHAV-FS 株第 16 代的细胞毒为 107_2TCID5(1/ml、27 代的细胞毒为 107 °4TCID5(1/ml。5、对鸡胚的半数感染量(EID5tl)DHAV-FS 株第 13 代的滴度为 107· 18EID5(l/0. 2mL·6、对雏鸭的致病力测定DHAV-FS 株 3 代对雏鸭的致病力测定，滴度为 104 25ID5(1/ml，103 8°LD5(1/ml。ID50 为半数感染量，LD50为半数致死量。7、稳定性将DHAV-FS株在细胞传32代，每0. Iml病毒含量均为IO7TCID5tl以上，DHAV-FS毒株在32代以内是稳定的，可以作为疫苗生产用种毒。8、免疫原性DHAV-FS株F1 !^32均具有良好的免疫原性，利于疫苗的研究。9、特异性将DHAV-FS株稀释至104TCID5(1/ml，与等量抗鸭肝炎病毒特异性血清混合，室温放置1小时后，接种SPF鸡胚10个，观察120小时。在M 120小时内不引起特异性死亡， 且至少存活8个。实施例2、鸭病毒性肝炎疫苗(细胞苗)的制备一、鸡胚成纤维细胞系DF-I的培养鸡胚成纤维细胞系DF-I 购自北京中原公司(ATCC细胞系编号为CRL_12203)。细胞培养液9体积份的DMEM和1体积份的FBS混合，加入双抗(青霉素100U/ ml，链霉素 100U/ml)。1、细胞复苏将DF-I细胞冻存管从液氮中取出，迅速在37°C水浴锅中加温，使细胞液融化。将冻存管在台式离心机中SOOrpm离心5min，弃上清。将细胞沉淀在3ml培养基中吹打均勻 (6em直径培养皿中)，放入(X)2恒温培养箱中，37 °C、5% CO2静置培养。2、细胞传代使用电动吸引器，沿培养皿壁吸去废液。PBS清洗1-2次，吸去废液。沿培养皿壁加入胰酶，37°C消化。待到细胞形态变圆，吸去胰酶，用DMEM培养基吹打细胞，使细胞均勻悬浮于培养基中，得到细胞悬液。将细胞悬液均勻分为几份，加入到新的培养皿中，加入新的DMEM培养基，置于37°C培养。3、细胞冻存将细胞培养液置于离心管中，SOOrpm离心5min。小心弃上清，用细胞冻存液重悬细胞。将重悬好的细胞分装，每只冻存管不超过1.5ml。冻存管先置于4°C、30min，然后-20°C、2h，然后-80°C过夜，然后放入液氮罐中保存。二、病毒液的制备和TCID5tl的测定1、病毒液的制备鸭甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株接种DF-I细胞；细胞病变达80%以上时(约48 小时)，收获细胞液，反复冻融3次，收取上清(病毒液)。2、病毒液的TCID5tl测定(1)准备细胞取生长良好的DF-I细胞，消化后用10% FBS DMEM制备细胞悬液；调整细胞浓度为5 X IO5个/ml，然后加入96孔细胞培养板，0. Iml/孔。37°C、5 % CO2培养使其铺满单层。(2)准备病毒将步骤1制备的病毒液进行10倍梯度稀释。(3)病毒液的TCID5tl测定96孔板中细胞长满单层后，将培养液吸出，加入病毒稀释液，每个梯度8-16孔，每孔0. lml,37°C,5% CO2培养96小时后观察病变孔数并记录。各个稀释度的CPE结果见表 1。表1各个稀释度的CPE结果
权利要求
1.鸭甲型肝炎病毒3型(Duckhepatitis A virus type 3) DHAV-FS株，其保藏号为 CGMCC No. 4457。
2.鸭甲型肝炎病毒3型(Duck h印atitis A virus type 3)DHAV-FS株CGMCC No. 4457 在制备鸭病毒性肝炎疫苗中的应用。
3.鸭甲型肝炎病毒3型(Duck h印atitis A virus type 3)DHAV-FS株CGMCC No. 4457 和鸭甲型肝炎病毒 1 型(Duck hepatitis A virus type 1) DHAV-SD 株 CGMCC No. 3746 在制备鸭病毒性肝炎疫苗中的应用。
4.将鸭甲型肝炎病毒3 型(Duck hepatitis A virus type 3)DHAV-FS 株 CGMCCNo. 4457灭活得到的鸭病毒性肝炎疫苗。
5.将鸭甲型肝炎病毒3 型(Duck hepatitis A virus type 3)DHAV-FS 株 CGMCCNo. 4457 和鸭甲型肝炎病毒 1 型(Duck hepatitis A virus type 1)DHAV-SD ^ CGMCCNo. 3746灭活得到的鸭病毒性肝炎疫苗。
6.制备鸭甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株病毒液的方法，包括如下步骤将鸭甲型肝炎病毒 3 型(Duck hepatitis A virus type 3) DHAV-FS 株 CGMCC No. 4457 在宿主细胞中进行培养后破碎细胞，收集上清液，该上清液即为病毒液；所述宿主细胞为BHK21细胞或DF-I 细胞。
7.一种制备鸭病毒性肝炎疫苗的方法，是将权利要求6所述方法制备的鸭甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株病毒液作为制苗用病毒液依次进行灭活和乳化，得到鸭病毒性肝炎疫苗。
8.一种制备鸭病毒性肝炎疫苗的方法，包括如下步骤(1)将权利要求6所述方法制备的鸭甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株病毒液作为制苗用病毒液依次进行灭活和乳化，得到活性成分甲；(2)将鸭甲型肝炎病毒1 型(Duck hepatitis A virus type 1)DHAV-SD 株 CGMCCNo. 3746的病毒液作为制苗用病毒液依次进行灭活和乳化，得到活性成分乙；(3)将活性成分甲和活性成分乙混合，得到鸭病毒性肝炎疫苗。
9.一种制备鸭病毒性肝炎疫苗的方法，包括如下步骤将权利要求6所述方法制备的鸭甲型肝炎病毒3型DHAV-FS株病毒液和鸭甲型肝炎病毒1型(Duck hepatitis Avirus type 1)DHAV-SD株CGMCC No. 3746的病毒液混合后作为制苗用病毒液依次进行灭活和乳化，得到鸭病毒性肝炎疫苗。
10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于所述鸭甲型肝炎病毒1型(Duck hepatitis A virus type 1) DHAV-SD株CGMCC No. 3746的病毒液是通过如下方法制备的 将鸭甲型肝炎病毒 1 型(Duck hepatitis A virus type 1) DHAV-SD 株 CGMCCNo. 3746 在宿主细胞中进行培养后破碎细胞，收集上清液，该上清液即为病毒液；所述宿主细胞为BHK21 细胞或DF-I细胞。
全文摘要
本发明公开了一种预防鸭病毒性肝炎的灭活疫苗及其制备方法。本发明提供了鸭甲型肝炎病毒3型(Duck hepatitis A virus type 3)DHAV-FS株，CGMCC No.4457。本发明提供的毒株为具有优良免疫原性的鸭肝炎病毒强毒株。将该毒株接种到敏感细胞上，收获细胞液，灭活后乳化，可以得到一种安全、有效、可控的鸭病毒性肝炎灭活疫苗(细胞苗)，有利于鸭病毒性肝炎的防控。本发明可以有针对性的防治鸭病毒性肝炎的感染与爆发，同时简化了生产工艺，可规模化生产并应用于临床。
文档编号C12N7/00GK102174476SQ201010611929
公开日2011年9月7日 申请日期2010年12月29日 优先权日2010年12月29日
发明者刘文军, 周远成, 孙蕾, 李晶, 毕玉海 申请人:中国科学院微生物研究所