一种百合定向活体转化液及其转化方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物转基因技术领域，特别设及一种百合定向转化液，还设及一种百 合定向转化方法。
【背景技术】
[0002] 百合是百合科百合属多年生草本球根植物，原产于中国，W其蛟美的花姿与百年 好合的寓意，深受人们的喜爱，尤其是在婚礼插花上，百合的应用更为普遍。
[0003] 然而目前的百合品种已经不能满足人们的需求，百合自然突变概率不高且突变方 向不可控，定向转基因技术可根据人们需求定向改造百合基因，培养新品种，满足人们的需 求。但是常规转基因技术操作复杂、成本高、耗时长，不利于大规模转化。
【发明内容】
[0004] 基于现有技术存在上述问题，本发明提供一种百合定向活体转化液及其转化方 法，转化液由农杆菌工程菌液、Silwet L-77、薦糖、乙酷下香酬、吐溫、蓝替浸提液组成，转 化方法包括W下步骤:转化液的制备、活体转化、农杆菌与花芽共培养、抗性花芽筛选、基因 检测。本发明提供的技术方案具有操作简单、成本低、耗时短、转化率高的优点。
[0005] -种百合定向活体转化液，其由农杆菌工程菌液、Silwet L-77、薦糖、乙酷下香 酬、吐溫、蓝替浸提液组成，Silwet心77和吐溫可增加农杆菌在花芽上的覆盖率，乙酷下香 酬与植物细胞壁上的特异单糖可协同诱导农杆菌的Ti质粒上的vir基因表达，促进农杆菌 转化百合花芽。
[0006] 农杆菌工程菌液为自行制备，将保存在-80°C的农杆菌工程菌划线培养于含卡那 霉素的YEP培养基中，28°C暗培养2-3天，待菌落长出后挑取单菌落接种于50ml含有卡那霉 素和利福平的YEP液体培养基中，于28°C、220r/min振荡培养至对数生长期即可制成农杆菌 工程菌液，处于对数生长期的农杆菌活力最高，有利于提高转化成功率。
[0007] 蓝替浸提液为自行制备，将蓝替与等体积水混合，棒汁，过滤灭菌即可制得蓝替浸 提液，蓝替浸提液具有大量花青素，花青素为酪类物质，可聚集和引导农杆菌并促进转化过 程，提高转化成功率。
[000引 SiIwet k77的体积浓度为0.03%-0.05%，吐溫的体积浓度为0.03%-0.06%，薦糖的 浓度为200 -400 mg/L，乙酷下香酬的浓度为18-20 mg/L，蓝替浸提液浓度为2-4ml/L。
[0009] -种百合定向活体转化方法，其包括W下步骤： S010转化液的准备：向农杆菌工程菌液加入Silwet L-77、薦糖、乙酷下香酬、吐溫和蓝 替浸提液、卡那霉素、利福平制成转化液； S020活体转化:选取刚长出的花芽，控制花芽表层平均溫度为20-23°C，向花芽洒上无 菌水，保持其湿度为75%-80%，用医用注射器将花芽轻轻刺伤，并注射步骤S010配制的转化 液； S030农杆菌与花芽共培养:用浸泡过转化液的医用棉花覆盖转化后的花芽，并将转化 植株置于溫度为20-23°C、湿度为75%-80%的溫室下培养3-5天； S040抗性花芽筛选:在共培养结束后向花芽喷洒利福平和卡那霉素，筛选出成功转化 并能正常分离分化的抗性花芽，将转化成功植株按常规百合栽培方法进行水肥管理； S050基因检测:将抗性花芽进行基因检测，检测结果为阳性的即为转基因植株。
[0010] 步骤S010转化液的制备中，在制备转化液前进行步骤son农杆菌工程菌液基因检 测，检测结果为阳性即可继续进行步骤S010转化液的制备。
[0011] 步骤son农杆菌工程液基因检测方法是PCR鉴定，还可W是GUS染色鉴定。
[0012] 步骤S050基因检测所使用的检测方法是PCR鉴定，还可W是GUS染色鉴定。
【具体实施方式】
[0013] 下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步描述。
[0014] 实施例一:一种百合定向转化液的制备。
[0015] 从-80°C超低溫冰箱中取出保存的农杆菌工程菌，划线培养于含lOOg/L卡那霉素 的YEP培养基中，28°C暗培养2天，待菌落长出后，挑取单菌落接种于50ml含有lOOg/L卡那霉 素和40g/L利福平的YEP液体培养基中，于28°C、220r/min振荡培养至ODsqq值为0.8时，即农 杆菌达到对数生长期，制成农杆菌工程菌液，备用。
[0016] 向农杆菌工程菌液按相应浓度加入如下成分： Silwet L-77,体积浓度为0.04% ;吐溫，体积浓度为0.05%;薦糖，浓度为300 111邑/1;乙 酷下香酬，浓度为19 mg/l;蓝替浸提液，浓度为3ml/L。
[0017] 将加入各成分的农杆菌工程菌液轻轻摇匀即成百合定向转化液，备用。
[0018] 实施例二:百合定向转化。
[0019] 准备转化液:按实施例一的方法配制百合定向转化液，取少量转化液进行PCR增值 和琼脂凝胶电泳检测，鉴定农杆菌工程菌液是否含有目的基因，检测结果呈阴性则重新配 制转化液，检测结果呈阳性则向百合定向转化液加入lOOg/L卡那霉素和40g/L利福平。
[0020] 活体转化:选取刚长出7-8天的小花芽，通过控制环境溫度而控制花芽表层平均溫 度为20-23°C，向花芽洒上无菌水，保持其湿度为75%-80%，用医用注射器将花芽轻轻刺伤， 并注射上述已经准备好的转化液。
[0021] 农杆菌与花芽共培养：用浸泡过转化液的医用棉花覆盖转化后的花芽，并将转化 植株置于溫度为20-23°C、湿度为75%-80%的溫室下培养4天。
[0022] 抗性花芽筛选:在共培养结束后向花芽喷洒120g/L利福平和300g/L卡那霉素，筛 选出成功转化并能正常分离分化的抗性花芽，将转化成功植株移至正常百合栽培溫室中， 遮阳保湿条件下培养2天，再按常规百合栽培方法进行水肥管理。
[0023] 基因检测:在通过抗性筛选的花芽中取少量组织，提取其DNA，并进行PCR增值和琼 脂凝胶电泳检测，检测结果为阳性的即为转基因植株，可继续栽培。
[0024] 实施例Ξ:百合定向转化对比实验。
[0025] 根据表一百合定向转化液配方，按实施例一的方法配制百合定向转化液，按实施 例二的方法对百合花芽进行转化，并记录转化率。
[0026] 表一百合定向转化液及转化结果
注:表中"+"代表添加该成分，代表不添加该成分。
[0027]从表一的结果中可W看出试验组4,即使用本发明提供的百合定向活体转化液进 行百合活体转化可W有效提高转化率，可达到30.21%，从对照组2-3和试验组1相比可W看 出Silwet心77和吐溫同时使用可有效提高转化率。另外本发明提供的转化方法采用花芽 作为转化材料进行活体转化，无需进行无菌操作，操作简单，同时相比于采用愈伤组织作为 转化材料进行转化的方法所耗费的时间更少。
【主权项】
1. 一种百合定向活体转化液，其特征在于，其由农杆菌工程菌液、Si lwet L-77、蔗糖、 乙酰丁香酮、吐温、蓝莓浸提液组成。2. 根据权利要求1所述的一种百合定向活体转化液，其特征在于，所述的农杆菌工程菌 液为自行制备，将保存在_80°C的农杆菌工程菌划线培养于含卡那霉素的YEP培养基中，28 °C暗培养2-3天，待菌落长出后挑取单菌落接种于50ml含有卡那霉素和利福平的YEP液体培 养基中，于28°C、220r/min振荡培养至对数生长期即可制成农杆菌工程菌液。3. 根据权利要求1所述的一种百合定向活体转化液，其特征在于，所述的蓝莓浸提液为 自行制备，将蓝莓与等体积水混合，榨汁，过滤灭菌即可制得蓝莓浸提液。4. 根据权利要求1所述的一种百合定向活体转化液，其特征在于，所述的Silwet L-77 的体积浓度为0.03%-0.05%，吐温的体积浓度为0.03%-0.06%，蔗糖的浓度为200 -400 mg/ L，乙酰丁香酮的浓度为18-20 mg/L，蓝莓浸提液浓度为2-4ml/L。5. -种百合定向活体转化方法，其特征在于，其包括以下步骤： S010转化液的准备：向农杆菌工程菌液加入Si lwet L-77、蔗糖、乙酰丁香酮、吐温和蓝 莓浸提液、卡那霉素、利福平制成转化液； S020活体转化:选取刚长出的花芽，控制花芽表层平均温度为20-23°C，向花芽洒上无 菌水，保持其湿度为75%-80%，用医用注射器将花芽轻轻刺伤，并注射步骤S010配制的转化 液； S030农杆菌与花芽共培养：用浸泡过转化液的医用棉花覆盖转化后的花芽，并将转化 植株置于温度为20_23°C、湿度为75%-80%的温室下培养3-5天； S040抗性花芽筛选:在共培养结束后向花芽喷洒利福平和卡那霉素，筛选出成功转化 并能正常分离分化的抗性花芽，将转化成功植株按常规百合栽培方法进行水肥管理； S050基因检测:将抗性花芽进行基因检测，检测结果为阳性的即为转基因植株。6. 根据权利要求5所述的一种百合定向活体转化方法，其特征在于，其所述的步骤S010 转化液的制备中，在制备转化液前进行步骤S011农杆菌工程菌液基因检测，检测结果为阳 性即可继续进行步骤S010转化液的制备。7. 根据权利要求6所述的一种百合定向活体转化方法，其特征在于，其所述的步骤S011 农杆菌工程液基因检测方法是PCR鉴定，还可以是⑶S染色鉴定。8. 根据权利要求5所述的一种百合定向活体转化方法，其特征在于，其所述的步骤S050 基因检测所使用的检测方法是PCR鉴定，还可以是⑶S染色鉴定。
【专利摘要】本发明提供一种百合定向活体转化液及其转化方法，属于植物转基因技术领域，其中转化液由农杆菌工程菌液、Silwet？L-77、蔗糖、乙酰丁香酮、吐温、蓝莓浸提液组成，转化方法包括以下步骤：转化液的制备、活体转化、农杆菌与花芽共培养、抗性花芽筛选、基因检测。本发明提供的技术方案具有操作简单、成本低、耗时短、转化率高的优点。
【IPC分类】C12N15/82, A01H5/00
【公开号】CN105543272
【申请号】CN201610010913
【发明人】何志铿
【申请人】佛山市金蓝领教育科技有限公司
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年1月9日