一种检测柯萨奇病毒a6、a10型的荧光定量试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种检测柯萨奇病毒A6、A10型的荧光定量试剂盒，由定量RT-PCR反应液、酶混合液、引物探针混合液、CVA6和CVA10标准品、CVA6和CVA10强阳性对照品、CVA6和CVA10弱阳性对照品、阴性对照品组成。本发明运用一步法实时荧光定量RT-PCR技术，采用CVA6和CVA10高度特异的引物和荧光标记探针，从粪便标本中同时检测出是否有CVA6和CVA10的存在，比单重荧光定量PCR方法更便捷迅速、节约成本。检测实时、准确定量，为临床提供早期诊断，为临床治疗方案的制定提供参考依据；可应用于柯萨奇病毒A6、A10型引起暴发疫情的实验室应急诊断、快速筛查、临床诊断及手足口病的流行病学的研究。
【专利说明】—种检测柯萨奇病毒A6、Al O型的荧光定量试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属生物【技术领域】，涉及荧光定量RT-PCR检测试剂盒，具体涉及一种一步法双重实时突光定量RT-PCR在同一个反应管内检测患者粪便标本中柯萨奇病毒A6、AlO型的核酸检测方法，可应用于柯萨奇病毒A6、AlO型引起暴发疫情的实验室应急诊断、快速筛查、临床诊断及手足口病的流行病学的研究。
【背景技术】
[0002]手足口病(hand,foot and mouth disease, HFMD)是由人类肠道病毒(humanenterovirus,
HEV)引起的一类儿童常见传染病。人类肠道病毒目前共有90多种基因型，分为A、B、C、D共4个组，其中最主要的病原体是HEV-A组中的肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(Coxsackie virus A16，CVA16)。但越来越多的研究表明，HEV中的一些其他血清型，如 CVA6、CVA10, CVA2、CVA5 型等也可引起 HFMD。
[0003]柯萨奇病毒A6 型(Coxsackie virus A6, CVA6)和柯萨奇病毒 AlO 型(Coxsackievirus A10, CVA10)均属于人类肠道病毒A组，近年来在欧洲及我国周边部分国家爆发的手足口病疫情中，柯萨奇病毒A6型和柯萨奇病毒AlO型多次被作为主要致病病原体检出。2008年，芬兰爆发了以柯萨奇病毒A6、A10型为主的手足口病。2010年，法国手足口致病病原调查中，柯萨奇病毒AlO和A6型的比例远远超过EV71和柯萨奇病毒A16型。而近年来，一些亚洲国家如新加坡、泰国、日本等也相继爆发了以柯萨奇病毒A6为主的手足口疾病疫情，其中柯萨奇病毒AlO型也占了一定的比例。在我国，2009年至2011年在山东、河南、重庆三省市展开的一项手足口病调查显示:柯萨奇病毒AlO型和A6型仅次于EV71和柯萨奇病毒A16型，位居第三、四位。2012年，深圳市的手足口病调查中，柯萨奇病毒A6型和AlO型仅次于EV71和柯萨奇病毒A16型，位居第三、四位。而在我们实验室开展的2013年部分月份手足口病原调查中，柯萨奇病毒A6型和AlO型占到了极高的比例。目前我国的手足口病病原诊断市场，仍然以检测肠道病毒通用型或肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型为主，导致手足口病病原体检测不明确或漏检等，造成患者治疗的延误及诊断试剂的浪费等。因而开发一种针对柯萨奇病毒A6型和柯萨奇病毒AlO型病原检测的诊断试剂迫在眉睫。
[0004]实时荧光定量PCR技术以其全封闭单管扩增、简便快捷、重复性好、实时定量、污染少等优势，克服了以往临床诊断的缺陷，具有高度的特异性和敏感性，为临床诊断提供了准确可靠的实验室依据，可作为一种临床病原诊断的有效、快速的检测手段。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种检测柯萨奇病毒A6、AlO型的荧光定量试剂盒，是一种用于柯萨奇病毒A6型和柯萨奇病毒AlO型检测的一步法双重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。本试剂盒包含定 量RT-PCR反应液、酶混合液、引物探针混合液、标准品(CVA6、CVA10)、强阳性对照品(CVA6、CVAIO )、弱阳性对照品(CVA6、CVAIO )、阴性对照品。[0006]其中定量RT-PCR反应液包含有PCR反应缓冲液、氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物，酶混合液含耐热Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制剂和MMLV逆转录酶，引物探针混合液包含CVA6、CVAlO两组特异性引物和相应的CVA6、CVAlO两种不同荧光标记的特异性探针，阴性对照为高温高压灭菌的DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水，CVA6、CVAlO强阳性对照品和CVA6.CVA10弱阳性对照品为包含CVA6、CVA10的保守区基因序列的阳性质粒样品。弓丨物探针混合液需保存在棕色管。
[0007]双重荧光定量RT-PCR检测用上游引物和下游引物以及相应的特异性探针序列如下:
上游引物 CVA6-F: 5 ’ - AARCCRGATAGYAGGAAATC-3，
下游引物 CVA6-R:5’ - GGGGTGGATCACTCAAITTTG-3’
特异性探针 CVA6-P: 5’-FAM- CAATGGCAGACTGCYACYAAYCCGTCG-BHQ1-3’
上游引物 CVAIO-F: 5 ’ - GAGACTGGACGYGTRCCA-3，
下游引物 CVA10-R: 5’- GGGTYTCAATCATGTTYTCATCTG-3’
特异性探针 CVAlO-P: 5’-HEX- CAGAGACRGGTGCCACWTCTAAYGCC-BHQ1-3’
其中CVA6、CVAlO的特异性探针分别采用FAM、HEX两种不同荧光标记。
[0008]上述CVA6、CVAlO标 准品的保守区基因序列如下:
CVA6标准品序列为:
GTATGTACCACCAGGGGCCCCTAAACCGGATAGTAGGAAATCATACCAATGGCAGACTGCTACTAACCCGTCGGTATTCGCAAAATTGAGTGATCCACCCCCCCAGGTGTCTGTCCCGTTCATCVAlO标准品序列为:
CCACTCCCAGTTCACACCGATTAGAGACTGGACGCGTGCCAGCGCTACAGGCTGCAGAGACGGGTGCCACTTC
TAATGCCACAGATGAGAACATGATTGAAACCCGTTGTGTGGTTAACAGAA
本发明提供的荧光定量试剂盒需于_20°C储存，尽量减少反复冻融；引物探针混合液需避光条件保存。
[0009]本发明的另一个目的是提供上述的一步法双重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，应用于柯萨奇病毒A6型和柯萨奇病毒AlO型的核酸检测。
[0010]本发明试剂盒的使用方法:在每次标本检测中均应设立阳性对照和阴性对照。标准品用 TaKaRa 公司的 Easy Dilution (货号:9160)稀释为 I X IO2-1 X 107copies/ml。
[0011]粪便样本核酸的提取:取0.2g粪便样本加到EP管中，加入1.5ml的生理盐水，震荡混匀3次，每次10s，然后室温静置lOmin，以8000r/min离心5min。吸取200 ml上清加入到EP管中，进行核酸提取。核酸提取采用Geneaid公司的Viral Nucleic Acid extractionKitII或QIAGEN公司的QIAamp Viral RNA Mini KU，按照试剂盒说明书进行提取，取5ul已抽提的待测样品核酸作为模板。
[0012]核酸的检测:取5ul已抽提的待测样品核酸作为模板。反应总体积为2ο μ?其中定量RT-PCR反应液12.5 μ?,酶混合液I μ?，引物探针混合液(20 μ mol/L,包含两组特异性引物和相应的两种荧光探针)共3 μ?模板5 μ?,加水补足至2.) μ?在ΑΒΙ7500荧光定量PCR仪(或者其他双色荧光及以上的PCR仪)上进行检测，反应参数为:反转录50°C，30min ；95°C5min热启动，然后95°C 15s，55°C 45s，在55°C进行双重荧光检测，共进行40个循环。
[0013]突光定量结果报告:①柯萨奇病毒A6型、柯萨奇病毒AlO型检测的各自Ct值对应相应的荧光标记的病毒，检测样本CT值为40、0和无数值时，报告为阴性。②检测样本Ct值< 35时,报告为相应病毒阳性。③检测样本Ct值> 35且小于40的样本,建议复检，复检结果Ct值< 38者，依据②的判断标准报告为相应病毒阳性。根据所获得的标准曲线，计算待测标本柯萨奇病毒A6型或者柯萨奇病毒AlO型的病毒量(copies/ml)。
[0014]本研究针对柯萨奇病毒高度保守且型间存在较大差异的VPl蛋白分别设计柯萨奇病毒A6型和柯萨奇病毒AlO型高特异性的引物探针。采用单管一步法双重实时荧光定量RT-PCR,能够单管内一次反应同时检测出柯萨奇病毒A6型或/和柯萨奇病毒AlO型,不仅极大的节省了试剂耗材，缩短了检测时间，同时具有极高的特异性和灵敏度。
[0015]本发明运用一步法实时荧光定量RT-PCR技术，采用柯萨奇病毒A6型和柯萨奇病毒AlO型高度特异的引物和荧光标记探针，研制用于柯萨奇病毒A6型和柯萨奇病毒AlO型检测的双重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。该发明是通过一个PCR反应，可以从粪便标本中同时检测出是否有柯萨奇病毒A6型和柯萨奇病毒AlO型的存在，比单重荧光定量PCR方法更便捷迅速、节约成本。同时，对检测的病毒进行实时准确定量，根据病毒感染的滴度，为临床上患者提供早期诊断，为临床治疗方案的制定提供参考依据；可应用于柯萨奇病毒A6、AlO型引起暴发疫情的实验室应急诊断、快速筛查、临床诊断及手足口病的流行病学的研究。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为本试剂盒检测柯萨奇病毒A6型的灵敏度，从左到右(1-6)依次为107、106、ΙΟ5、ΙΟ4、103、102copies/ml。
[0017]图2为本试剂盒柯萨奇病毒A6型标准品实时荧光定量RT-PCR产物凝胶电泳示意图，电泳条带大小约77bp,其中Lane M为DL2000 Marker , Lane 1-6分别为柯萨奇病毒A6型标准品(107COpieS/ml)十倍梯度稀释后实时荧光定量RT-PCR产物，Lane 7为阴性对照。
[0018]图3为本试剂盒柯萨奇病毒A6型标准品实时荧光定量RT-PCR标准曲线。
[0019]图4为本试剂盒检测柯萨奇病毒AlO型的灵敏度，从左到右(1-6)依次为107、106、ΙΟ5、ΙΟ4、103、IO2 copies/ml。
[0020]图5为本试剂盒柯萨奇病毒AlO型标准品实时荧光定量RT-PCR产物凝胶电泳示意图，电泳条带大小约81bp,其中Lane M为DL2000 Marker, Lane 1-6分别为柯萨奇病毒AlO型标准品(107COpieS/ml)十倍梯度稀释后实时荧光定量RT-PCR产物，Lane 7为阴性对照。
[0021]图6为本试剂盒柯萨奇病毒AlO型标准品实时荧光定量RT-PCR标准曲线。【具体实施方式】
[0022]下面具体实施例结合附图对本发明进行进一步阐述本发明，但这些实施例仅限于说明本发明而不限制本发明的范围。
[0023]实施例1
一种检测柯萨奇病毒A6、AlO型的双重实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包含:定量RT-PCR反应液、酶混合液、引物探针混合液、标准品(CVA6、CVA10)、强阳性对照品(CVA6、CVAIO )、弱阳性对照品(CVA6、CVAIO )、阴性对照品。[0024]其中定量RT-PCR反应液包含有PCR反应缓冲液、氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物，酶混合液含耐热Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制剂和MMLV逆转录酶，引物探针混合液包含CVA6、CVAlO两组特异性引物和相应的CVA6、CVAlO两种不同荧光标记的特异性探针，阴性对照为高温高压灭菌的DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水，CVA6、CVAlO强阳性对照品和CVA6、CVA10弱阳性对照品为包含CVA6、CVA10的保守区基因序列的阳性质粒样品。强阳性对照品质粒浓度为106copies/ml,弱阳性对照品质粒浓度为103copies/ml。引物探针混合液管需保存在棕色管。
[0025]双重荧光定量RT-PCR检测用上游引物和下游引物以及相应的特异性探针序列如下:
上游引物 CVA6-F: 5 ’ - AARCCRGATAGYAGGAAATC-3，，
下游引物 CVA6-R:5’ - GGGGTGGATCACTCAAITTTG-3’，
特异性探针 CVA6-P: 5’-FAM- CAATGGCAGACTGCYACYAAYCCGTCG-BHQ1-3’，
上游引物 CVAIO-F: 5 ’ - GAGACTGGACGYGTRCCA-3，，
下游引物 CVA10-R: 5’- GGGTYTCAATCATGTTYTCATCTG-3’，
特异性探针 CVAlO-P: 5’-HEX- CAGAGACRGGTGCCACWTCTAAYGCC-BHQ1-3’。
[0026]其中CVA6、CVAlO的特异性探针分别采用FAM、HEX两种不同荧光标记。
[0027]上述标准品包括CVA6、CVAlO标准品，其保守区基因序列如下:
CVA6标准品序列为:
GTATGTACCACCAGGGGCCCCTAAACCGGATAGTAGGAAATCATACCAATGGCAGACTGCTACTAACCCGTCG
GTATTCGCAAAATTGAGTGATCCACCCCCCCAGGTGTCTGTCCCGTTCAT。
[0028]CVAlO标准品序列为: CCACTCCCAGTTCACACCGATTAGAGACTGGACGCGTGCCAGCGCTACAGGCTGCAGAGACGGGTGCCACTTC
TAATGCCACAGATGAGAACATGATTGAAACCCGTTGTGTGGTTAACAGAA。
[0029]本发明提供的荧光定量试剂盒需于_20°C储存，尽量减少反复冻融；引物探针混合液需避光条件保存。
[0030]实施例2 I材料与方法
1.1临床标本与病毒核酸:
柯萨奇病毒A6、AlO型的临床样本来源于浙江大学医学院附属第一医院及浙江省内其他几家医院手足口病确诊患者及疑似患者的粪便标本，样本采集后运送至实验室。另外，其他肠道病毒如肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型、柯萨奇病毒A2型、柯萨奇病毒A5型、柯萨奇病毒BI型、柯萨奇病毒B3型、埃克病毒30型，及甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒、博卡病毒的阳性核酸由传染病诊治国家重点实验室提供。
[0031]1.2引物与探针
从NCBI基因库下载了涵盖国内外柯萨奇病毒A6、A10型的多条基因序列。利用DNAman软件对其进行同源性比较，确定以上病毒基因组的保守区。使用Primer Express 3.0软件在其保守区设计高度特异性的引物与Taqman探针，引物和探针序列均通过Blast验证，具有较好特异性。引物和探针序列如下，:
上游引物 CVA6-F: 5 ’ - AARCCRGATAGYAGGAAATC-3，，下游引物 CVA6-R:5’ - GGGGTGGATCACTCAAITTTG-3’，
特异性探针 CVA6-P: 5’-FAM- CAATGGCAGACTGCYACYAAYCCGTCG-BHQ1-3’，
上游引物 CVAIO-F: 5 ’ - GAGACTGGACGYGTRCCA-3，，
下游引物 CVA10-R: 5’- GGGTYTCAATCATGTTYTCATCTG-3’，
特异性探针 CVAlO-P: 5’-HEX- CAGAGACRGGTGCCACWTCTAAYGCC-BHQ1-3’，
以上引物和探针委托生工生物工程(上海)有限公司合成。
[0032]1.3病毒核酸的提取与标准品定量标准:
取0.2g粪便样本加到EP管中，加入1.5ml的生理盐水，震荡混匀3次，每次10s，然后室温静置IOmin,以8000r/min离心5min。吸取200 μ?上清加入到EP管中，采用Geneaid公司的 Viral Nucleic Acid extraction KitII 或 QIACjEN 公司的 Rneasy Mini Kit,按照试剂盒说明书进行提取，取5ul已抽提的待测样品核酸作为模板。
[0033]合成各基因标准品片段，将其连接到质粒载体pMDTM19-T Simple VectorCTaKaRa公司)。转化后培养。鉴定后提取质粒DNA,利用NanoDrop ND-2000 Spectrophotometer测量质粒DNA的浓度，确定DNA的拷贝数作为标准品定量母液。根据实验需要，将标准品定量母液稀释至所需最高浓度，并做十倍稀释至最低浓度，低温保存备用。
[0034]1.4双重实时荧光定量 RT-PCR反应体系和条件的优化:
反应总体积为^ μ?其中定量RT-PCR反应液12 3 μ?酶混合液I μ?,引物探针混合液(20 μ mol/1，包含两种病毒的特异性引物和相应的两种荧光探针)共3.0 μ?,模板5 μ?, DEPC水补足至25 μ?。在ΑΒΙ7500荧光定量PCR仪上进行检测，反应参数为:反转录50°C，30min ；95°C 5min热启动，然后95°C 15s，55°C 45s，在55°C进行四重荧光检测，共进行40个循环。结果判断:选择荧光检测模式FAM、HEX荧光基线调整取3-15个循环的荧光信号平均值，阈值设定以阈值线刚好超过阴性对照品的最高点，样本呈典型的扩增曲线，判断为阳性。无典型的扩增曲线，判断为阴性。体系的优化试验，在以相同浓度阳性核酸为模板的反应体系中，引物浓度从I~20 μ M，探针浓度从I~20 μ Μ，采用矩阵法优选引物和探针的最佳浓度，根据最低Ct值和最高荧光强度增加值(ARn)选择最佳引物和探针浓度。
[0035]1.5双重实时荧光定量RT-PCR特异性、敏感性和重复性试验
分别选择柯萨奇病毒Α6型和柯萨奇病毒AlO型的阳性核酸(均通过基因测序鉴定)和其他肠道病毒如肠道病毒71型、柯萨奇病毒Α16型、柯萨奇病毒Α2型、柯萨奇病毒Α5型、柯萨奇病毒BI型、柯萨奇病毒Β3型、埃克病毒30型，及甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒、博卡病毒的阳性核酸，用双重实时荧光定量RT-PCR验证本方法的特异性；对已标定拷贝数(copies/ml)的柯萨奇病毒A6型合成片段(107copies/ml)和柯萨奇病毒AlO型合成片段(107copies/ml)分别稀释后，平行进行荧光PCR反应，比较其灵敏度。此外，对每一个指定浓度的阳性核酸稀释液作3次重复检测，得到的Ct值计算其标准差和变异系数，验证该方法的重复性。
[0036]1.6双重实时荧光定量RT-PCR标准曲线的建立
将已标定拷贝数(copies/ml)的柯萨奇病毒A6型标准品(107copies/ml)、柯萨奇病毒AlO型标准品(107copies/ml)分别十倍梯度稀释至102copies/ml。分别以此为模板用本试剂盒进行实时荧光定量PCR扩增后，以标准品浓度的对数值为X轴，循环数为Y轴，绘制标准曲线。[0037]2 结果
2.1双重实时荧光定量RT-PCR反应体系及条件
该方法的反应总体积为29 μ?其中定量RT-PCR反应液12.5μ1，酶混合液I μ?，引物探针混合液(20 μ mol/Ι，包含两组特异性引物和相应的两种荧光探针)共3μ1模板5 |il，DEPC水补足至25 μ?。在ΑΒΙ7500荧光定量PCR仪上进行检测，反应参数为:反转录50°C，30min ；95°C 5min热启动，然后95°C 15s，55°C 45s，在55°C进行三重荧光检测，共进行40个循环。可获得最低Ct值和最高荧光强度。
[0038]2.2特异性试验
本发明建立的一步法双重荧光定量RT-PCR方法对柯萨奇病毒A6型和柯萨奇病毒AlO型具有极好的特异性，能完全检出近期采集的临床阳性标本。本发明中的双重引物探针与其他肠道病毒如肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型、柯萨奇病毒A2型、柯萨奇病毒A5型、柯萨奇病毒BI型、柯萨奇病毒B3型、埃克病毒30型，及甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒、博卡病毒的阳性核酸均无交叉反应。
[0039]2.3敏感性试验
对柯萨奇病毒A6型和柯萨奇病毒AlO型敏感性检测试验，将已标定拷贝数(copies/ml)的柯萨奇病毒A6型合成片段(107copies/ml )、柯萨奇病毒AlO型合成片段(IO7Copies/ml)分别十倍梯度稀释后，用本试剂盒进行检测，结果该方法检测敏感性分别达到102、102copies/ml。结果参见图1、图4。取实时荧光定量RT-PCR产物3 μ?, 120V恒压电泳20min，凝胶成像系统拍照。结果参见图2、图5。其中Lane M为DL2000 Marker7Lane 1-6分别为片段(108COpieS/ml)十倍梯度稀释后实时荧光定量RT-PCR产物，Lane 7为阴性对照。，电泳条带单一，亮度梯度分明，说明本试剂特异性好，定量结果相对准确。
[0040]2.4重复性试验
分别取柯萨奇病毒A6型合成片段(终浓度为106COpieS/ml )、柯萨奇病毒AlO型合成片段(106copies/ml)按10倍梯度稀释成3个不同的浓度，对每一个浓度的样本作3个重复检测，结果不同核酸浓度各自的检测Ct值标准差在0.122~0.375之间，变异系数均低于
1.38%，具有较好的重复性(结果见表1)。
【权利要求】
1.一种检测柯萨奇病毒A6、A10型的荧光定量试剂盒，其特征在于，由定量RT-PCR反应液、酶混合液、引物探针混合液、CVA6标准品、CVAlO标准品、CVA6强阳性对照品、CVAlO强阳性对照品、CVA6弱阳性对照品、CVAlO弱阳性对照品、阴性对照品组成；其中定量RT-PCR反应液有PCR反应缓冲液、氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物，酶混合液含耐热Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制剂和MMLV逆转录酶，引物探针混合液包含CVA6、CVA10两组特异性引物和相应的CVA6、CVAlO两种荧光标记的特异性探针，阴性对照为高温高压灭菌的焦碳酸二乙酯处理水，CVA6、CVAlO强阳性对照品和CVA6、CVAlO弱阳性对照品为包含CVA6、CVAlO的保守区基因序列的阳性质粒样品； 特异性引物及特异性探针序列如下:
2.一种检测柯萨奇病毒A6、AlO型的荧光定量试剂盒，其特征在于，CVA6、CVAlO的特异性探针分别采用FAM、HEX两种荧光标记。
3.一种检测柯萨奇病毒A6、AlO型的荧光定量试剂盒，其特征在于，CVA6、CVAlO标准品的保守区基因序列如下:
4.一种检测柯萨奇病毒A6、A10型的荧光定量试剂盒，其特征在于，引物探针混合液保存在棕色管。
5.一种检测柯萨奇病毒A6、AlO型的荧光定量试剂盒，其特征在于，所述试剂盒需于-20°C储存，尽量减少反复冻融。
【文档编号】C12Q1/68GK103789451SQ201410012004
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年1月12日 优先权日:2014年1月12日
【发明者】陈瑜, 李兰娟, 谢国良, 崔大伟 申请人:浙江大学