专利名称：一种制备高温稳定的包含氧载体的药物组合物的方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种制备高温稳定的含氧载体的药物组合物的方法和由该方法制备的组合物。本发明还涉及所述高温稳定的含氧载体的药物组合物在人和其他动物的癌症治疗、缺氧病症(oxygen-deprivation disorder)以及器官保存中的用途。
背景技术：
血红蛋白在大多数脊椎动物中对于血管系统和组织之间的气体交换具有重要作用。其负责经由血液循环将氧从呼吸系统运送至体细胞，并且还将代谢废物二氧化碳从体细胞运离至呼吸系统，在呼吸系统二氧化碳被呼出。由于血红蛋白具有此氧运输特性，因此如果其在离体状态下可以被稳定并且可以在体内使用，则其可以被用作有效的供氧器。天然存在的血红蛋白是四聚体，当其存在于红细胞内时通常是稳定的。然而，当天然存在的血红蛋白移出红细胞中时，其在血浆中变得不稳定，并且分裂成两个α-β 二聚体。这些二聚体的每一个的分子量为约32kDa。这些二聚体当通过肾脏过滤和分泌时可能导致实质性的肾损伤。四聚体键的断裂也负面地影响了在循环系统中功能性血红蛋白存在的持久性。为了防止四聚体的分解，近年来在血红蛋白加工方面的发展已经引入了多种交联技术来形成四聚体内的分子内键以及四聚体之间的分子间键，从而形成聚合血红蛋白。现有技术教导聚合血红蛋白是增加血红蛋白的循环半衰期的优选形式。然而，本发明人确定，聚合血红蛋白在血液循环中更容易转变成为闻铁血红蛋白。闻铁血红蛋白不能结合氧因此不能氧合组织。因此，现有技术教导的导致形成聚合血红蛋白的交联作用是有问题的。在本领域中存在着对允许分子内交联从而形成稳定的四聚体而不同时形成聚合血红蛋白的技术的需求。现有技术为稳定血红蛋白进行的尝试所存在的更多问题包括:产生的四聚体血红蛋白中包含无法接受的高百分比的二聚体单位；二聚体的存在使得血红蛋白组合物不能令人满意地施用于哺乳动物。血红蛋白的二聚体形式可以导致哺乳动物身体的严重肾损伤；此肾损伤可以严重到足以导致死亡的程度。因此，本领域中存在着对在终产物中形成含有少量不需要的二聚体形式 的稳定的四聚体血红蛋白的需求。现有技术为形成稳定的血红蛋白进行的尝试所存在的更多问题包括:蛋白杂质诸如免疫球蛋白G的存在可以导致哺乳动物中的变态反应效应。因此，本领域中存在着对可以产生稳定的不含蛋白杂质的四聚体血红蛋白的工艺的需求。现有技术血红蛋白制剂的其他问题包括:在哺乳动物中输液后产生血管收缩。已经表明此血管收缩是由于内皮衍生舒张因子与血红蛋白分子的活性巯基结合所引起的。因此，本领域中存在着对形成稳定的四聚体血红蛋白的需求，所述四聚体血红蛋白在输液后不会导致血管收缩。除了上述问题以外，在本领域中存在着对稳定化的四聚体血红蛋白的需求，而所述四聚体血红蛋白须不含磷脂并且能够以工业规模生产。
发明内容
本发明提供了一种制备高温稳定的、纯化的交联四聚体血红蛋白的方法，所述交联四聚体血红蛋白适合用于哺乳动物而不会导致严重的肾损伤、血管不利影响或其他严重的不良反应(包括死亡)。本发明还包括高温稳定的、纯化的交联四聚体血红蛋白和所述血红蛋白用于氧合体内和离体组织的用途。该方法包括哺乳动物全血的起始材料，所述全血至少包括红细胞和血浆。将哺乳动物全血中的红细胞与血浆分离，紧接着过滤从而获得滤过的红细胞级分。洗涤滤过的红细胞级分从而去除血浆蛋白杂质。在快速细胞裂解设备中以50-1000升/小时的流速通过可控的低渗裂解来裂解所述洗涤过的红细胞，持续足以裂解红细胞却不裂解白细胞的时间。进行过滤从而从所述裂解产物中去除至少一部分废截留物。从所述裂解产物中提取第一血红蛋白溶液。使用超滤滤器进行第一超滤过程，所述超滤滤器被配置成从第一血红蛋白溶液中去除分子量比四聚体血红蛋白高的杂质并且进一步去除任何病毒和残留的废截留物，从而获得第二血红蛋白溶液。对所述第二血红蛋白溶液进行流通柱色谱(Flowthrough columnchromatography)以去除蛋白杂质、二聚体血红蛋白和磷脂以形成无磷脂和低含量的二聚体的血红蛋白溶液。使用配置成去除杂质的滤器对所述无磷脂和低二聚体的血红蛋白溶液进行第二超滤过程，产生浓缩纯化的无磷脂和低二聚体的血红蛋白溶液。在充分氧合的环境中通过巯基试剂封闭所述浓缩纯化的无磷脂和低二聚体血红蛋白溶液中血红蛋白分子的巯基。得到的每个血红蛋白分子具有至少一个包含巯基保护基团的半胱氨酸部分，使得所述血红蛋白分子不能在所述半胱氨酸位点处结合内皮衍生舒张因子。通过富马酸二-3,5_ 二溴水杨酸酯(bis-3, 5-dibromosalicy fumarate)交联巯基保护的血红蛋白的至少α-α和/或β-β亚单位从而形成高温稳定的交联四聚体血红蛋白而不形成聚合血红蛋白使得得到的交联四聚体血红蛋白的分子量为60_70kDa。用合适的生理缓冲液交换所述交联四聚体血红蛋白。通过使用切向流超滤去除任何残留的未交联的四聚体血红蛋白和任何残留的化学物质。向所述交联四聚体血红蛋白加入0.2-0.4%的浓度的N-乙酰半胱氨酸从而将高铁血红蛋白的水平保持在5%以下。然后将所述无磷月旨、低二聚体、巯基保护的高温稳定的交联四聚体血红蛋白加入至药学可接受的载体；所述药学可接受的载体可以是生理缓冲液或水。紧接着此步骤，得到的血红蛋白任选地包装在气密的聚乙烯、乙烯-乙酸乙烯酯、乙烯-乙烯醇(PE，EVA，EVOH)输液包装中。该包装阻止氧污染，氧污染会导致形成无活性的高铁血红蛋白。通过上述方法制备的高温稳定的交联血红蛋白用于治疗多种癌症诸如白血病、结直肠癌、肺癌、乳腺癌、鼻咽癌和食管癌。破坏癌细胞的机制是改善肿瘤细胞中的氧合，从而提高对放射线和化疗剂的敏感性。该高温稳定的交联四聚体血红蛋白也用于在移植期间保存器官组织或用于在体内缺少供氧的情况下(诸如在缺氧心脏中)保存心脏。
图1描绘了不同物种血红蛋白的氨基酸序列比对，包括牛，人，狗，猪和马。图2描绘了本发明的方法的流程图。图3示意性描绘了本发明的方法中使用的快速细胞裂解设备(instantcytolysisapparatus)。图4是显示在氧合和缺氧环境中血红蛋白与巯基试剂的反应的图。图5描绘了对于交联四聚体血红蛋白的高效液相色谱分析。图6描绘了对交联四聚体血红蛋白的电喷雾电离质谱(ES1-MS)分析。图7显示了对(a)纯化的血红蛋白溶液和(b)交联四聚体血红蛋白的圆二色性(⑶)光谱分析。
图8显示了交联四聚体血红蛋白的体外化学增敏作用。图9描绘了使用本发明的交联四聚体血红蛋白改善了正常组织中的氧合。图10显示了使用本发明的交联四聚体血红蛋白改善了极度低氧的肿瘤区域中的氧合。图11显示了在用本发明的稳定化的交联四聚体血红蛋白治疗后，严重失血性休克的大鼠模型中的平均动脉压变化。图12是流通柱色谱的洗脱图；血红蛋白溶液处于流过级分中。图13示意性描绘了用于工业规模生产的具有超滤作用的流通CM柱色谱系统。图14是氧合环境中的巯基反应和缺氧环境中的反应之间的比较。图15证明与现有技术血红蛋白相比本发明的交联四聚体血红蛋白的热稳定性更闻。图16是用于本发明的交联四聚体血红蛋白的输液袋的示意图。图17是用来测试体外高铁血红蛋白形成的设备的示意图。图18描绘了在图17的设备中聚合血红蛋白和本发明的血红蛋白形成高铁血红蛋白的速率。
具体实施例方式血红蛋白是哺乳动物和其他动物的血液的红细胞中含铁的氧运输蛋白。血红蛋白显示蛋白的三级和四级结构两者的特性。血红蛋白中的大多数氨基酸形成由短的非螺旋段连接的α螺旋。氢键稳定血红蛋白内部的螺旋段，产生其分子内的吸引力，将各个多肽链折叠成特定的形状。血红蛋白分子是四个球状蛋白亚单位的组合体。每个亚单位由排列成一组α-螺旋结构段的多肽链构成，所述α-螺旋结构段以具有包埋的血红素基团的“肌红蛋白折叠”排列方式连接。血红素基团由固定在称为卟啉的杂环中的铁原子组成。铁原子与位于一个平面中的环中心中所有4个氮原子同等地结合。然后氧能够结合于与卟啉环的平面垂直的铁中心。因此，单个血红蛋白分子具有与四个氧分子结合的能力。在成人中，最常见类型的血红蛋白是称为血红蛋白A的四聚体，其由称为α2β2的两个α和两个β非共价结合的亚单位组成，每个亚单位分别由141和146个氨基酸残基构成。α和β亚单位的尺寸和结构彼此非常类似。对于总分子量为约65kDa的四聚体，每个亚单位的分子量为约16kDa。四条多肽链通过盐桥、氢键和疏水相互作用彼此结合。牛血红蛋白的结构与人血红蛋白类似(α链中的同一性为90.14% ；β链中的同一性为84.35% ) ο不同之处在于牛血红蛋白中的两个巯基位于PCys93处，而人血红蛋白中的巯基分别位于aCysl04、0Cys93和0Cysll2处。图1显示分别标记为B、H、C、P和E的牛、人、犬、猪和马血红蛋白的氨基酸序列比对。各种来源的氨基酸的不同之处用阴影表示。图1表明当比较其氨基酸序列时，人血红蛋白与牛、犬、猪和马血红蛋白具有高度的相似性。在红细胞内部的天然存在的血红蛋白中，a链与其相应的β链的缔合非常强并且在生理条件下不会离解。然而，在红细胞外，一个α β 二聚体与另一个α β 二聚体的缔合相当弱。该结合具有分裂成两个α β 二聚体的倾向，每个二聚体为约32kDa。这些不需要的二聚体足够小从而被肾脏过滤和分泌，结果造成潜在的肾损伤和并导致其在血管内的存留时间的实质性减少。因此，从功效和安全性两方面来看，稳定在红细胞外使用的任何血红蛋白是必要的。下面概述了制备稳定的血红蛋白的方法；本发明的方法的概况呈现在图2的流程图中。首先，选择全血来源作为来自红细胞的血红蛋白的来源。选择哺乳动物全血，包括，但不限于，人、牛、猪、马和犬全血。将红细胞与血浆分离，过滤，和洗涤以去除血浆蛋白杂质。为了从红细胞释放血红蛋白，需裂解细胞膜。尽管多种技术可以用来裂解红细胞，但本发明利用精确可控的低渗裂解技术，且能够满足工业规模制备的需要。为此，用来裂解红细胞的快速细胞裂解设备可见图3。低渗裂解形成裂解产物溶液，其包含血红蛋白和废截留物。为了能够进行工业规模制备，小心地控制裂解作用使得仅红细胞被裂解却不裂解白细胞或其他细胞。在一个实施方案中，选择快速细胞裂解设备的尺寸使得红细胞在约30秒内穿越该设备并且所述快速细胞裂解设备包括静态混合器。去离子水和蒸馏水用作低渗溶液。当然要理解使用具有不同的盐浓度的其他低渗溶液将导致红细胞裂解的时限不同。由于可控的裂解步骤仅破坏红细胞，不破坏白细胞或细胞性物质，因此其使毒性蛋白、磷脂或DNA从白细胞的释放或细胞性物质的释放最小化。在30秒后即，在含有红细胞的溶液已经穿越快速细胞裂解设备的静态混合器部分后立即加入高渗溶液。得到的血红蛋白与使用其他裂解技术得到的血红蛋白相比具有较高的纯度和较低水平的污染物诸如不合乎需要的DNA和磷脂。分别通过聚合酶链式反应(检出限=64pg)和HPLC (检出限=I μ g/mL)方法没有在该血红蛋白溶液中检测到来自白细胞的不合乎需要的核酸和磷脂杂质。进行两个超滤过程；一个过程在流通柱色谱前去除分子量比血红蛋白大的杂质，另一个过程在流通柱色谱后去除分子量比血红蛋白小的 杂质。后一超滤过程浓缩血红蛋白。在一些实施方案中，IOOkDa滤器用于第一超滤过程，而30kDa滤器用于第二超滤过程。
流通柱色谱用来去除纯化血红蛋白溶液中的蛋白杂质诸如免疫球蛋白-G、白蛋白和碳酸酐酶。在一些实施方案中，通过使用一种市售离子交换柱或其组合来进行柱色谱，所述离子交换柱诸如DEAE柱，CM柱，羟磷灰石柱等。用于柱色谱的典型pH为6-8.5。在一个实施方案中，使用流通CM柱色谱步骤在pH8.0下去除蛋白杂质。进行酶联免疫吸附测定(ELISA)以检测从柱色谱洗脱后样品中残留的蛋白杂质和磷脂。此独特的流通柱色谱分离能够实现连续的分离方案，从而能够实现工业规模的制备。ELISA结果显示在洗脱的交联四聚体血红蛋白中这些杂质的量非常低(免疫球蛋白-G:44.3ng/mL;白蛋白:20.37ng/mL ；碳酸酐酶:81.2 μ g/mL)。使用不同类型的柱采用不同的pH值去除蛋白杂质的结果显示在下面的表I中。表1:使用不同的离子交换柱去除不同的蛋白杂质
权利要求
1.一种制备高度纯化的和高温稳定的包含氧载体的药物组合物的方法，所述包含氧载体的药物组合物包含血红蛋白，所述方法包括: a)提供至少包含红细胞和血浆的哺乳动物全血； b)将所述哺乳动物全血中的红细胞与血浆分离； c)过滤与血浆分离的红细胞从而获得滤过的红细胞级分； d)洗涤所述滤过的红细胞级分从而去除血浆蛋白杂质，得到洗涤过的红细胞； e)在快速细胞裂解设备中，通过可控的低渗裂解以50-1000升/小时的流速来破裂所述洗涤过的红细胞，持续足以裂解红细胞却不裂解白细胞的时间，从而形成包含破裂的红细胞的裂解产物的溶液； f)进行过滤以从所述裂解产物中去除至少部分废截留物； g)从所述裂解产物提取第一血红蛋白溶液； h)使用超滤滤器进行第一超滤过程，所述超滤滤器被配置成去除分子量比四聚体血红蛋白闻的杂质，以从第一血红蛋白溶液中进一步去除任何病毒和残留废截留物，从而获得第二血红蛋白溶液； i)对所述第二血红蛋白溶液进行流通柱色谱以去除磷脂、蛋白杂质和二聚体血红蛋白并形成无磷脂、低蛋白杂质和低二聚体血红蛋白的溶液； j)使用被配置成去除杂质的滤器对所述无磷脂、低蛋白杂质和低二聚体血红蛋白的溶液进行第二超滤过程，产生浓缩纯化的无磷脂、低蛋白杂质和低二聚体血红蛋白的溶液；k)在充分氧合的环境中通过巯基试剂封闭所述浓缩纯化的无磷脂、低蛋白杂质和低二聚体血红蛋白的溶液中 血红蛋白分子的巯基使得各血红蛋白分子具有至少一个包含巯基保护基团的半胱氨酸部分，使得所述血红蛋白分子不能在所述半胱氨酸位点处结合内皮衍生舒张因子； I)通过富马酸二 _3，5- 二溴水杨酸酯交联所述巯基保护的血红蛋白，从而形成高温稳定的交联四聚体血红蛋白而不形成聚合血红蛋白，使得得到的交联四聚体血红蛋白的分子量为60-70kDa，并且基本上由未聚合的交联四聚体血红蛋白组成；m)用合适的生理缓冲液交换所述交联四聚体血红蛋白；η)通过洗涤去除任何残留的未交联的四聚体血红蛋白和任何残留的化学物质；ο)向所述交联四聚体血红蛋白加入浓度为0.2-0.4%的N-乙酰半胱氨酸从而将高铁血红蛋白的水平保持在5%以下；和 P)将所述低二聚体、无磷脂、巯基保护的在高达80°C的温度下高温稳定的不含聚合血红蛋白的交联四聚体血红蛋白加入药学可接受的载体。
2.根据权利要求1所述的制备包含氧载体的药物组合物的方法，其中所述快速细胞裂解设备包括静态混合器。
3.根据权利要求1所述的制备包含氧载体的药物组合物的方法，其中所述交联四聚体血红蛋白衍生自牛、猪、犬或马血红蛋白。
4.根据权利要求1所述的制备包含氧载体的药物组合物的方法，其中所述柱色谱包含一个或多个阳离子交换柱和阴离子交换柱。
5.根据权利要求4所述的制备包含氧载体的药物组合物的方法，其中所述离子交换柱为一个或多个DEAE柱、CM柱和/或羟磷灰石柱。
6.根据权利要求1所述的制备包含氧载体的药物组合物的方法，其中通过富马酸二-3，5-二溴水杨酸酯的血红蛋白交联包括至少α-α和/或β-β交联。
7.根据权利要求6所述的制备包含氧载体的药物组合物的方法，其中选择交联条件使得β-β交联大于总交联的50%。
8.根据权利要求6所述的制备包含氧载体的药物组合物的方法，其中选择交联条件使得β-β交联大于总交联的60%。
9.根据权利要求6所述的制备包含氧载体的药物组合物的方法，其中选择交联条件使得β-β交联大于总交联的70%。
10.根据权利要求1所述的制备包含氧载体的药物组合物的方法，其中所述药学可接受的载体为生理缓冲液或水。
11.根据权利要求1所述的制备包含氧载体的药物组合物的方法，所述方法还包括将已制备的组合物包装在多层柔性输液包装中，所述输液包装在日常环境条件下的透氧性为每24小时小于0.0025cm3O
12.—种高度纯化和高温稳定的包含氧载体的药物组合物，所述药物组合物包含血红蛋白，所述血红蛋白由通过权利要求1所述的方法形成的未聚合的交联四聚体血红蛋白组成。
13.一种氧合组织的方法，所述方法包括在离体条件下向所述组织提供权利要求12所述的组合物。
14.一种未聚合的交联四聚体血红蛋白，其由权利要求1-11任一项的方法形成。
15.权利要求14的未聚合的交联四聚体血红蛋白在制备用于治疗癌症的药物中的用`途。
16.根据权利要求15的用途，其中所述癌症选自白血病、结直肠癌、肺癌、乳腺癌、鼻咽癌和食管癌。
17.权利要求14的未聚合的交联四聚体血红蛋白在制备用于氧合组织或治疗缺氧病症的药物中的用途。
18.根据权利要求17的用途，其中所述缺氧病症为失血性休克。
19.权利要求14的未聚合的交联四聚体血红蛋白制备用于器官保存的药物中的用途。
20.根据权利要求19的用途，其中所述器官保存包括在移植期间保存器官组织或用于在体内缺少供氧的情况下保存心脏。
全文摘要
本发明提供了一种高温稳定的和高度纯化的交联的(任选地≥70％β-β交联)的四聚体血红蛋白，其具有高效的氧输送功能，所述四聚体血红蛋白适合用于哺乳动物而不导致肾损伤和血管收缩。将二聚体形式的血红蛋白变性并对来自全血的红细胞进行纯化。在快速细胞裂解设备中进行可控低渗裂解以防止白细胞的裂解。在裂解液中没有检测到来自白细胞的核酸和磷脂杂质。在氧合环境中通过巯基试剂封闭活性巯基。流通柱色谱去除不同的血浆蛋白杂质。将N-乙酰半胱氨酸加入至交联的四聚体血红蛋白以保持低水平的高铁血红蛋白。稳定的血红蛋白保存在带有铝外包装的输液袋中以防止氧侵入形成无活性的高铁血红蛋白。该产品用于组织氧合和癌症治疗。
文档编号A61P35/02GK103169954SQ20131005497
公开日2013年6月26日 申请日期2011年4月15日 优先权日2010年5月27日
发明者黄炳镠, 郭瑞仪 申请人:黄炳镠, 郭瑞仪