专利名称：发酵液中新霉素含量的快速测定方法及装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种发酵液中新霉素含量的测定方法及装置，尤其涉及一种将发酵液中 的新霉素快速全部分离出来后，用旋光度法测定其含量的方法及装置。
背景技术：
新霉素含量的测定方法主要有抗生素微生物检定法、高效液相色谱法、分光光度法 和旋光度法。抗生素微生物检定法是新霉素类成品即硫酸新霉素原料药及其制剂含量的 法定测定方法，详细见中国药典2005年版二部正文754页和附录79页，该法由于专属 性较高，除可用于新霉素类成品的含量测定外，还可用于发酵液中新霉素含量的测定， 但由于该法操作繁琐，测定时间约需20小时，这就不能及时得知发酵过程中新霉素的 含量，因而也就不能及时对发酵工艺条件进行调控，这就不利于提高发酵生产水平。高 效液相色谱法、分光光度法和旋光度法均属于仪器测定方法，虽然测定时间均小于1小 时，含量的测定，因为发酵液中的大量杂质会对仪器的使用寿命和测定结果产生严重影 响。而将发酵液中的新霉素与大量杂质分离后，就可以用上述的仪器测定方法，问题是 现有技术对新霉素与大量杂质的分离时间一般都在80小时以上，而且还不但这些方法 只能用于新霉素类成品的含量测定，而不能直接用于发酵液中新霉素能将发酵液中的新 霉素全部分离出来，会损失一部分新霉素，这就会造成测定结果的不真实。因而，现行 新霉素发酵生产过程中，发酵液中新霉素含量的测定仍不得已而采用抗生素微生物检定
法，还未发现一种发酵液中新霉素含量的快速测定方法及装置。
发明内容
本发明的目的就是提供一种使发酵生产过程中新霉素的含量能够进行及时监测，从 而实现对发酵工艺条件进行及时调控的发酵液中新霉素含量的快速测定方法及装置
本发明的目的是这样实现的 一种发酵液中新霉素含量的快速测定方法，包括以下 步骤
(l).待测溶液的制备取发酵液，用常规的离心沉降法将发酵液中的固形物除去，得 到上清液,将上清液用孔径为0.2~10微米的微孔滤膜过滤，制得供分离溶液；(2) .离子交换分离取1~6BV的供分离溶液，BV为倍离子交换树脂体积，用蠕动 泵控制2~40BV/h的流速上离交柱吸附，供分离溶液上完后随即用1~3BV的水顶洗， BV/h为倍离子交换树脂体积/小时；随后用1 4moI/L的氨水解吸离交柱中的新霉素并 随即用有刻度的容器收集解吸液，收集的解吸液体积为所取供分离溶液体积的2~6倍， 充分混合均匀后作为供测定溶液；
(3) .旋光度法测定:将上述所得供测定溶液用1分米长的旋光管按常规的旋光度测定 法测定其旋光度，按下式计算发酵液中新霉素的含量:CKmg/ml"IdV2 a
式中d为每ml发酵液中的新霉素重量，单位为mg; K4为特性系数，主要与新霉素的性质有关，取值为12.3~12.9; 准确数值可用抗生素微生物检定法进行对比测定求得； a为测得的旋光度；
W为所取供分离溶液的体积，单位为ml; V2为供测定溶液的体积，单位为ml;
若用发酵单位表示发酵液中新霉素的含量，则按下式计算C2(li/ml)^K2V2a/^
式中C2为每ml发酵液中的新霉素单位(y);
K2为特性系数，主要与新霉素的性质有关，取值为12300-12900;
准确数值可用抗生素微生物检定法进行对比测定求得； a为测得的旋光度；
W为所取供分离溶液的体积，单位为ml; V2为供测定溶液的体积，单位为ml。
离交柱的处理:在步骤(2)中解吸完毕后的离交柱用3 6BV的水将柱中的氨水洗尽后 即可重复使用；同一根离交柱累计使用10次以上后，需用3~6BV的2mol/L氢氧化钠 溶液以l~2BV/h的流速处理，用3~6BV的水洗后再用3-6BV的2mol/L氨水将离子交 换树脂转为铵型，最后用3~6BV的水将柱中的氨水洗尽后即可投入下一轮使用。
步骤(2)所述的供分离溶液的用量是2~4BV;离子交换分离的流速8~20BV/h;水 顶洗的用量是1.5-2BV;所述的氨水的浓度是2mol/L。
步骤(2)所述的收集解吸液的体积是供分离溶液体积的2~4倍。
步骤(3)所述的特性系数的取值范围是K产12.4 12.6, K2 = 12400~l2600;
一种发酵液中新霉素含量的快速测定装置，主要由离子交换柱1与离子交换柱1相 配合的蠕动泵2，收集瓶3以及旋光仪4构成。
离子交换柱1柱内径范围是3 24 mm，较优的柱内径范围是6~12 mm;柱长度范围是120~960 mm，较优的柱长度范围是240~480 mm;树脂装量范围是0.68~347 ml， 较优的树脂装量范围是5.4~43.4 ml;所装离子交换树脂的类型是大孔强酸阳离子交换树 脂和大孔弱酸阳离子交换树脂，较优的类型为大孔弱酸阳离子交换树脂；离子交换树脂 的粒度范围是0.08 0.64mm，较优的粒度范围是0.16 0.32mm;离子交换树脂的吸附容 量范围是2.5~25万P /ml，较优的吸附容量范围是10~25万u /ml;
离子交换柱1中离子交换树脂的粒度与离交柱的内径之比是1 : 20~80;
离子交换柱1内径与长度之比是1 : 20~60;
离子交换柱l的容积与树脂的装量之比是l: o.6~i;
蠕动泵2:蠕动泵的流速是0.06-600 ml/分钟，蠕动泵的通道数是1~60; 收集瓶3:收集瓶的容量范围是5 1000ml，较优的容量范围是25 100ml; 旋光仪4:可测样品最低透过率是1~10%，较优的是1%;最小读数值是0.001~0.01°， 较优的是0.001°。
8.根据权利要求6所述的发酵液中新霉素含量的快速测定装置，其特征在于离子
交换柱1内径与长度之比是1:30 50;离子交换柱l内径与长度之比是l: 30~50;离
子交换柱1的容积与树脂的装量之比是1: 0.75485。
采用一台多通道蠕动泵控制多支相同规格的离交柱的流速，一次可以同时测定多个
样品， 一次同时测定样品的数量主要取决于蠕动泵的通道数。
本发明提供的发酵液中新霉素含量的快速测定方法及装置，由于采用了离子交换从
发酵液中快速分离新霉素的新技术，并经过与旋光度法相结合,实现了对发酵液中新霉素
含量的快速测定，测定时间由现有测定方法的20小时降到了1小时以内，由于能够对发酵 生产过程中新霉素的含量进行及时监测，就能够对发酵生产工艺条件进行及时调控，为 提高发酵生产水平提供了技术支持。本发明还能用于新霉素发酵研究领域，既可对摇瓶 发酵过程中新霉素的含量进行及时监测，也可对摇瓶发酵终点新霉素的含量进行及时测 定,为提高发酵研究水平和研究效率提供了技术支持。另外，本发明技术不仅能对单个样 品进行快速测定，而且还能对多个样品同时进行快速测定；本发明技术不仅在测定时间 上低于现有技术，而且在测定费用上也低于现有技术。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。 图l是本发明的结构示意图。
具体实施方式
本发明的测定方法包括以下步骤
(1) .待测溶液的制备取发酵液，用常规的离心沉降法将发酵液中的固形物除去，得 到上清液，将上清液用孔径为0.2-10微米的微孔滤膜过滤，制得供分离溶液；
(2) .离子交换分离取1~6BV的供分离溶液，BV为倍离子交换树脂体积，用蠕动 泵控制2~40BV/h的流速上离交柱吸附，供分离溶液上完后随即用1~3BV的水顶洗， BV/h为倍离子交换树脂体积/小时；随后用l~4mol/L的氨水解吸离交柱中的新霉素并 随即用有刻度的容器收集解吸液，收集的解吸液体积为所取供分离溶液体积的2~6倍， 充分混合均匀后作为供测定溶液；
(3) .旋光度法测定:将上述所得供测定溶液用1分米长的旋光管按常规的旋光度测定 法测定其旋光度，按下式计算发酵液中新霉素的含量:Q(mg/ml)-IdV2 a /Vi
式中C^为每ml发酵液中的新霉素重量，单位为mg; K,为特性系数，主要与新霉素的性质有关，取值为12.3~12.9; 准确数值可用抗生素微生物检定法进行对比测定求得； a为测得的旋光度；
V,为所取供分离溶液的体积，单位为ml; V2为供测定溶液的体积，单位为ml;
若用发酵单位表示发酵液中新霉素的含量，则按下式计算C2(u/ml一K2V2(iA^
式中C2为每ml发酵液中的新霉素单位(U );
K2为特性系数，主要与新霉素的性质有关，取值为12300~12卯0;
准确数值可用抗生素微生物检定法进行对比测定求得；
a为测得的旋光度；
V,为所取供分离溶液的体积，单位为ml; V2为供测定溶液的体积，单位为ml。
步骤(2)所述的供分离溶液的用量是2~4BV;离子交换分离的流速8~20BV/h;水 顶洗的用量是1.5-2BV;所述的氨水的浓度是2mol/L。步骤(2)所述的收集解吸液的体 积是供分离溶液体积的2 4倍。步骤(3)所述的特性系数的取值范围是K产12.4 12.6， K2=12400~12600。
实施例l:
(1) .供分离溶液的制备:取50吨发酵罐中培养120小时的新霉素发酵液约100ml，用 常规的离心沉降法得到上清液,再用孔径为5微米的微孔滤膜过滤，制得供分离溶液。
(2) .离子交换分离离子交换柱内装粒度为0.25~0.35mm的大孔强酸阳离子交换树脂18ml,铵离子型。取供分离溶液50ml，用蠕动泵控制4 ml/分钟的流速上O9X360离 交柱吸附，供分离溶液上完后随即用27ml的水顶洗；随后用2mol/L的氨水解吸离交 柱中的新霉素并随即用IOO迈I的容量瓶收集解吸液至刻度,充分混合均匀后作为供测定 溶液。
(3) .旋光度法测定:将上述所得供测定溶液用1分米长的旋光管按常规的旋光度测定 法(中国药典2005年版二部附录38页)测定其旋光度为0.435。，计算:d(mg/ml"K,V2 a /V, = 12.6 X100 X 0.435/50 = 10.962(mg/ml);
C2( U /ml) = K2V2 a /Vi = 12600 X 100 X 0.435/50 = 10962( u /ml)。
本例测定从供分离溶液到获得测定结果仅用时约为50分钟，而同等的用抗生素微 生物检定法测定则用时为20小时。
(4) .离交柱的处理:在步骤(2)中解吸完毕后的离交柱用卯ml的水将柱中的氨水洗尽 后供下一次使用。
实施例2:
(1) .供分离溶液的制备:取50吨发酵罐中培养168小时的新霉素发酵液约60ml，用常 规的离心沉降法得到上清液，再用孔径为5微米的微孔滤膜过滤，制得供分离溶液。
(2) .离子交换分离取供分离溶液25ml，用蠕动泵控制2加1/分钟的流速上0>7.5乂 300离交柱(内装粒度为0.25~0.35mm的大孔弱酸阳离子交换树脂10.6 ml，铵离子型) 吸附，供分离溶液上完后随即用16ml的水顶洗；随后用2mol/L的氨水解吸离交柱中 的新霉素并随即用50ml的容量瓶收集解吸液至刻度，充分混合均匀后作为供测定溶液。
(3) .旋光度法测定:将上述所得供测定溶液用1分米长的旋光管按常规的旋光度测定 法(中国药典2005年版二部附录38页)测定其旋光度为0.625n，计算:d(mg/ml)二KjV2 a /Vi = 12.6 X 50 X 0.625/25 = 15.75(mg/ml);
C2( U /ml)=K2V2 a /V! = 12600 X 50 X 0.625/25 = 15750( U /ml)。 本例测定从供分离溶液到获得测定结果仅用时约为50分钟，而同等的用抗生素微 生物检定法测定则用时为20小时。
(4) .离交柱的处理:在步骤(2)中解吸完毕后的离交柱用50ml的水将柱中的氨水洗尽 后供下一次使用。
实施例3:
(1) .供分离溶液的制备:取500ml摇瓶发酵试验所得的新霉素发酵液约30ml，用常规 的离心沉降法得到上清液，再用孔径为5微米的微孔滤膜过滤，制得供分离溶液。
(2) .离子交换分离离子交换柱内装粒度为0.18~0.25mm的大孔弱酸阳离子交换树脂4.2ml，铵离子型。取供分离溶液10ml，用蠕动泵控制1 ml/分钟的流速上O5.5X220 离交柱吸附，供分离溶液上完后随即用6ml的水顶洗；随后用2mol/L的氨水解吸离交 柱中的新霉素并随即用25ml的容量瓶收集解吸液至刻度，充分混合均匀后作为供测定溶液。
(3) .旋光度法测定:将上述所得供测定溶液用1分米长的旋光管按常规的旋光度测定 法(中国药典2005年版二部附录38页)测定其旋光度为0.520。，计算:d(mg/ml)二K4V2 a /Vi = 12.6 X 25 X 0.520/10 = 16.38(mg/ml);
C2( u /ml)=K2V2 a /V! = 12600 X 25 X 0.520/10=16380( y /ml)。
本例测定从供分离溶液到获得测定结果仅用时约为50分钟，而同等的用抗生素微 生物检定法测定则用时为20小时。
(4) .离交柱的处理:在步骤(2)中解吸完毕后的离交柱用20ml的水将柱中的氨水洗尽 后供下一次使用。
本发明中步骤(2)中解吸完毕后的离子交换柱用3~6BV的水将柱中的氨水洗尽后即 可重复使用同一根离交柱累计使用10次以上后，需用3~6BV的2mol/L氢氧化钠溶 液以l~2BV/h的流速处理，用3~6BV的水洗后再用3~6BV的2mol/L氨水将离子交换 树脂转为铵型，最后用3~6BV的水将柱中的氨水洗尽后即可投入下一轮使用。
本发明中的发酵液中新霉素含量的快速测定装置，主要由离子交换柱l、与离子交 换柱1相配合的蠕动泵2，收集瓶3以及旋光仪4构成，通过加料管5加料。
本发明中的离子交换柱1柱内径范围是3~24 mm,较优的柱内径范围是6~12 mm; 柱长度范围是120~960 mm，较优的柱长度范围是240~480 mm;树脂装量范围是 0.68-347 ml，较优的树脂装量范围是5.4~43.4 ml;所装离子交换树脂的类型是大孔强 酸阳离子交换树脂和大孔弱酸阳离子交换树脂，较优的类型为大孔弱酸阳离子交换树 脂；离子交换树脂的粒度范围是0.08 0.64mm，较优的粒度范围是0.16~0.32mm;离子 交换树脂的吸附容量范围是2.5~25万U /ml，较优的吸附容量范围是10~25万u /ml;
离子交换柱1中离子交换树脂的粒度与离交柱的内径之比是1 : 20~80;
离子交换柱1内径与长度之比是1 : 20~60;
离子交换柱1的容积与树脂的装量之比是1 : 0.6~1;
蠕动泵2:蠕动泵的流速是0.06~600 ml/分钟，蠕动泵的通道数是1~60; 收集瓶3:收集瓶的容量范围是5 1000ml，较优的容量范围是25 100ml; 旋光仪4:可测样品最低透过率是1~10%，较优的是1%;最小读数值是0.001~0.01°， 较优的是0.001°。离子交换柱1内径与长度之比是1 : 30~50;离子交换柱1内径与长度之比是1:
30~50;离子交换柱l的容积与树脂的装量之比是l: 0.75485。
本发明中若用一台多通道蠕动2泵控制多支相同规格的离交柱的流速，则一次可以
同时测定多个样品， 一次同时测定样品的数量主要取决于蠕动泵的通道数，目前市售的
蠕动泵通道数已达30通道以上，最多已达36通道，这对于进行大规模摇瓶发酵试验的 新霉素发酵单位测定极为快速高效。
权利要求
1、一种发酵液中新霉素含量的快速测定方法，其特征在于包括以下步骤
2、 根据权利要求1所述的一种发酵液中新霉素含量的快速测定方法，其特征在于. 离交柱的处理:在步骤(2)中解吸完毕后的离交柱用3 6BV的水将柱中的氨水洗尽后即可重复使用；同一根离交柱累计使用10次以上后，需用3~6BV的2mol/L氢氧化钠 溶液以l~2BV/h的流速处理，用3-6BV的水洗后再用3 6BV的2mol/L氨水将离子交 换树脂转为铵型，最后用3-6BV的水将柱中的氨水洗尽后即可投入下一轮使用。
3. 根据权利要求1所述的发酵液中新霉素含量的快速测定方法，其特征在于步骤 (2)所述的供分离溶液的用量是2~4BV;离子交换分离的流速8~20BV/h;水顶洗的用 量是1.5-2BV;所述的氨水的浓度是2mol/L。
4. 根据权利要求1所述的发酵液中新霉素含量的快速测定方法，其特征在于步骤(2) 所述的收集解吸液的体积是供分离溶液体积的2 4倍。
5. 根据权利要求1所述的发酵液中新霉素含量的快速测定方法，其特征在于步骤(3) 所述的特性系数的取值范围是& = 12.4~12.6， K2=12400~12600;
6. —种发酵液中新霉素含量的快速测定装置，其特征在于主要由离子交换柱(l)、 与离子交换柱(1)相配合的蠕动泵(2)，收集瓶(3)以及旋光仪(4)构成。
7. 根据权利要求6所述的发酵液中新霉素含量的快速测定装置，其特征在于-离子交换柱(1)柱内径范围是3 24mm，较优的柱内径范围是6~12 mm;柱长度范围是120-960 mm，较优的柱长度范围是240~480 mm;树脂装量范围是0.68-347 ml， 较优的树脂装量范围是5.4~43.4 ml;所装离子交换树脂的类型是大孔强酸阳离子交换树 脂和大孔弱酸阳离子交换树脂，较优的类型为大孔弱酸阳离子交换树脂；离子交换树脂 的粒度范围是0.08^.64mm，较优的粒度范围是0.16~0.32mm;离子交换树脂的吸附容 量范围是2.5~25万U /ml，较优的吸附容量范围是10~25万u /ml;离子交换柱(1)中离子交换树脂的粒度与离交柱的内径之比是l :20 80;离子交换柱(1)内径与长度之比是l : 20~60;离子交换柱(1)的容积与树脂的装量之比是l : 0.6-1;蠕动泵(2):蠕动泵的流速是0.06-600 ml/分钟，蠕动泵的通道数是1~60; 收集瓶(3):收集瓶的容量范围是5 1000ml，较优的容量范围是25 100ml; 旋光仪(4):可测样品最低透过率是1~10%，较优的是1%;最小读数值是 0.001~0.01°，较优的是0.001°。
8. 根据权利要求6所述的发酵液中新霉素含量的快速测定装置，其特征在于离子 交换柱(1)内径与长度之比是1 : 30~50;离子交换柱(1)内径与长度之比是1: 30~50;离子交换柱(1)的容积与树脂的装量之比是l: 0.75~0.85。
9. 根据权利要求6所述的发酵液中新霉素含量的快速测定装置，其特征在于采用一台多通道蠕动泵控制多支相同规格的离交柱的流速， 一次可以同时测定多个样品，一 次同时测定样品的数量主要取决于蠕动泵的通道数。
全文摘要
一种发酵液中新霉素含量的快速测定方法及装置。采用了离子交换从发酵液中快速分离新霉素的新技术，并与旋光度法相结合，实现了对发酵液中新霉素含量的快速测定，测定时间由现有测定方法的20小时降到了1小时以内，由于能够对发酵生产过程中新霉素的含量进行及时监测，就能够对发酵生产工艺条件进行及时调控，为提高发酵生产水平提供了技术支持。本发明还能用于新霉素发酵研究领域，既可对摇瓶发酵过程中新霉素的含量进行及时监测，也可对摇瓶发酵终点新霉素的含量进行及时测定，为提高发酵研究水平和研究效率提供了技术支持。另外，本发明技术不仅能对单个样品进行快速测定，而且还能对多个样品同时进行快速测定，在测定时间和测定费用上均低于现有技术。
文档编号G01N30/00GK101446578SQ200810237449
公开日2009年6月3日 申请日期2008年12月24日 优先权日2008年12月24日
发明者兵 江, 苗建蓉 申请人:宜昌三峡制药有限公司