专利名称：一种基于分子伴侣添加技术的elisa检测试剂盒及其方法
技术领域：
本发明涉及生物技术，特别是涉及以分子伴侣作为添加剂提高ELISA检测试剂盒质量的方法。
背景技术：
蛋白表达过程中，许多蛋白质不能按正确的方式折叠。错误折叠的蛋白质经常将含碳丰富的氨基酸暴露在表面，而不是被包裹在内。这些含碳丰富的基团会跟其它蛋白质中的类似基团紧密结合，构成大分子聚合物。这些聚合物本身失去自身生物学活性，并可使周围蛋白聚集沉淀，在细胞内存在时往往是致死的。
分子伴侣是一种引导蛋白质正确折叠的蛋白质。当蛋白质折叠时，它们能保护蛋白质分子免受其它蛋白质的干扰。很多分子伴侣属于热休克蛋白，它们在细胞受热时大量合成。热激可导致多数蛋白质稳定性降低，增加错误折叠的几率，因此在受到热刺激时，细胞中的蛋白质需要更多热休克蛋白的帮助。
HSP60是一种典型的分子伴侣，它可以为正在折叠的蛋白质提供一个附着环境，从而起到保护折叠过程的作用。未折叠的蛋白质进入其结构内的空穴，便可以在其中完成折叠。
模拟体内环境，在ELISA试剂盒实际生产中，试剂盒的成分里面，抗体、标准品、酶标物等均为蛋白成分，在运输过程以及分装使用过程中，由于蛋白浓度比较低，反应条件及温度环境等外界因素不稳定，这些蛋白质很容易受到影响而变性失活。而添加分子伴侣之后，蛋白将受到分子伴侣蛋白的保护，并且给部分变性蛋白提供一个复性的环境，从而间接的优化试剂盒的保质期，稳定性、准确性等方面的品质。
NGAL蛋白是1993年在中性粒细胞内首先被发现的，与炎症、胚胎发育、免疫应答、趋化作用、信号转导以及多种肿瘤的发生与发展等过程相关。近年来国内外的研究表明，NGAL蛋白在多种疾病发病过程中具有特异性表达变化的特点，使得NGAL成为检测疾病的生物标志物。本发明中依据NGAL抗原决定簇
4特点，选择两个不同位点，表达抗原，免疫家兔获得抗体，开发出特异性针对
于NGAL蛋白的抗体对。并通过质量控制，投入研发试验，为双抗体夹心法、竟争ELISA法及其他利用抗体检测样本中NGAL含量的检测方法提供基础。
本发明中，使用HSP60蛋白作为NGAL的ELISA试剂盒蛋白组分添加剂，检测并验证HSP60对于该试剂盒的有效作用。
发明内容
本发明的目的是通过添加分子伴侣蛋白的方法提高NGAL ELISA试剂盒的性能。
所述分子伴侣是HSP60。
本发明的另 一 目的是提供添加分子伴侣的ELISA检测试剂盒，及分子伴侣表达、分离和纯化的方法。
所述分子伴侣获得依照如下进行将HSP60编码基因插入表达载体PET28a，得到PET28a-HSP60。
所述表达是将质粒HIS-HSP60在大肠杆菌中表达和培养。
所述分离是指将大肠杆菌破碎，然后离心或过滤分离出融和蛋白。破碎可釆用电动捣碎机、或匀浆机破碎、或用超声波处理破碎，也可以用溶菌酶处理。
所述纯化是用本领域内常用的层析法或电泳法进行，优选凝胶层析法进行。
具体的说上述步骤如下进行
1 ) PCR扩增表达HSP60的基因片段，两端带有NdeI和XhoI酶切位点，酶切消化后插入NdeI和XhoI消化后的Pet28a,得到质粒PET28a-HSP60;
2 ) HIS-HSP60在大肠杆菌Rosetta中表达，克隆接种至3ml含有100路/ml kana的LB缓冲液，37°C，过夜，220rpm;将过夜培养物l: 100稀释至lL含有100吗/mlkana的LB缓冲液，37°C, 220rpm,培养5h;加入终浓度为O.lmM的IPTG, 22°C，180rpm，继续培养22h;以8000g, 15min, 4'C离心收菌；菌体用50mM Tris-cl,200mM NaCl pH8.0悬起至25ml，加入5mg溶菌酶，RT, 0.5h;用超声破碎仪超声至溶液澄清，12000rpm, 20min离心3次；
3 )将上清液使用GE healthcare的chelating sepHarose Fast Flow柱料纯化，得到纯化融合蛋白。4)凝血酶酶切HIS标签，Ni柱纯化，得到除去标签的HSP60蛋白。
实验证明，纯化后HSP60可溶性极高，20mg/mlHSP60在50mMTris， 500mMNaCl中保存，于(C几个月内未见明显沉淀未有降解、FPLC表明HSP60为单体，一年内未有聚合物出现。
本发明提供的利用PET28a系统融合表达、再经酶切处理去掉标签制得的HSP60蛋白，可以在大肠杆菌中成功表达，表达量与前人的结果类似，相对于真核表达，原核表达制备工程化抗体技术相对简单，成本更低；
所述分子伴侶添加方法为，HSP60与蛋白组分为1:1混合。分别与未添加HSP60的ELISA试剂盒比较稳定性、保质期。
图l:图中显示内容为本发明中使用的蛋白表达载体PET28a的载体图谱。图2:图中显示内容为本发明中HIS-HSP60融合蛋白小量表达蛋白电泳图片。图中1、未加IPTG诱导的菌株；2、 3、分别为加IPTG诱导的两株菌株；4、
蛋白分子量标准，由上至下分子量标准为115kDa、 66kDa、 45kDa、 35kDa、 25kDa、
18.4kDa、 14.4kDa。
图3:图中显示内容为本发明中纯化后的HSP60蛋白电泳图片。
图中l和2、纯化后的HSP60蛋白；3、蛋白分子量标准，由上至下分子量
标准为115kDa、 6kDa、 45kDa、 35kDa、 25kDa、 18.4kDa、 14.4kDa。
图4:图中显示内容为本发明中纯化后HSP60蛋白Superdex200凝胶过滤层析
洗脱曲线。
图中最高的峰为纯化后HSP60蛋白的峰。
具体实施例方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例l HSP60的制备
HSP60蛋白广泛存在于多种生物体中，其编码基因一般可以通过RT-PCR从生物体cDNA中获得。本发明中，以质粒PCDNA3.1-HSP60为模板扩增得到。1. 克隆PET28a-HSP60:
选择表达载体PET28a为克隆载体(见图l)，根据其多克隆位点及HSP60序列特点，设计两端引物PCR扩增表达HSP60的基因片段，两端带有NdeI和XhoI酶切位点，酶切消化后插入Ndel和XhoI消化后的Pet28a,得到质粒PET28a-HSP60;
2. 表达纯化PET28a-HSP60:
将质粒HIS-HSP60在大肠杆菌Rossetta中表达。首先通过小量表达鉴定，诱导株与未诱导株相比，在60KD左右处有明显特异条带(见图2)。大量培养后，通过SDS-PAGE分析上清沉淀，结果显示，该蛋白在上清中存在。利用其所带His标签，通过IMAC的方法，可获得纯度为99%以上的目的蛋白(见图3)。
HIS-HSP60在大肠杆菌Rosetta中表达，克隆接种至3ml含有100pg/ml kana的LB缓冲液，37°C,过夜，220rpm;将过夜培养物1: 100稀释至1L含有100吗/ml kana的LB缓冲液，37。C,220rpm，培养5h;加入终浓度为0.1mM的IPTG， 22°C ， 180rpm，继续培养22h;以8000g, 15min, 4t:离心收菌；菌体用50mMTris-Cl, 200mMNaClpH8.0悬起至25ml，加入5mg溶菌酶，RT, 0.5h;用超声破碎仪超声至溶液澄清，12000rpm， 20min离心3次；上清使用GE healthcare的chelating s印Harose Fast Flow
柱料纯化，步骤参照其厂家提供的说明书。
HIS-HSP60于咪唑浓度为60mM时被洗脱。产量高达50-100毫克每升培养物。
凝血酶酶切HIS标签，Ni柱纯化，得到除去标签的HSP60蛋白。为分析HSP60在溶液中是否均一，将2mgHSP60换至20mMTris-Cl， pH8.0,50mMNaCl的缓冲液中。样品通过20mM Tris-Cl, pH8.0, 50mMNaCl平衡好的Superdex200柱子。整个操作参考AKTAPurifier提供的手册。结果显示纯化好的HSP60于咪哇浓度为60mM时被洗脱。产量高达50-100亳克每升培养物。
通过Superdex 200柱子时未见明显的多聚体，主要以 一个均 一 的峰出现(见图4)。
实施例2 添加与未添加HSP60后NGALELISA试剂盒的性能比较
l.灵敏度比较:配制浓度为0.0002, 0.002, 0.04, 0.10, 0.20, 0.50, 2.00，5.00 i!g/ml的NGAL标准溶液。分别使用4'C放置两个月的添加HSP60与未添加的
7NGAL ELSIA试剂盒按间接竟争性ELISA法操作，根据抑制率与标准品浓度的对数作图，绘制标准抑制曲线，并计算NGAL样品的抑制中浓度(IC50)及最低检测限(ICIO)。
抑制率(％) = ( ODmax — ODmin) — (ODx - ODmin) / (ODmax — ODmin) xlOO(结果见表5)
式中OD醒为不力口NGAL时的吸光值，ODx为加NGAL时的吸光值，ODmin
为空白对照孔的吸光值。
通过IC-ELISA方法建立了NGAL的标准抑制曲线。在0.002 ~ 0.5pg/ml浓度范
围内，以此范围的浓度对数与抑制率进行回归分析，得线性回归方程
I=31.793LogC+96.314 ( r=0.994 )。
添加HSP60组IC50为0.03495 pg/ml, ICIO为0.002 pg/ml。而未添加HSP60组IC50为0.02074ng/ml， IC10为0.004 pg/ml。2.回收率比较
NGAL在血清和尿液中添加回收率实验健康人血清和尿液中分别添加浓度为0.002、 0.008、 0.04、 0.10、 0.20、 0.50 ng/ml的NGAL，每个浓度设4个复孔，用上述建立的IC-ELISA法分别分别使用4。C放置两个月的添加HSP60与未添加的NGALELSIA试剂盒对样品进行分析比较，计算回收率(结果见表l )。
添加分子伴侶的试剂盒，其回收率明显比未添加分子伴侣的试剂盒要高。
表la添加HSP60 NGAL ELISA试剂盒检测NGAL在血清中的回收率
血清中添加浓度检测浓度回收率
(pg/ml)(jig/ml)(%)
0<0細20
0.0020.00209104.50
0駕0.00803100.36
0.040.039799.25
0.10.098598.50
0.20.18793.40
0.50.502100.40表lb不添加HSP60 NGAL ELISA试剂盒检测NGAL在血清中的回收率
血清中添加浓度 检测浓度 回收率
(pg/ml)_ ( pg/ml)_(%)
5 <0扁2 5~
O還 0.00163 81.50
0.008 0.00603 75.37
0.04 0.0383 95.75
0.10 0.0873 87.30
0.20 0.172 86.00
0.50 0.473 94.60
表lc添加HSP60 NGAL ELISA试剂盒检测NGAL在尿液中的回收率
尿液中添加浓度 检测浓度 回收率
(ng/ml)_(pg/ml) (%)
"(5 <0細2 "5~~
0.002 0.00199 99.50
O細 0.00792 99.00
0.04 0.0395 98.75
0.10 0.0102 102.00
0.20 0.203 101.50
0.50 0.506 101.20
表Id不添加HSP60 NGAL ELISA试剂盒检测NGAL在尿液中的回收率
尿液中添加浓度检测浓度回收率
(fig/ml)(|ag/ml)(%)
0<0扁20
0.0020.0017989.50
O細0.0074993.625
0.040.037794.25
0.100.083983.90
0.200.18291.00
0.500.47595.00
注1)样品不经过处理直接进行测定；2)重复实验5次取平均值
9
权利要求
1、一种分子伴侣添加剂，其特征在于，它是由原核表达纯化的极高可溶性及活性的蛋白。
2、 如权利要求1所述的分子伴侣添加剂，其特征在于，所述分子伴侣是 HSP60。
3、 如权利要求l所述的分子伴侣添加剂，其特征在于，它是用于ELISA试 剂盒的添加剂。
4、 分子伴侶添加到NGAL的ELISA试剂盒提高试剂盒质量的方法，包括 蛋白克隆，表达，分离和纯化及在NGAL试剂盒中添加使用的方法。
5、 如权利要求4所述的ELISA试剂盒，其特征在于是针对于定性及定量检测 各种样品中NGAL含量的试剂盒。
6、 如权利要求4所述的ELISA试剂盒，其特征在于其高效特异性检测NGAL 蛋白的抗原位点。
7、 如权利要求4所述的ELISA试剂盒，其特征在于其利用抗体对或单个包被 抗体，利用双抗体夹心法或竟争法定性和定量检测样品中NGAL。
8、 如权利要求4所述的ELISA试剂盒，其特征在于其所用抗体含有NGAL的多克隆抗体。
9、 如权利要求l所述的融合蛋白分子伴侣，其特征在于，所述表达是将质 粒PET28A-HSP60在大肠杆菌中表达和培养。
10、 如权利要求l所述的融合蛋白分子伴侣，其特征在于，所述分离是指将 大肠杆菌破碎，然后离心或过滤分离出分子伴侣蛋白。
11、 如权利要求1所述的融合蛋白分子伴侣，其特征在于，所述破碎可釆 用电动捣碎机或勻浆机破碎，或用超声波处理破碎，或用溶菌酶处理。
12、 如权利要求l所述的融合蛋白分子伴侣，其特征在于，所述纯化是用层 析法或电泳法进行。
13、 如权利要求1所述的融合蛋白分子伴侣，其特征在于，所述分子伴侣 通过以下述步骤制备1) PCR扩增表达HSP60的基因片段，两端带有NdeI和XhoI酶切位点，酶切 消化后插入NdeT和XhoI消化后的Pet28a,得到质粒PET28a-HSP60;,2 ) HIS-HSP60在大肠杆菌Rosetta中表达，克隆接种至3ml含有100吗/ml kana 的LB缓冲液，37°C,过夜，220rpm;将过夜培养物l : 100稀释至lL含有100吗/ml kana的LB缓冲液，37°C, 220rpm,培养5h;加入终浓度为O.lmM的IPTG, 22°C, 180rpm,继续培养22h;以8000g， 15min, 4。C离心收菌；菌体用50mMTris-cl， 200mM NaCl pH8.0悬起至25ml，加入5mg溶菌酶，RT, 0.5h;用超声破碎仪超 声至溶液澄清，12000rpm， 20min离心3次;,3 )将上清液使用GE healthcare的chelating sepH arose Fast Flow柱料纯化,得 到纯化后的融合蛋白。,4)凝血酶酶切fflS标签，Ni柱纯化，得到除去标签的HSP60蛋白。
全文摘要
本发明涉及一种基于分子伴侣添加技术的ELISA检测试剂盒。该试剂盒是由体外表达纯化后的分子伴侣蛋白添加入NGAL的ELISA步骤中各组分中制备得到的。本发明提供的分子伴侣蛋白可溶性极好、活性极高，且该ELISA试剂盒质量与未添加的试剂盒相比具备检测稳定性好、保质期长、准确性高的优点。该分子伴侣的基序来源于人源蛋白，且纯化宿主为大肠杆菌，应用时没有交叉反应问题，而且该蛋白由于其分子伴侣的特点，大大的降低了抗体、标准品及其他会因为某些极端条件而影响活性事件的产生几率。
文档编号G01N33/68GK101650369SQ20081023742
公开日2010年2月17日 申请日期2008年12月26日 优先权日2008年12月26日
发明者华权高 申请人:武汉华美生物工程有限公司