专利名称：一种发酵生产透明质酸发酵液的方法
一种发酵生产透明质酸发酵液的方法技术领域
本发明属于发酵技术领域，涉及一种发酵生产透明质酸发酵液的方法。
技术背景
透明质酸(Hyaluronic acid, HA)又名透明酸或玻璃酸，是一种人体生理所必需的粘多糖，广泛存在于动物及人体的各种组织中。在不同组织中HA的生理作用有所不 同，如在关节滑液中主要为润滑作用；在血管壁中主要是调节通透性；在皮肤中主要表 现为保水作用。基于HA高黏度、润滑性、保水性、良好的生物相容性及其特殊的生理 性能等，其在医药领域有广泛的用途，目前国际上在骨科、眼科、外科、创伤、缓释制 剂、诱导靶向给药载体、肿瘤治疗、皮肤填充剂等方面的应用均取得了较大的进展。
目前采用微生物发酵生产透明质酸也是一种常规方法，它弥补了传统鸡冠提取 法生产透明质酸的不足。微生物发酵生产透明质酸，大大拓宽了 HA的来源，推动了 HA 的研究和应用。但目前发酵法生产透明质酸的发酵条件中传统的温度为37°C，在公开 的申请号为20051012^18，专利名称为《一种提高发酵法生产透明质酸产量及分子量的 方法》的专利说明书中，公开的发酵工艺条件中温度为37°C，通气量为1.2min/L，产量 6.059g/L ；在2006年10月第6卷第5期“过程工程学报”中的一篇名为《高产量、高 分子量透明质酸发酵条件优化》一文中公开的发酵法生产透明质酸的发酵温度为37°C， 通气量1.2min/L，产量达5.9g/L，事实上，传统发酵温度并不能同时确保所生产透明质 酸的高产量与高分子量。发明内容
本发明所要解决的技术问题是传统发酵温度并不能同时确保所生产透明质酸的 高产量与高分子量的问题，并借鉴其它各种影响透明质酸产量与质量的因素，例如发酵 菌种、发酵所需的营养物质、微量元素、氨基酸、发酵搅拌速度、发酵液的酸碱度、发 酵通气量等等方面，在这些因素已经得到优化的前提下，寻找合适的发酵温度，从而得 到一种发酵生产透明质酸发酵液的方法。
本发明通过以下方案解决该技术问题
一种发酵生产透明质酸发酵液的方法，以兽疫链球菌H23为发酵菌株，所述方 法的步骤为
a、将兽疫链球菌H23接种至脑心浸出粉琼脂培养基上进行培养，得到兽疫链球 菌H23菌体；
b、配置种子培养基，所述种子培养基由蔗糖、酵母粉、硫酸镁、磷酸二氢钾、 硫酸锰、微量元素液、缓冲液组成，所述微量元素液由氯化钙、氯化锌、硫酸锰、硫酸 铜组成，所述缓冲液由磷酸氢二钠，磷酸二氢钠组成，种子培养基预先用氢氧化钠调节 PH值至7.2后灭菌，将兽疫链球菌H23菌体接种至种子培养基培养，得到兽疫链球菌H23 种子培养液；4
C、配置发酵培养基，所述发酵培养基由蔗糖、酵母粉、硫酸镁、磷酸二氢钠、 硫酸钾、精氨酸、微量元素液、缓冲液组成，所述微量元素液由氯化钙、氯化锌、硫酸 锰、硫酸铜组成，所述缓冲液由磷酸氢二钠，磷酸二氢钠组成，发酵培养基预先用氢氧 化钠调节PH值至7.2后灭菌，将兽疫链球菌H23种子培养液接种至发酵培养液，发酵温 度为40V，发酵完毕即可得到透明质酸发酵液。
该技术方案采用生命力较强的兽疫链球菌H23作为发酵菌种生产透明质酸发酵 液，在发酵过程中，针对兽疫链球菌H23营养要求高的特点，在种子培养基和发酵培养 基中添加了各种营养物质，例如提供充足碳源的蔗糖，提供维生素及蛋白质的酵母粉， 参与兽疫链球菌H23代谢的各种矿物质，微量元素，以及某些兽疫链球菌H23自身无法 合成，然而又是兽疫链球菌H23生产透明质酸不可缺少的氨基酸，例如精氨酸。因此本 发明所提供的各种营养物质能够确保兽疫链球菌的生长，从而为提高透明质酸的产量与 质量打下良好的基础，下面是种子培养液与发酵培养液各营养物质的调配量
种子培养基包含
蔗糖浓度为10_30g/L 酵母粉浓度为18.0_22.0g/L
硫酸镁浓度为1.0_5.0g/L 磷酸二氢钾浓度为1.0_4.0g/L，
硫酸锰浓度为0.01_0.2g/L微量元素液浓度为0.5-10ml/L，
缓冲液为10_200ml/L ；
其中，所述微量元素液中氯化钙浓度为50-5000mg/L，氯化锌浓度为 10-200mg/L,硫酸锰浓度为l_50mg/L，硫酸铜浓度为l_100ml/L ；
所述种子培养基中所使用的缓冲液中磷酸氢二钠浓度为10_70g/L，磷酸二氢钠 浓度为5-30g/L。
发酵培养基包含
蔗糖浓度为30_120g/L 酵母粉浓度为18.0_22.0g/L
硫酸镁浓度为1.0_5.0g/L 磷酸二氢钠浓度为1.0-6.0g/L
硫酸钾浓度为0.5_4.0g/L 精氨酸浓度为0.01_0.2g/L
微量元素液浓度为1.0-10.0ml/L缓冲液浓度为5_200ml/L
其中，所述微量元素液中氯化钙浓度为200-5000mg/L，氯化锌浓度为 5-300mg/L,硫酸锰浓度为l_50mg/L，硫酸铜浓度为l_200mg/L ；
所述发酵培养基中所使用的缓冲液中磷酸氢二钠浓度为10_70g/L，磷酸二氢钠 浓度为15-30g/L。
为使兽疫链球菌能够迅速大量繁殖，所述种子培养基的培养条件可以是培养 温度37°C，震荡培养10-14小时。
作为本发明方法中c步骤的发酵条件，发酵搅拌速度可以是200-300rpm，用质 量百分比浓度为30%的氢氧化钠溶液调节发酵培养基的酸碱度，使发酵培养基的PH值始 终保持在7.0士0.1之间，通气量为lvvm，发酵时间为18-22小时。
更为重要的是，本发明经过研究发现，发酵温度同样能够对透明质酸的产量及 质量产生影响。一般认为，兽疫链球菌H23的葡萄糖代谢中至少存在两个可以转化的合 成方向，第一个方向是合成菌体细胞壁第二个方向是合成透明质酸方向，发酵温度较 低时，合成菌体细胞壁方向可向合成透明质酸方向转变，从而可以提高透明质酸的分子量，生产高质量的透明质酸，但此时兽疫链球菌H23的生长速度和代谢速度均较慢，因 此，透明质酸的产量无法保证。在发酵温度较高时，兽疫链球菌H23的生长速度较快， 但所生产的透明质酸的分子量较低。
另一种观点认为，发酵温度较高或者较低都会使透明质酸的产量和分子量降 低，对此的解释是目前用于生产透明质酸的链球菌大多数是来自于哺乳动物体内的细 菌，因此，要在体外培养生产更多的透明质酸，需要提供类似体内生长的人工培养环^Mi ο
不论是第一种观点还是第二种观点，为了同时达到透明质酸的高产量和高分子 量，这两种观点所采取的措施是相同的，即将生产透明质酸的发酵温度控制在一个很小 的范围内，通常采用的发酵温度是37°C。
而本发明通过研究发现，发酵温度在40°C时可以使技术人员在采用本发明所述 的技术方案后得到较高产量和较高分子量的透明质酸，从而克服了本领域技术人员在使 用常规发酵法生产透明质酸习惯将发酵温度设定在37°C的技术偏见。得到的透明质酸发 酵液的特性黏度范围为1700 η 2100 η，产量为6.1g/L 6.3g/L。
另外，由于本工艺是耗氧发酵，因此发酵过程中会产生大量的热量，发酵过程 中的热量包括发酵过程散发热和搅拌热，产生的热量会直接导致发酵温度快速上升并大 大超过工艺要求的温度，温度快速上升之后需要大量的冷媒将发酵温度降至在工艺要求 的范围。因此，如果发酵温度控制在37°C，将需要更多的冷媒将升高的温度降至37°C; 反之，发酵温度控制在40°C，需要的冷媒大大减少，从而降低能耗，减少生产成本。
上述技术方案中提到的冷媒为自来水。
具体实施方式
实施例1
以兽疫链球菌H23为发酵菌株发酵生产透明质酸，其步骤为
1、将兽疫链球菌H23接种至脑心浸出粉琼脂培养基上进行培养，于37°C培养16 小时，得到兽疫链球菌H23菌体；
2、配置500ml种子培养基
种子培养基的组成为蔗糖20g/L，酵母粉15.0g/L，硫酸镁1.0g/L，磷酸二氢 钾1.0g/L，硫酸锰0.03g/L，微量元素液20ml/L，缓冲液100ml/L ；
其中微量元素液的组成为氯化钙1000mg/L，氯化锌100mg/L，硫酸锰30mg/ L,硫酸铜80mg/L;
其中缓冲液的组成为磷酸氢二钠50g/L，磷酸二氢钠25g/L。
配置好的种子培养基预先用质量百分比浓度为30%的氢氧化钠调节PH值至7.2 后灭菌，将兽疫链球菌H23菌体接种至种子培养基培养，于37°C震荡培养12小时，得到 兽疫链球菌H23种子培养液；
3、配置5L发酵培养基
发酵培养基的组成为蔗糖100g/L，酵母粉15.0g/L，硫酸镁5.0g/L，磷酸二 氢钠5.0g/L，硫酸钾3.5g/L，精氨酸0.15g/L，微量元素液10ml/L，缓冲液100ml/L ；
其中微量元素液的组成为氯化钙4000mg/L，氯化锌200mg/L，硫酸锰:35mg/L,硫酸铜 160mg/L ；
配置发酵培养基后装入IOL的发酵罐中，配置好的发酵培养基预先用质量百分 比浓度为30 %的氢氧化钠调节PH值至7.2后灭菌，将兽疫链球菌H23种子培养液接种 至发酵培养液，接种后在搅拌转速为200-300rpm，温度为40V，PH值为7.0，通气量为 Ivvm条件下培养20小时，得到透明质酸发酵液，发酵过程中用质量百分比浓度为30% 的氢氧化钠调节发酵液的PH值，使PH值保持在7.0士0.1之间；
试验结果
权利要求
1.一种发酵生产透明质酸发酵液的方法，以兽疫链球菌H23为发酵菌株，所述方法 的步骤为a、将兽疫链球菌H23接种至脑心浸出粉琼脂培养基上进行培养，得到兽疫链球菌 H23菌体；b、配置种子培养基，所述种子培养基由蔗糖、酵母粉、硫酸镁、磷酸二氢钾、硫酸 锰、微量元素液、缓冲液组成，所述微量元素液由氯化钙、氯化锌、硫酸锰、硫酸铜组 成，所述缓冲液由磷酸氢二钠，磷酸二氢钠组成，种子培养基预先用氢氧化钠调节PH值 至7.2后灭菌，将兽疫链球菌H23菌体接种至种子培养基培养，得到兽疫链球菌H23种子 培养液；C、配置发酵培养基，所述发酵培养基由蔗糖、酵母粉、硫酸镁、磷酸二氢钠、硫酸 钾、精氨酸、微量元素液、缓冲液组成，所述微量元素液由氯化钙、氯化锌、硫酸锰、 硫酸铜组成，所述缓冲液由磷酸氢二钠，磷酸二氢钠组成，发酵培养基预先用氢氧化钠 调节PH值至7.2后灭菌，将兽疫链球菌H23种子培养液接种至发酵培养液，发酵温度为 40发酵完毕即可得到透明质酸发酵液。
2.根据权利要求1所述的一种发酵生产透明质酸发酵液的方法，其特征在于b步骤的种子培养液中蔗糖浓度为10-30g/L，酵母粉浓度为18.0-22.0g/L，硫酸镁浓 度为1.0-5.0g/L，磷酸二氢钾浓度为1.0-4.0g/L，硫酸锰浓度为0.01_0.2g/L，微量元素液 浓度为 0.5-10ml/L，缓冲液为 10-200ml/L ；所述微量元素液中氯化钙浓度为500-5000mg/L，氯化锌浓度为10-200mg/L，硫酸 锰浓度为l_50mg/L，硫酸铜浓度为l-100mg/L ；所述缓冲液中磷酸氢二钠浓度为10-70g/L，磷酸二氢钠浓度为5-30g/L。
3.根据权利要求1或2所述的一种生产透明质酸发酵液的方法，其特征在于c步骤的发酵培养基中蔗糖浓度为30-120g/L，酵母粉浓度为18.0-22.0g/L，硫酸镁 浓度为1.0_5.0g/L，磷酸二氢钠浓度为1.0-6.0g/L，硫酸钾浓度为0.5_4.0g/L，精氨酸浓 度为0.01-0.2g/L，微量元素液浓度为l-10ml/L，缓冲液浓度为5_200ml/L ；所述微量元素液中氯化钙浓度为200-5000mg/L，氯化锌浓度为5-300mg/L，硫酸锰 浓度为l_50mg/L，硫酸铜浓度为l_200mg/L ；所述缓冲液中磷酸氢二钠浓度为10-70g/L，磷酸二氢钠浓度为5-30g/L。
4.根据权利要求1或2所述的一种发酵生产透明质酸发酵液的方法，其特征在于b步 骤中种子培养基的培养条件为培养温度37°C，震荡培养10-14小时。
5.根据权利要求3所述的一种发酵生产透明质酸发酵液的方法，其特征在于b步骤中 种子培养基的培养条件为培养温度37°C，震荡培养10-14小时。
6.根据权利要求1或2所述的一种发酵生产透明质酸发酵液的方法，其特征在于c步 骤中的发酵过程中，发酵搅拌速度为200-300rpm，用质量百分比浓度为30%的氢氧化钠 溶液调节，使发酵培养基的PH值在7.0士0.1之间，通气量为lvvm，发酵时间为18-22小 时。
7.根据权利要求3所述的一种发酵生产透明质酸发酵液的方法，其特征在于c步骤中 的发酵过程中，发酵搅拌速度为200-300rpm，用质量百分比浓度为30%的氢氧化钠溶液 调节，使发酵培养基的PH值在7.0士0.1之间，通气量为lvvm，发酵时间为18-22小时。
8.根据权利要求4所述的一种发酵生产透明质酸发酵液的方法，其特征在于c步骤中 的发酵过程中，发酵搅拌速度为200-300rpm，用质量百分比浓度为30%的氢氧化钠溶液 调节，使发酵培养基的PH值在7.0士0.1之间，通气量为lvvm，发酵时间为18-22小时。
全文摘要
本发明属于发酵技术领域，涉及一种发酵生产透明质酸发酵液的方法，为了解决传统发酵温度并不能同时确保所生产透明质酸的高产量与高分子量的问题，本发明综合考虑了其它各种影响透明质酸产量及质量的因素，并着重对发酵温度进行了优化，结果发现发酵温度在40℃时，发酵效果最好，从而克服了在发酵温度这一因素调控上的技术偏见，并且采用本发明的发酵方法能够显著的降低发酵能耗，并一定程度上提高产量及质量。
文档编号C12R1/46GK102021213SQ20091019580
公开日2011年4月20日 申请日期2009年9月17日 优先权日2009年9月17日
发明者付爱玲, 张延良, 曾辉, 黄宇 申请人:上海佰加壹医药有限公司