专利名称：β-干扰素免疫干预类风湿关节炎的体外评价方法
技术领域：
本发明涉及一种类风湿关节炎的体外评价方法，尤其涉及一种在β-干扰素免 疫干预类风湿关节炎的过程中，体外评价β-干扰素效用的方法。
背景技术：
类风湿性关节炎(RheumatoidArthritis-RA)属于一种病因未明的以侵犯四肢关节
为主的自身免疫病，其发病率高达0.4%-1%。长期以来，该病仍限于用激素或非甾体 类药物的姑息治疗。新近的免疫干预新方法(抗CD20抗体、TNF-α受体拮抗剂以及抗 黏附分子的抗体)显示了免疫调节和免疫干预在治疗RA中的重要作用。但值得关注的 是β-干扰素(IFN-β)在治疗RA中具有潜力和前景。IFN-β是一种抗病毒、抗细菌 感染和抑制细胞增殖活化的细胞因子而有别于IFN-α和IFN-Y。人们已经关注到它以 特有的免疫调节特性和抗病毒的双重作用在干预自身免疫性疾病中(特别是对RA)发挥 了重要的生物学功能。IFN-β可能的作用机制包括抑制患者自身反应性CD4+T细胞的 增殖、抑制CD8+T细胞、调控细胞因子产生(IL-10和IL-12)等。目前认为，促炎症的 Thl细胞因子和抗炎症的Th2细胞因子之间的平衡与自身免疫病的发病过程存在着密切的 关联。现已证明，在应用IFN-β治疗治疗多发性硬化症(Multiple Sclerosis，MS)中， IFN-β具有调节趋化因子的产生，降低其浓度梯度和T细胞受体CCR5表达而抑制炎性T 细胞从外周向大脑中枢(CNS)迁移。在体外，已发现正仏日还可以抑制^^-6/^3￥等 病毒的复制，发挥其抗病毒的生物学效应，并明显减少RR-MS患者复发期HHV-6/EBV 病毒的复制。经过IFN- β治疗的MS患者其血清中特异的抗HHV-6/EBV的IgM抗体 (可以作为病毒扩增的指标)含量也有相应的下降。
发明内容
本发明的目的是提供一种β -干扰素免疫干预类风湿关节炎的体外评价方法， 通过检测β-干扰素免疫干预前后的各种细胞因子、蛋白酶和配基的水平，从而建立 β“干扰素免疫干预类风湿关节炎效用的体外评价方法。本发明所述的β _干扰素免疫干预类风湿关节炎的体外评价方法，在β _干扰素 免疫干预前后，分别检测T淋巴细胞抗原受体β-链可变区、CD3+T细胞增殖、血清中 的基质金属蛋白酶和滑液中的核因子κB受体活化因子配体的水平；然后使用t检验对各 项检测结果进行统计分析，在干扰素免疫干预后T淋巴细胞抗原受体β-链可变区、 CD3+T细胞增殖、血清中的基质金属蛋白酶和滑液中的核因子κ B受体活化因子配体的 水平均同时下降，ρ <0.05，具有显著性差异。正常人外周血T淋巴细胞95%的T淋巴细胞抗原受体(Τ cell receptor, TCR)由 α和β两条多肽链组成。β -链可变区(TCR BV)可分为保守性基因家族TCR BVl、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、24 和 25。
与正常人相比，RA患者体内的CD3+T细胞普遍含量较高。测定CD3+T细胞增 殖水平也直接反应药物的效用。基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinases，MMP)属锌依赖性内肽酶家族，能 够降解一种或几种细胞外基质(Extracellular Matrix，ECM)。它与多种疾病如心血管
病和肿瘤等有关。在类风湿关节炎中，MMP-3是导致软骨降解的最重要的蛋白酶，是系 统性的炎症标志物，可作为类风湿关节炎患者滑膜损伤和预后的主要指标之一。核因子κ B 受体活化因子配体(Receptor Activator of NF- κ B Ligand, RANKL)， 也称为骨保护素受体(Osteoprotegerin Ligand, 0PGL)，它主要表达于破骨细胞前体细胞 表面，是参与破骨细胞分化、激活、存活和淋巴结形成的主要介质。近年来对RA软骨 和骨破坏的研究证实了骨骼和免疫系统的相互作用的重要性。同时对免疫缺陷动物模型 进行研究时发现，RANKL在RA骨破坏中发挥了重要作用。本发明使用定量PCR检测TCR BV，方法简述如下 TCR BV 基因和 BC 基因的引物设计使用 Applied Biosystems 的 Prime Exoress 2.0 软件，序列参见表1。TCR BV基因表达采用real-time PCR方法，内参用TCR BC基因，
同时不加模板为阴性对照。每反应用0.5 μ 1 cDNA样本，分别后25对BV特异性引物和 1对BC引物混合，引物终浓度为O.lmM，再各加2 X SYBR Green PCR MasterMix (Applied Biosystems)至反应终体积为10 μ 1，加入384孔PCR反应板，按50°C 2分钟一95°C 10分 钟一950C 15 秒一600C 1 分钟(40 个循环)，在 ABI 7900 SequenceDetection System 中进行
反应。然后根据PCR反应信号强度Ct值计算每个样本的TCRBV基因相对表达量TCR BVn (% ) = [2-(BVnQ-BCQ) χ 100/Z(2"(BV1"25Q"BCQ) X 100)] X 100，其中 Ct 为循环次数。表1用于RA患者TCRBV/C分析的RT-PCR弓丨物对
权利要求
1.一种β-干扰素免疫干预类风湿关节炎的体外评价方法，其特征是在β-干扰素免 疫干预前后，分别检测T淋巴细胞抗原受体β-链可变区、CD3+T细胞增殖、血清中的基 质金属蛋白酶和滑液中的核因子κB受体活化因子配体的水平；然后使用t检验对各项检 测结果进行统计分析，与干扰素免疫干预前的各项指标进行对比，干扰素免疫干 预后T淋巴细胞抗原受体β-链可变区、CD3+T细胞增殖、血清中的基质金属蛋白酶和滑 液中的核因子κ B受体活化因子配体的水平均同时下降，ρ <0.05，具有显著性差异。
2.根据权利要求1所述的干扰素免疫干预类风湿关节炎的体外评价方法，其特征 是所述β-干扰素免疫干预的时间为一周以上。
3.根据权利要求1所述的干扰素免疫干预类风湿关节炎的体外评价方法，其特征 是所述的T淋巴细胞抗原受体β -链可变区包含TCRBV13。
4.根据权利要求1所述的干扰素免疫干预类风湿关节炎的体外评价方法，其特征 是所述的T淋巴细胞抗原受体β -链可变区为TCRBV13。
全文摘要
一种β-干扰素免疫干预类风湿关节炎的体外评价方法，在β-干扰素免疫干预后，以T淋巴细胞抗原受体β-链可变区、CD3+T细胞增殖、基质金属蛋白酶和核因子κB受体活化因子配体在血清和滑液中的水平同时下降为判断依据。本发明所述的β-干扰素免疫干预类风湿关节炎的体外评价方法，可用于β-干扰素免疫干预类风湿关节炎效用的体外评价当中，便于临床医师确定RA患者IFN-β使用的安全性，有效性和疾病进展与回归的评估提供依据。
文档编号C12Q1/37GK102010892SQ20091019524
公开日2011年4月13日 申请日期2009年9月7日 优先权日2009年9月7日
发明者何东仪, 余奇文, 张冬青, 张继英, 沈杰, 程伟志, 肖涟波, 胡朝英, 许荣, 钱柳, 陈雪华, 黄秋愉 申请人:上海市免疫学研究所, 上海市长宁区光华中西医结合医院