专利名称：一种建立抗结核杆菌药物筛选模型的方法
技术领域：
本发明属于医药生物技术领域，涉及一种建立抗结核杆菌药物筛选模型的方 法，具体涉及一种以结核杆菌海藻糖磷酸磷酸酶为靶点的抗结核杆菌药物筛选模型，及 其利用所述筛选模型筛选海藻糖磷酸磷酸酶抑制剂的方法。
背景技术：
结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)是人类重要的致病菌，对人类健康
构成巨大的威胁。据调查，目前全球接近32%的人口感染了结核杆菌，世界卫生组织于 1993年宣布结核病为全球健康紧急状态。我国是全球22个结核病高负担国家之一，结核 病疫情较严重，结核病人数居世界第二位。研究显示，结核病流行难以遏制主要与多重 耐药结核杆菌菌株的大量增多以及艾滋病流行等因素有关。虽然20世纪异烟胼、利福平等多种有效抗生素的产生使肺结核病例在世界范围 内迅速减少，但结核杆菌依然是世界上最主要的致死病原微生物。特别是耐药结核杆菌 的产生，使世界上大部分人依然面临着感染和发病的危险，因此寻找新型抗结核药物作 用靶标以及新型抗结核药物刻不容缓。研究显示，结核分枝杆菌海藻糖是分枝杆菌细胞壁固有成分糖脂的必要组成 部分。结核分枝杆菌细胞壁毒力成分索状因子就是海藻糖_6，6’ _双分枝菌酸。 OtsA-OtsB合成途径是分枝杆菌中海藻糖生化合成主要途径之一，即通过海藻糖合成酶 催化6-磷酸葡萄糖与UDP葡萄糖生成6-磷酸海藻糖，然后在海藻糖磷酸磷酸酶的作用 下脱去磷酸基团，生成终产物海藻糖。已有报道OtsAB途径是结核分枝杆菌体外生长 及感染小鼠所必需的生化合成通路，与野生型结核分枝杆菌相比，海藻糖合成酶OtsA缺 失突变株对小鼠的毒力下降[Murphy ΗΝ, Stewart GR, Mischenko W, Apt AS，Harris R, McAlister MS, Driscoll PC, Young DB, Robertson BD.The OtsAB pathway is essential for trehalose biosynthesis in Mycobacterium tuberculosis.J Biol Chem, 2005, 280(15) 14524-14529]。结核分枝杆菌基因组中有两个可能编码海藻糖磷酸磷酸酶的开放阅读 框OtsBl (Rv2006)和otsB2 (Rv3772)。Edavana等证明0tsB2蛋白具有海藻糖磷酸磷酸酶 的功能，而 OtsBl 蛋白没有磷酸酶的活性[Edavana VK，Pastuszak I, Carroll JD, Thampi P, Abraham EC, Elbein AD.Cloning and expression of the trehalose-phosphate phosphatase of Mycobacterium tuberculosis comparison to the enzyme from Mycobacterium smegmatis.Arch Biochem Biophys，2004，426(2) 250-257]。有研究发现 TPP (0tsB2)与结核分枝杆菌 异烟胼耐药相关，在异烟胼耐药结核分枝杆菌中上调表达，并分泌到培养上清中，提出 0tsB2可能与异烟胼耐药相关[乐军，刘丽蓉，谢建平，雷建强，梁莉，王洪海.结核分 枝杆菌异烟胼耐药相关分泌蛋白海藻糖磷酸磷酸酶的鉴定.中华结核和呼吸杂志，2004， 27(10) 687-689].
发明内容
本发明的目的是提供一种抗结核杆菌药物筛选模型的建立方法，尤其涉及以结 核杆菌海藻糖磷酸磷酸酶为靶点的抗结核杆菌药物筛选模型的建立方法。本发明的另一目的是提供上述药物筛选模型在药物筛选海藻糖磷酸磷酸酶靶向 药物中的应用。具体的，本发明利用生物学方法，克隆表达结核杆菌的海藻糖磷酸磷酸酶，建 立以海藻糖磷酸磷酸酶为靶点的筛选模型，利用商业小分子化合物库，筛选海藻糖磷酸 磷酸酶抑制剂，进而筛选新作用机制的抗结核药物。由于在人和哺乳动物体内没有TPP的同源蛋白，并且T PP编码基因otsB2/ Rv3372是结核生长必需的，本发明对分枝菌属结核杆菌(M.tuberculosis)，麻风分枝杆菌 (M.leprae)，鸟型分枝杆菌(M.avium)，溃疡分枝杆菌(M.ulceran) (M.sp)，土壤分枝杆菌 (M.vanbaalenii),草分枝杆菌(M.flavescens)，耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)中编码海藻 糖磷酸磷酸酶基因进行进化树分析，结果表明病原性分枝杆菌M.tuberculosis，M.leprae, M.avium, M.ulcerans聚集成簇，非致病性的(M.sp)，土壤分枝杆菌(M.vanbaalenii)，草 分枝杆菌(M.flavescens)，耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)聚成一簇，提示TPP与分枝杆菌 的致病性有关。因此海藻糖磷酸磷酸酶可以是一个很好的作用靶点，可以用来开发抑制 致病性结核杆菌的药物。本发明的进一步目的是提供针对海藻糖磷酸磷酸酶为靶点的筛选模型，大规模 寻找特异性海藻糖磷酸磷酸酶抑制剂。具体的，本发明涉及的以结核杆菌海藻糖磷酸磷酸酶为靶点的筛选模型通过下 述方法建立，1)由MgCl2,海藻糖6-磷酸，重组海藻糖磷酸磷酸酶组成阳性对照组；2)不含有重组海藻糖磷酸磷酸酶的反应体系，由MgCl2,海藻糖6-磷酸，待测小 分子化合物(含5%。的DMSO溶剂)组成阴性对照组；3)由MgCl2.海藻糖6-磷酸，重组海藻糖磷酸磷酸酶，不同浓度的待 测小分子化合物(含5%。的DMSO溶剂)组成样品组，其中所有反应体系均为 50mMTris-HCl (PH7.5)；4)通过比较阳性对照组、阴性对照组和样品组在反应后630nm下的光吸收强度， 用于以结核杆菌海藻糖磷酸磷酸酶为靶点的抑制剂筛选，进而筛选抗结核药物筛选。在本发明优化的反应条件中，操作按本领域一般技术人员熟悉的步骤，试剂 完全可以从商业的途径获得。具体的，其中阳性对照组中各组分的浓度分别为50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)，ImM海藻糖-6-P，2mM MgCl2和0.Iug纯化重组海藻糖磷酸 磷酸酶；阴性对照组中各组分的浓度分别为50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)，ImM海藻 糖-6-P，2mM MgCl2,不同浓度的待测化合物样品(含5%。的DMSO溶剂)；化合物样品 测定组中各组分的浓度分别为50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)，ImM海藻糖_6_P，2mM MgCl2,不同浓度的待测化合物样品(含5%。的DMSO溶剂)和O.lug纯化重组海藻糖磷 酸磷酸酶。另一方面，本发明还涉及一种利用上述筛选模型筛选抗结核药物的方法，包括 以下步骤
1)所述模型成分阳性对照组，阴性对照组和化合物样品测定组的反应体系总体 积均为50 μ 1，37°C孵育30min后，加入IOOul的孔雀绿试剂终止反应。其中孔雀绿试剂 配方按商业提供配方如下0.15%孔雀绿，钼酸铵，12.5% (ν/ν)的浓盐酸。2)通过比较阳性对照组、阴性对照组和化合物样品测定组在反应后630nm下的 光吸收值，筛选以结核杆菌海藻糖磷酸磷酸酶为靶点的抑制剂，使进一步筛选并获得抗 结核新型药物。下面结合具体实施例对本发现作进一步阐述，但不限制本发明。 具体实施方 式实施例1 从化合物库中初筛海藻糖磷酸磷酸酶抑制剂1.样品来源从Spec，Tripos商业数据库中购买小分子化合物243个。2.样品设置每块96孔板筛选40个样品，每个样品做两个重复来进行重复性 比较，样品母液浓度为10mg/ml，溶剂为DMSO。样品初筛浓度设定一个浓度为200ug/ ml。阳性对照和阴性对照组分别设定四个重复。3.阳性对照组中各组分的浓度分别为50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)，ImM海藻 糖-6-P，2mM MgCl2和O.lug纯化重组海藻糖磷酸磷酸酶。阴性对照组中各组分的浓度 分别为50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)，ImM海藻糖_6_Ρ，2mM MgCl2,不同浓度的待 测化合物样品(含5%。的DMSO溶剂)。化合物样品测定组中各组分的浓度分别为50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)，ImM海藻糖-6-P，2mM MgCl2,待测化合物样品(含5%。的 DMSO溶剂)和O.lug纯化重组海藻糖磷酸磷酸酶。具体操作中，首先用反应缓冲液 Tris-HCl (pH7.5)将重组海藻糖磷酸磷酸酶浓度调整为0.1ug/ul，然后在96孔板中先加入 50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)，ImM海藻糖-6-P，2mM MgCl2后，分别在阳性对照组 的反应体系中加1 μ 1 50mMTris-HCl缓冲液(pH7.5)和1 μ l(0.1ug/ul)重组海藻糖磷酸磷 酸酶，阴性对照组的反应体系中加1 μ 1浓度为10mg/ml的化合物样品及1 μ 1的Tris-HCl 缓冲液(ρΗ7.5)，化合物待测样品组的反应体系中加入1 μ 1浓度为lOmg/ml的化合物样 品和1 μ l(0.1Ug/Ul)重组海藻糖磷酸磷酸酶。轻轻震荡充分混勻。4.将96孔板至于37°C孵育，充分反映30min。5.加入IOOul的孔雀绿试剂终止反应。其中孔雀绿试剂配方按商业提供配方如 下0.15%孔雀绿，钼酸铵，12.5% (ν/ν)的浓盐酸。使用630nm下测定光吸收强度 的变化。6.酶抑制率计算
权利要求
1.-种建立抗结核杆菌药物筛选模型的方法，其特征在于，通过下述方法，1)由MgCl2,海藻糖6-磷酸和重组海藻糖磷酸磷酸酶组成阳性对照组；2)不含有重组海藻糖磷酸磷酸酶的反应体系，由MgCl2,海藻糖6-磷酸，待测小分子 化合物(含5%。的DMSO溶剂)组成阴性对照组，所述待测小分子化合物中含5%。的DMSO溶剂；3)由MgCl2,海藻糖6-磷酸，重组海藻糖磷酸磷酸酶，不同浓度的待测小分子化合物 组成样品组，待测小分子化合物中含5%。的DMSO溶剂；其中所有反应体系均为50mM Tris-HCl (PH7.5)；4)通过比较阳性对照组、阴性对照组和样品组在反应后630nm下的光吸收强度，用 于以结核杆菌海藻糖磷酸磷酸酶为靶点的抑制剂筛选，进而筛选抗结核药物筛选。
2.按权利要求1所述的建立抗结核杆菌药物筛选模型的方法，其特征在于，其中，阳性对照组中各组分的浓度分别为50mM Tris-HCl缓冲液pH7.5，ImM海藻 糖-6-P，2mM MgCl2和O.lug纯化重组海藻糖磷酸磷酸酶；阴性对照组中各组分的浓度分别为50mM Tris-HCl缓冲液，pH7.5，ImM海藻 糖-6-P，2mM MgCl2,不同浓度的待测化合物样品；化合物样品测定组中各组分的浓度分别为50mM Tris-HCl缓冲液pH7.5，ImM海藻 糖-6-P，2mM MgCl2,不同浓度的待测化合物样品和O.lug纯化重组海藻糖磷酸磷酸酶。
3.权利要求1的筛选模型方法在筛选与海藻糖磷酸磷酸酶相互作用化合物中的应用。
4.一种筛选抗结核药物的方法，其特征在于利用权利要求1的筛选模型方法，采用所 述的阳性对照组，阴性对照组和化合物样品测定组的反应体系总体积均为50 μ 1，37°C孵 育30min后，加入IOOul的孔雀绿试剂终止反应；通过比较阳性对照组、阴性对照组和化 合物样品测定组在反应后630nm下的光吸收值，筛选以结核杆菌海藻糖磷酸磷酸酶为靶 点的抑制剂以及获得抗结核药物。
5.按权利要求4的筛选抗结核药物的方法，其特征在于其中孔雀绿试剂配方为 0.15%孔雀绿，钼酸铵，12.5% ν/ν的浓盐酸。
全文摘要
本发明属于医药生物技术领域，涉及一种建立抗结核杆菌药物筛选模型的方法，具体涉及一种以结核杆菌海藻糖磷酸磷酸酶为靶点的抗结核杆菌药物筛选模型，及其利用所述筛选模型筛选海藻糖磷酸磷酸酶抑制剂的方法。本发明通过比较阳性对照组、阴性对照组和样品组在反应后630nm下的光吸收强度，用于以结核杆菌海藻糖磷酸磷酸酶为靶点的抑制剂筛选，进而筛选抗结核药物筛选。所建立的模型筛选获得的结核杆菌海藻糖磷酸磷酸酶抑制剂具有与现有技术抗结核药物完全不同的作用靶点，能有效筛选新的抗结核菌的候选药物。
文档编号C12Q1/42GK102010889SQ20091019522
公开日2011年4月13日 申请日期2009年9月7日 优先权日2009年9月7日
发明者张旻, 张雪莲, 王洪海, 罗如松 申请人:复旦大学