专利名称：一种微生物发酵法生产透明质酸的方法
技术领域：
本发明属于微生物发酵领域，尤其是一种微生物发酵法生产透明质酸的方法。
背景技术：
透明质酸分子具有良好的保湿性和黏弹性 ，因而广泛应用于各种化妆品、保健品 眼科手术、关节注射、促进创伤愈合、调节血管壁的通透性、医用整形材料和保健品等方面， 本世纪90年代中期以来，国际市场透明质酸销量逐渐上升，目前全球药用透明质酸总销售 额为4. 2-5. 5亿美元，到2010年肯定会超过10亿美元。目前国内研究水平低下，生产能力 仅为10吨，远远不能满足市场的需求。目前国内大部分微生物发酵法生产透明质酸的企业采用的工艺发酵周期长，一般 在36-40左右，产物分子量低，产品透光率差(一般在90%左右)，蛋白质含量高，其成品葡 萄糖醛酸含量一般为35-38%，部分厂家透明质酸产品形态为纤维状，此种透明质酸溶解困 难，一般要2天左右，且收率低于75%，为了满足国内不断扩大的需求市场，透明质酸的生 产工艺亟待改善。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种发酵周期短、产品溶解性高、成 本低的微生物发酵法生产透明质酸的方法。本发明的目的是通过以下技术方案实现的一种微生物发酵法生产透明质酸的方法，其步骤包括(1)摇瓶种子液、(2)种子罐 种子液、(3)发酵培养得到发酵液，还包括以下步骤(4)发酵液的萃取提纯将发酵液经板框过滤后得滤液，加入2-4倍的乙醇溶液 沉淀，收集沉淀物，加入与滤液等体积的Nacl溶液搅拌溶解，进行二次板框过滤至澄清，得 到二次澄清液，将二次澄清液经0. 3-0. 5微米的滤膜或滤板过滤后，加入乙酸调节pH至 4. 0-5. 0，得到酸处理后的三次澄清液，再用乙醇溶液喷淋三次澄清液，再进行沉淀，得到沉 淀物；(5)干燥制粉将上述步骤得到的全部沉淀物经无水乙醇脱水后，用乳化泵进行 乳化制粉，得粉状沉淀，进一步用无水乙醇脱水后，50-60°C真空干燥后，含水控制在10%以 下，即得透明质酸。而且，所述板框过滤使用的硅藻土的型号为821号和616号。而且，所述821号和616号硅藻土的重量比例为1 1_5。而且，所述乙醇溶液的浓度为95% (ν/ν) 0而且，所述Nacl溶液的浓度为0. lmol/L。本发明的优点和积极效果是1、本发明采用复合诱变技术筛选出荚膜大，透明质酸产率高，不产透明质酸酶的 菌种的生产菌种，该菌种对发酵原料适应性强，透明质酸产品产率高，可达到6-7g/L，其回收率高达92%，其发酵时间仅为24-26小时，有效节省能耗。2、本发明采用独创的喷淋制粉技术，使产品结构形态更加细腻，使用性能更加优 越，溶解性更好，其透光率达到99 %。3、本发明产品的提纯过程采用板框过滤和微孔滤板过滤技术，替代活性炭吸附和 CPC吸附等复杂过程，使生产操作更加简便。4、本发明采用酸化乙醇喷淋制粉技术，制成的产品为粉末状，比絮状易于溶解。5、本发明能够将透明质酸开发成食品级、化妆品级以及医用级产品。
具体实施例方式下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。本发明使用的发酵菌种属于外来菌种，菌种分类是兽疫链球菌。一种微生物发酵法生产透明质酸的方法，其工艺过程如下(1)摇瓶种子液将斜面菌种接种于装有灭菌培养液400ml的IL锥形瓶中，37°C 培养12-16小时，光镜观察菌体生长良好，无杂菌污染，即可接种于种子罐中；(2)种子罐种子液按摇瓶种子液的配方配制培养液60L，加入种子罐中，通蒸汽 加热，121°C灭菌30分钟，冷却至37°C，用火焰法接种，将摇瓶种子液接种于种子罐中，通气 量60L/min，搅拌转速120-140/min，37°C培养12-16小时，光镜观察菌体生长良好，无杂菌 污染，即可接种于发酵罐中；(3)发酵培养按种子罐的配方，把糖的用量提高到6%，配制培养液600L，加入1 吨的发酵罐中，通蒸汽加热，121°C灭菌30分钟，冷却至37°C，将种子液通过移种管道接种 于发酵罐中，维持通气量400-600L/min，搅拌转速140-160/min，37°C培养24-26小时，发酵 过程中，糖的浓度下降至0.5%以下，PH下降很慢或不再下降时，即为发酵终点，得到含有 透明质酸发酵液；(以上3个步骤在马朝梅(广西柳州化学工业集团有限公司)，发酵法生 产透明质酸工艺研究，广西工学院学报，2007，18 (3) 8-12中有报道，属于现有技术，本发 明申请就不再更加详细描述)，本发明申请还包括(4)发酵液的萃取提纯将发酵液经板框过滤后得滤液，加入3倍的95%乙醇沉 淀，收集沉淀物，加入与滤液等体积的0. lmol/L的Nacl溶液搅拌溶解，进行二次板框过滤 至澄清，得到二次澄清液；将二次澄清液经0. 45微米的滤膜或滤板过滤后，加入乙酸调节 pH至4. 0-5. 0，得到酸处理后的三次澄清液，再用95%乙醇喷淋三次澄清液，再进行沉淀， 得到沉淀物；板框过滤的硅藻土的型号为821号和616号，将两种硅藻土按比例混合，得到后装 入板框进行过滤，821号和616号硅藻土的重量比例为1 1-5。(5)干燥制粉将得到的全部沉淀物经无水乙醇脱水后，用乳化泵进行乳化制粉， 得粉状沉淀，进一步用无水乙醇脱水后，50-60°C真空干燥后，含水控制在10%以下，即得透 明质酸。经本发明得到的透明质酸产品产率高，可达到6_7g/L，其回收率为92%。产品性能指标性状白色粉末或细小颗粒；
气味无臭无味；pH(lg/L) 6.5-7.0;澄清度(lg/L)透光率> 99% ；干燥失重<10%;分子量>1. 8X106 ；蛋白质<0.05%; 葡萄糖醛酸彡44%;铅<20mg/kg;石申<2mg/kg ；细菌总数<10个/克；粪大肠菌群不得检出；金黄色葡萄球菌不得检出；绿脓杆菌不得检出。
权利要求
一种微生物发酵法生产透明质酸的方法，其步骤包括(1)摇瓶种子液、(2)种子罐种子液、(3)发酵培养得到发酵液，其特征在于还包括以下步骤(4)发酵液的萃取提纯将发酵液经板框过滤后得滤液，加入2-4倍的乙醇溶液沉淀，收集沉淀物，加入与滤液等体积的Nacl溶液搅拌溶解，进行二次板框过滤至澄清，得到二次澄清液，将二次澄清液经0.3-0.5微米的滤膜或滤板过滤后，加入乙酸调节pH至4.0-5.0，得到酸处理后的三次澄清液，再用乙醇溶液喷淋三次澄清液，再进行沉淀，得到沉淀物；(5)干燥制粉将上述步骤得到的全部沉淀物经无水乙醇脱水后，用乳化泵进行乳化制粉，得粉状沉淀，进一步用无水乙醇脱水后，50-60℃真空干燥后，含水控制在10％以下，即得透明质酸。
2.根据权利要求1所述的一种微生物发酵法生产透明质酸的方法，其特征在于所述 板框过滤使用的硅藻土的型号为821号和616号。
3.根据权利要求2所述的一种微生物发酵法生产透明质酸的方法，其特征在于所述 821号和616号硅藻土的重量比例为1 1-5。
4.根据权利要求1所述的一种微生物发酵法生产透明质酸的方法，其特征在于所述 乙醇溶液的浓度为95% (v/v)
5.根据权利要求1所述的一种微生物发酵法生产透明质酸的方法，其特征在于所述 Nacl溶液的浓度为0. lmol/L。
全文摘要
本发明涉及一种微生物发酵法生产透明质酸的方法，其步骤包括(1)摇瓶种子液、(2)种子罐种子液、(3)发酵培养得到发酵液，还包括以下步骤(4)发酵液的萃取提纯将发酵液用乙醇沉淀后，再次溶解得溶解液，经二次板框过滤至澄清，再进行三次过滤得澄清液，再用乙醇喷淋澄清液，得喷淋沉淀物；(5)干燥制粉将上述步骤得到的全部沉淀物经无水乙醇脱水后，用乳化泵进行乳化制粉，得粉状沉淀，进一步用无水乙醇脱水后，50-60℃真空干燥后，即得透明质酸。本发明采用复合诱变技术筛选出荚膜大，透明质酸产率高，不产透明质酸酶的菌种的生产菌种，该菌种对发酵原料适应性强，透明质酸产品产率高，可达到6-7g/L，其回收率高达92％，其发酵时间仅为24-26小时，有效节省能耗。
文档编号C08B37/08GK101864471SQ20101030106
公开日2010年10月20日 申请日期2010年2月2日 优先权日2010年2月2日
发明者刘小兵 申请人:天津市康婷生物工程有限公司