一种杏酒酿造的酵母菌、制备方法及其获得的杏酒的制作方法

专利名称：：一种杏酒酿造的酵母菌、制备方法及其获得的杏酒的制作方法一种杏酒酿造的酵母菌、制备方法及其获得的杏酒发明领域本发明涉及微生物及发酵工业领域。具体的说，本发明涉及一种杏酒酿造的酵母菌、制备方法及其获得的杏酒。
背景技术：
：杏是新疆最具区域特色的果品之一，作为新疆的主要果树之一，近几年得到高速的发展。据2006年统计，新疆杏的产量达到76.88x104t,占全疆水果总产量的26.4%。目前杏子加工的主要产品是浓缩杏浆，该产品市场主要在国外但需求不大。随着新疆杏产量的大幅度增长，研究杏加工产品的技术急需提升。筛选适合酿制杏酒的酵母，分离出优良菌种，对于今后杏酒乃至果酒的开发具有重要作用。同时进一步深入研究和创新杏酒的加工工艺技术，开发出更加适合市场的杏酒。杏酒酵母及其发酵工艺的研究与开发，对于提高杏果的附加值，促进我国林果业经济增长，有着重要的意义。近年来，美国、澳大利亚、南非等国为了提高生产率并且使酒的酿造便于控制，保证安全高效生产，开始利用筛选的酵母进行纯种发酵以改变传统的自然发酵法。但在欧洲许多国家仍用当地葡萄粘附的多种野生酵母共同发酵酿造极具地域特色的天然葡萄酒，仍釆用自然发酵法酿酒。青岛农业大学杨晓英等利用果皮自然发酵，筛选出一株最佳苹果酒酿酒酵母SYOl,可耐12%的乙醇和200mg/L的S02,其发酵的原酒酒精度达12.96%(V/V),酒体澄清透明，具有苹果酒的典型风味。西北农林科技大学周一琴等对猕猴桃果实上的天然酵母进行了筛选，得到的X7-1酵母可耐受S02浓度为27.5mg/L，发酵力强，发酵速度慢，产香力强，酿造的原酒澄清透明，色泽浅黄，Vc含量高，酒精度可达9.8%(V/V),香气浓郁，典型性强，是猕猴桃果酒酿造的优良天然酵母菌。甘肃农业大学祝霞等采用兰州大接杏为原料，利用酵母发酵生产杏汁饮料。其果胶酶澄清试验采用正交试验设计，以透光率衡量。结果表明在pH4的条件下，利用果胶酶澄清杏汁的最佳组合为酶0.01%。，时间40min，温度45°C。杏汁发酵同样采用正交试验，通过感官评定对发酵汁作客观评定。结果显示发酵温度对发酵汁风味影响最大，其次为含糖量。最优发酵条件为发酵温度20。C，pH值4.0,含糖量4.0%，所用菌种为活性干酵母。在其试验中，曾分别使用了葡萄酒酵母、果酒酵母、活性干酵母，结果也表明了用活性干酵母酿制杏酒具有可行性。目前国外关于酿酒酵母的研究主要集中在葡萄酒酵母及其分子生物学的研究。国内主要集中在葡萄、苹果、猕猴桃等果酒酵母菌种的选育、分子生物学特性、菌种的固体化技术等方面的研究。涉及杏酒酵母研究的有湖南农业大学的刘素纯等人，其从杏酒发酵液中分离获得了17个酵母菌抹，根据形状的不同分为3类。测定后得出，性能最好的一类酵母发酵酒含乙醇10%，能耐8%10%酒精及42。C的高温，在61%的糖液中仍能发酵。其并未将菌种纯化分离，只是将菌种粗略归类，也未对菌种性能进行深入的鉴定。
发明内容针对目前没有发酵性能优良、耐受性好的杏酒专用酵母，本发明提供一种耐受性好，发酵性能优良的酵母菌种、确定的生产杏酒的工艺及其制备获得的杏酒。本发明从国家果树资源圃杏栽培区的土壤、杏果皮、不同杏品种自然发酵液中取样，筛选出一批生长良好的酵母菌抹，从中优选出一株编号为FM07的酵母菌林，经鉴定为酵母菌，该菌林确定的发酵工艺能生产杏酒。本发明具体提供了一种耐受性好，发酵性能优良的酵母菌种，命名为FM07,参照Bamett等编著的《酵母菌特征与鉴定》对FM07菌抹进行形态学，生理生化鉴定。FM07菌抹于申请日前已保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏日期是2009年02月27日，保藏号是CGMCCNo.2927。经微生物学鉴定为酿酒酵母(Sacc/wTOwycMcewv/w'ae)。该酵母易在偏酸性且含糖较多的环境中生长，例如，在水果、蔬菜表面，发酵的果汁、酒曲、果园土壤中生长，个体形态呈椭圆形，菌落形态呈乳白色，表面光滑、湿润、粘稠、易被挑起，菌落质地均勻。该酵母营专性或兼性好氧生活，在缺乏氧气时，通过将糖类转化成为二氧化碳和乙醇来获取能量。能发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖，不能发酵乳糖。菌株为酵母属中的成员，通过API20CAUX菌种鉴定系统，表明FM07菌林该菌种在接种量为1%时，可使25。C发酵的400mL杏汁的C02失重速率达到2.46g/h。在糖份等营养成分充足的情况下，可酿造出酒精度达14.5。/。(V/V)的杏酒，并且杏酒的感官评价非常出色。在酒精度为14%的杏汁中接种FM07菌株4d可以起酵，因此耐酒精性能优良；S02浓度为200mg/L的杏汁接种FM07菌抹6d可以起酵，因此耐S02性能好；该菌株于45。C条件下在孟加拉红平板培养基上培养一周，基本可以正常生长，该菌林活化后接种杏汁，在l(TC的低温条件下具有一定的发酵速率，表明具备优良的耐高低温性能；且该菌抹在含糖量50%的孟加拉红平板培养基上可以正常生长，具备耐高糖性能。同时，在本发明的FM07酵母菌抹的基础上，本发明提供了一种杏酒的生产工艺，具体步骤如下(l)选择成熟的鲜杏，去除有病虫害、腐烂变质的果实，去除杂物，并用清水将原料果实上的泥土、微生物和农药洗净待用；(2)将洗净的杏果破碎成4mm5mm的碎块，破碎时避免原料与空气的接触，将饮用纯净水配成0.1%(w/v)的抗坏血酸护色液，与破碎后的杏果实按质量比1:0.4混合打浆；(3)将鲜杏打桨后按质量比1:2与蒸馏水混合，加入亚硫酸使杏桨中的有效S02达到80mg/L,同时加入0.06%(w/v)果胶酶，50。C保持2小时，使杏果实中的果胶物质分解为可溶性成分，提取色素和芳香成分等有效物质。4000r/min离心IO分钟取上清液，调整糖度，使其可溶性固形物为lOBrix,121。C高压蒸汽杀菌20min;(4)主发酵按1%的接种量将酵母菌活化液加入澄清杏汁中，加发酵栓密闭发酵，25。C发酵，每12h称重一次，连续两次重量不再变化，主发酵结束；(5)主发酵结束，分离出酵母泥，加发酵栓继续进行15d后发酵；(6)将上述步骤获得的原酒发酵结束后进行下胶，按2g酪蛋白加入含有O.lg碳酸钠的20ml水中，水浴加热溶解，定容至100ml。吸取10ml加入1L酒中，即200mg/L的用量；(7)搅拌中加入0.5%的硅藻土，搅拌混匀2分钟、过滤1遍-2遍；(8)将过滤过的杏酒装瓶加塞，60。C保持35min杀菌。本发明还进一步提供了利用菌抹FM07得到的杏酒，具备优良品质的杏酒产品理化指标酒精度12~14.5%(V/V)总糖50~100g/L总酸2~8g/L感官指标色泽金黄色或浅黄色、澄清透明气味具有典型的杏果香气，有良好的醇香口感酒体丰满、协调性好、酸度适中、具有杏果典型的风味。通过实施本发明具体的技术指标，实现本
发明内容，可以达到以下有益效果A:获得了一抹发酵性能良好，耐受性好的酵母菌FM07。接种量在1%，25。C发酵时，可使400mL杏汁的C02失重速率达到2.46g/h。在糖份等营养成分充足的情况下，酿造的杏酒酒精度可达14.5%(V/V)，并且杏酒的感官评价非常出色；将该菌抹接种在酒精度14%的杏汁中4d可以起酵，耐酒精性能优良；S02浓度为200mg/L的杏汁接种FM07菌抹6d可以起酵，耐S02性能好；该菌抹于45。C条件下在孟加拉红平板培养基上培养一周，基本可以正常生长，该菌株活化后接种杏汁，在l(TC的低温条件下具有一定的发酵速率，表明具备优良的耐高低温性能；且该菌抹在含糖量50%的孟加拉红平板培养基上可以正常生长，具备耐高糖性能。弥补了目前杏酒专用酵母缺乏的现状。B:获得了优良的杏酒产品，其色泽金黄清亮、果香和酒香诱人、酒体丰满舒适、回味悠长。丰富了目前我国果酒产品市场。图1显示为l(TC低温下酵母菌发酵力的测定图；图2显示为15。C低温下酵母菌发酵力的测定图。具体实施例方式实施例一酵母菌种的分离纯化(1)酵母菌分离源的选择①在轮台国家果树资源圃杏试验地中不同位置随机分别取5处土壤做为酵母菌的分离源②选择10个不同品种的杏果实，取其表皮进行分离③选择20个不同杏品种进行自然发酵，起酵后分别取其发酵汁进行分离(2)酵母菌的分离纯化①取所采土样100g加入灭过菌的250mL三角瓶中，加入200mL无菌蒸馏水稀释均匀，接种针挑取液体接种于平板培养基上。②将所取杏果皮50g装入灭过菌的250mL三角瓶中，加入200mL无菌蒸馏水稀释均匀，接种针挑取液体接种于平板培养基上。③将杏子破碎去核后掰成若干小片，取约100g放入500mL无菌三角瓶中，加200mL无菌蒸馏水，加发酵栓，28。C培养48h。然后接种针挑取自然发酵液接种于平板培养基上。④三次纯化培养将所有平板培养基28。C培养48h后，挑取单个特征明显的菌落再次接种于平板培养基上，28。C培养48h后再次挑取单个菌落接种于平板培养基上，28。C培养48h。⑤菌种保藏备用三次纯化培养后得到的酵母菌分别接种于试管斜面培养基上，每抹菌接种3个斜面。⑥试验中所用纯化保藏的培养基均为孟加拉红培养基(北京奥博星生物技术有限责任公司生产)，其主要成分(g/L)有蛋白胨(5g),磷酸二氢钾(lg),硫酸镁(0.5g),琼脂(18.4g)，葡萄糖(10g)，氯霉素(l.lg)，孟加拉红(0.033g)。⑦试验得到生长特性良好的酵母菌林20抹实施例二酵母菌种的基本酿酒性能试验①澄清杏汁的制备将新鲜无病虫害的小白杏破碎、去核、打浆，与蒸馏水按质量比1:1混合，加入0.1%利华果胶酶与80mg/L的S02,室温放置24h。4000r/min离心取上层清液。按照GB/T15038-2006中的菲林试剂直接滴定法测定杏汁中总糖含量。②杏汁原料的调整取澄清杏汁400mL于500mL三角瓶中，根据杏汁总糖含量加入白砂糖，使其总糖含量达到250g/L。三角瓶包好后高压蒸汽锅121°C，20min灭菌，自然冷却。③接种发酵将不同酵母菌分别接种于三角瓶所装杏汁中，每瓶接种两环，加发酵栓25。C发酵，每天12h测定发酵装置的重量。统一发酵20天后加80mg/LSO2结束发酵。通过转罐将酵母泥分离。④后处理所得杏酒加入1%(w/v)的硅藻土，搅拌摇匀后过滤三遍，装瓶后65。C水浴锅中杀菌35min。⑤理化指标测定按照GB/T15038-2006测定杏酒酒精度、总糖含量、总酸含量。发酵速率的计算(C02失重速率)(发酵酒体初始重量-发酵酒体恒重时重量y发酵酒体恒重所需时间感官指标见表l表l感官评定<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>由表l可知，菌种FM06、FM07和FM17发酵的杏酒色泽金黄、晶莹透亮,具备杏子的香气，口感纯正，酒体协调。FM07产生的酒精度最高为14.5%(V/V)。实施例三酵母菌种的酿酒性能研究中的酒精耐受性试验釆用杜氏管发酵法，将FM06、FM07和FM17酵母菌分别接入不同乙醇浓度(6%、8%、10%、12%、14%、16%,V/V)的灭菌杏清汁中,在相同条件下进行培养,观察杜氏管中的气泡产生情况,比较各酵母菌林对乙醇的耐受程度,进一步确定适合杏酒酿造的菌抹。试验平行重复3次。表2酵母菌的乙醇耐性试验结果齒种乙醇浓度(％)6810121416FM06ldldld2d--FM07ldld2d2d4d-FM17ld2d2d---从表2可以看出，菌抹FM07对乙醇有较好的耐性，在14%酒精浓度的杏汁中4d亦可产气。且在营养充足的情况下产酒精量最大。所以FM07耐酒精能力强，完全能满足杏酒酿造的要求。实施例四本发明酵母菌种的酿酒性能研究中S02耐受性试验配制3组S02浓度不同的20mL灭菌杏清汁试管培养液，分别接种2环FM06、FM07和FM17酵母菌抹，于28。C恒温培养，观察起酵情况，结果见表3表3初筛酵母S02耐受性试验茵种S。2浓度(rng/L)80120160200240280FM06ld起酵2d起酵16d不起酵16d不起酵16d不起酵16d不起酵FM07ld起酵ld起酵4d起酵6d起酵16d不起酵16d小起酵FM17ld起酵ld起酵2d起酵16d不起酵16d不起酵16d不起酵当酵母接入到一定S02浓度的发酵液中，若16d不能正常起酵，则它的前一个S02浓度即为此酵母的S02耐受浓度。由表3可得，当S02浓度为160mg/L时，FM06酵母16d不能正常起酵，即FM06酵母最大S02耐受浓度为120mg/L;同样，FM07酵母最大SCV耐受浓度为200mg/L;FM17酵母最大S02耐受浓度为160mg/L。3林酵母的S02耐受能力大小依次为FM07>FM17>FM06,其中FM07酵母耐受S02能力最强。实施例五本发明酵母菌种的酿酒性能研究中高温耐受性试验接种FM06、FM07和FM17酵母菌抹在孟加拉红斜面培养基上，分别在35。C、40°C、45°C、50。C培养一周，观察菌落生长状况，各做三个重复。表4菌抹对高温耐受性结果菌种培养温度rc)35404550FM06++-—FM07+++-FM17++--从表4可以看出，菌抹FM06、FM17在45°C时均不能正常生长，而菌抹FM07能耐受45°C,说明FM07具有良好的耐高温性能。实施例六本发明酵母菌种的酿酒性能研究中低温耐受性试验在500mL三角瓶(已经灭菌)中装入灭过菌的杏清汁400mL,按1%的接种量分别接种活化好的FM06、FM07、FM17酵母菌液，加发酵栓分别在10°C、15。C进行发酵。每天定时测定重量，根据二氧化碳的失重值，可以从中得知在低温下各酵母菌发酵力的大小。参见附图1、2可以看出，菌株FM07在10。C、15°C时的发酵速率都较快，说明该菌林的在低温下有较强的耐受力。实施例七本发明酵母菌种的酿酒性能研究中高糖耐受性试验将FM06、FM07、FM17菌林分别接种在含30%、40°/。、50%、60%葡萄糖的孟加拉红平板培养基上，培养一周，观察其生长状况。从表5可以看出，含糖量为50%时菌抹FM07、FM17仍能生长，而当含糖量达到60%时，三株菌抹均不能生长。表5高糖耐受性试验齒种霜《30405060FM06++——FM07+++-FM17+++—实施例八本发明的一种酵母菌种酿造杏酒工艺(1)果胶酶澄清杏汁试验取pH4.0的杏浆，进行果胶酶浓度(0.02%,0.04%，0.06%)、处理温度(40°C，50°C,60°C)、处理时间(4h,8h，12h)的正交试验。4000r/min离心后取上清液在紫外分光光度计660nm下测定透光率。表6果胶酶澄清处理正交试验结果实验号闪素透光率(％)果胶,用呈(％)处理温度rc)处理时间(h)11(0.02)1(40)1(4)90.822(0.04)2(50)2(8)90.033(0.06)3(60)3(12)89.241(0,02)2(50)3(12)91.92(0.04)3(60)1(4)87.963(0.06)1(40)2(8)96.671(0,02)3(60)2(8)91,282(0.04)1(40)3(12)96,793(0.06)2(50)1(4)91.4Ki273,9000284.1000270.1000K2274.6000273.3000277.8000K3277.2000268.3000277.8000k,91.300094.7000卯.0333k291.533391.100092扁0k392.400089,433392.6000R1.10005.26672.5667试验结果表明，影响透光率的主次因子依次为温度>时间>酶的用量。处理时间8h后随着时间的延长，酶已基本失去作用。通过验证试验，酶解最佳条件为果胶酶用量0.06%、温度50。C、时间8h,参见表6。(2)杏水比试验将杏与水按质量比i:o.2、1:0.4、1:0.6、1:0.8混合打浆后，4000r/min离心后取清汁。调整杏汁糖度达到240g/L,接种FM07菌种发酵表7杏水比试验结果序号杏水质呈比杏酒总糖(g/L)杏酒总酸(g/L)ffiMf，、(WV'感官评定(白'分制)11:0.214.57,912,28621:0.413.67.513.48531:0.69.76.814.07841:0.88.96.512.273实验结果表明，杏水质量比为1:0.2时杏酒的感官得分最高。考虑到澄清杏汁的难度及成本因素，在感官评定差别不大的情况下，将杏水比定为1:0.4,参见表7。(3)含糖量对杏酒口感的影响取澄清杏汁，将含糖量分别调整为220g/L、240g/L、260g/L、280g/L、300g/L表8残糖含量对杏酒口感的影响序号初始含糖呈(g/L)杏酒总糖(g/L)杏酒总酸(g/L)酒精度％(v/v，20°C)感官评定(白'分制)12204.94.713.265224014.56.213.467326037.75.312.578428064.56.113.289530086.25.513.581通过感官评定，5种不同的处理得到的杏酒色泽基本一致，均为金黄色，清亮。第4种处理得到的杏酒甜度适宜，口感协调、柔和。第1种和第2种酒基本无甜味，无法掩盖杏酒本身的酸味。第3种处理甜味太淡，对酒的口感影响不大。第五种处理甜度稍大，影响了杏酒的清爽感，参见表8。权利要求1、一种能生产杏酒的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CGMCCNo.2927。2、一种利用权利要求1所述的酿酒酵母(5^ctoramyc"cewv/Wae)CGMCCNo.2927生产杏酒的方法，其特征在于，所述方法具体步骤包括(1)选择成熟的鲜杏，去除有病虫害、腐烂变质的果实，去除杂物，并用清水将原料果实上的泥土、微生物和农药洗净待用；(2)将洗净的杏果破碎成4mm-5mm的碎块，破碎时避免原料与空气的接触，将饮用纯净水按w/v计配成0.1%的抗坏血酸护色液，与破碎后的杏果实按质量t匕l:0.4〉'昆合打ilt;(3)将鲜杏打桨后按质量比1:2与蒸馏水混合，加入亚硫酸，使杏桨中的有效S02达到80mg/L,同时按w/v加入0.06%果胶酶，50。C保持2小时，使杏果实中的果胶物质分解为可溶性成分,提取色素和芳香成分等有效物质，经4000r/min离心10分钟取上清液，调整糖度，使其可溶性固形物为10Brix，121。C高压蒸汽杀菌20min;(4)在主发酵中，以v/v计按1%的接种量将酵母菌活化液加入澄清杏汁中，加发酵栓密闭发酵，25X:发酵，每12h称重一次，连续两次重量不再变化，主发酵结束；(5)主发酵结束后，分离出酵母泥，加发酵栓继续进行15d后发酵；(6)将上述步骤获得的原酒发酵结束后进行下胶，按2g酪蛋白加入含有O.lg碳酸钠的20ml水中，水浴加热溶解，定容至100ml，吸取10ml加入1L酒中，即200mg/L的用量；(7)搅拌中加入0.5%的珪藻土，搅拌混匀2分钟、过滤1遍-2遍；(8)将过滤过的杏酒装瓶加塞，6(TC保持35min杀菌。3、一种利用权利要求1所述的酿酒酵母CS"cc/wramycescwev/w'ae)CGMCCNo.2927和权利要求2所述的生产杏酒的方法获得杏酒，其特征在于，所述的杏酒具有12~14.5%(V/V)酒精度、50-100g/L总糖、2-8g/L总酸；色泽为金黄色或浅黄色、酒体澄清透明，具有典型杏果香气，有良好的醇香；酒体丰满、协调性好、酸度适中，具有杏果典型的风味。全文摘要本发明公开了一种生产杏酒的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CGMCCNo.2927和利用此菌株发酵杏酒的制备方法及由此酿造的杏酒。本发明通过不同途径分离纯化多株酵母菌，通过酒精、SO₂、高低温、高糖耐受力试验及杏酒发酵试验，筛选出酿酒性能优良的杏酒酵母一株，并且确立了杏酒发酵工艺，酿造出了色泽金黄清亮、果香酒香浓郁、口感丰满舒适的杏酒，广泛应用于轻工业生产等领域。文档编号C12N1/18GK101603014SQ20091011327公开日2009年12月16日申请日期2009年3月27日优先权日2009年3月27日发明者何峰江,力傅,周晓明,康廖,张大海,麟徐申请人:新疆农业大学