专利名称：黄瓜绿斑驳花叶病毒一步rt-pcr检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及一种黄瓜绿斑驳花叶病毒一步RT-PCR检测试剂盒及其检测方法，属 于生物技术领域，专用于口岸检验检疫和农业植检部门对黄瓜绿斑驳花叶病毒的快速检 测。
背景技术：
黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)属于烟草花叶病毒属(Cucumber green mottle mosaicvirus, Tobamovirus)成员，病毒基因组为正单链RNA，全长约6. 5kb。CGMMV以西瓜 (Citrulluslanatus)、 (Cucumis sativus)、舌甘/R (Cucumis melo)、fl〒 (Iagenaria siceraria)、南瓜(Cucurbita moschata)等葫芦科作物为主要寄主。CGMMV目前主要分布 在欧洲、亚洲和南美洲，包括英国、德国、荷兰、丹麦、俄罗斯(前苏联)、希腊、奥地利、捷克 斯洛伐克、芬兰、南斯拉夫、罗马尼亚、波兰、匈牙利、西班牙、瑞典、乌克兰、拉托维亚、日本、 印度、韩国、巴基斯坦、以色列、沙特阿拉伯、伊朗、巴西及中国等国家。CGMMV具有很强的传 染性和稳定性，是一种危害比较大的病毒，可以造成葫芦科作物严重减产。据报道，前苏联 的Georgia地区，CGMMV发生率曾经达80%-100%，使得西瓜减产30% (Medvedskaya I G, Zashchita Rastenii，1981，5 :44_45)。2004年，CGMMV在巴基斯坦南部葫芦上发生率达 46. 9%，引起的产量损失严重(Ali et al. , Journal of Phytopathology, 2004,152 (11) 677-682)。2005年，我国辽宁省盖州市西瓜染病面积达333hm2，其中13hm2绝收(古勤生， 中国瓜菜，2007，(1) 47-48)。鉴于CGMMV的危险性，口岸迫切需要加强该病毒的检测，以防 止该病毒传播、扩散和危害。目前，用于植物病毒检测的方法主要包括指示植物法、电镜法、血清学法和分子生 物学法。CGMMV可通过接种苋色藜、曼陀罗、矮牵牛等指示植物来鉴定，但与同属其他病毒表 现的症状十分相似，因而可靠性不高，并且检测周期长。电镜法检测CGMMV不仅需要特殊的 仪器设备，而且材料前处理较为复杂。血清学检测具有所需设备简单、操作简便、成本低廉 和反应灵敏的优点，但在样品量极少或病毒在组织中含量很低时，用血清学方法检测仍难 以检出。与血清学检测方法相比，基于核酸水平的RT-PCR分子检测方法具有灵敏度更高、 特异性更强、结果更可靠等显著优点，但到目前为止，尚未见有关CGMMV —步RT-PCR检测试 剂盒及其检测方法的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种黄瓜绿斑驳花叶病毒一步RT-PCR检测试剂盒及其检 测方法，用于进出境葫芦科植物及产品上黄瓜绿斑驳花叶病毒的快速检疫鉴定。本发明技术方案如下(一 ) 一种黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV) —步RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所 述试剂盒包括
1)A#管，内装黄瓜绿斑驳花叶病毒的上游引物，浓度为ΙΟμπιοΙ/L，引物序列为5， -TGCTTCTTATGTTCCCGTCA-3，；2)Bs管，内装黄瓜绿斑驳花叶病毒的下游引物，浓度为ΙΟμπιοΙ/L，引物序列为 5' -GCCCATAGAAACTTCAACGTC-3‘；3)Cs 管，内装 PCR Buffer，浓度为 IOX ；4) Ds 管，内装 Mgcl2,浓度为 25mmol/L ；5)Es 管，内装 dNTPs，浓度为 10mmol/L ；6) f#管，内装RNA酶抑制因子，浓度为40U/ μ L ；7)Gfl管，内装反转录酶，浓度为5U/y L ；8)硭管，内装0嫩聚合酶，浓度为5"1^;9) Ifl管，内装含有黄瓜绿斑驳花叶病毒的阳性对照CK+ ；10) Jfl管，内装不含有黄瓜绿斑驳花叶病毒的阴性对照CK-；11)1(#管，内装尺妝86-什66(1(1!120。(二)上述黄瓜绿斑驳花叶病毒一步RT-PCR检测试剂盒的检测方法，其特征在于 包括如下步骤1)根据待检测样品的数量，在每PCR管内加入As液2 μ L、Bs液2 μ L、Cs液5 μ L、 Dfl液10 μ L、E#液5 μ L、F#液1 μ L、G#液1 μ L、H#液1 μ L和Κ#液21 μ L，混勻、瞬离后备用；2) RT-PCR反应取待检测样品、阴性对照和阳性对照RNA模板各2 μ L，分别加入 步骤⑴配制好的各PCR管内，混勻、瞬离后进行以下的RT-PCR反应先42°C cDNA合成 30min，接着94°C预变性5min，之后进入以下循环94°C变性30s，54°C退火45s，72°C延伸 lmin，共35个循环；最后一轮循环之后再72°C延伸IOmin ；3) PCR扩增产物电泳检测=RT-PCR反应结束后，取产物10 μ L，用1. 5%琼脂糖凝胶 电泳进行检测，溴化乙锭染色后在凝胶成像系统上观察并记录实验结果。含有黄瓜绿斑驳花叶病毒的样品的电泳检测结果为在567bp处出现明亮的DNA条
市ο较之现有技术而言，本发明具有如下优点(1)检测试剂盒制作方法简单，便于大规模产业化生产；整个检测过程(RT-PCR) 在一个PCR管内一步完成，不仅简化操作程序、缩短检测时间和降低检测成本，而且还避免 了交叉污染，提高了检测效率。(2)本发明提供的检测方法具有操作简便、灵敏度高、特异性强和准确度好的优 点，适合于大批量样品的检测。
图1是受CGMMV感染的黄瓜检测结果示意图。其中M =DNA分子量标准(IOObp)；1 检测样品(带病黄瓜)；2 阳性对照；3 阴性对照。
具体实施例方式以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。实施例1
黄瓜绿斑驳花叶病毒一步RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括1)A#管，内装黄瓜绿斑驳花叶病毒的上游引物，浓度为ΙΟμπιοΙ/L，引物序列为 5， -TGCTTCTTATGTTCCCGTCA-3，；2)Bs管，内装黄瓜绿斑驳花叶病毒的下游引物，浓度为ΙΟμπιοΙ/L，引物序列为 5' -GCCCATAGAAACTTCAACGTC-3‘；3)Cs 管，内装 PCR Buffer，浓度为 IOX ； 4) Ds 管，内装 Mgcl2,浓度为 25mmol/L ；5)Efl 管，内装 dNTPs，浓度为 10mmol/L ；6) Ffl管，内装RNA酶抑制因子，浓度为40U/μ L ；7)Gfl管，内装反转录酶，浓度为5U/y L ；8)硭管，内装0嫩聚合酶，浓度为5"1^;9) Ifl管，内装含有黄瓜绿斑驳花叶病毒的阳性对照CK+ ；10) Jfl管，内装不含有黄瓜绿斑驳花叶病毒的阴性对照CK-；11) Kfl 管，内装 RNase-free ddH20。上述乂管_1(#管可分别为1管，其中各管含量可分别如下A#管的含量为IOOyL ； Bs管的含量为100 μ L ;C#管的含量为150 μ L ;D#管的含量为300 μ L ;Ε#管的含量为150 μ L ； Ffl管的含量为25 μ L ;G#管的含量为25 μ L ;Η#管的含量为25 μ L ;1#管的含量为50 μ L ；Jfl 管的含量为50 μ L ;Κ#管的含量为lmL。实施例2 所述黄瓜绿斑驳花叶病毒一步RT-PCR检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤1)根据待检测样品的数量，在每PCR管内加入As液2 μ L、Bs液2 μ L、Cs液5 μ L、 Dfl液10 μ L、E#液5 μ L、F#液1 μ L、G#液1 μ L、H#液1 μ L和Κ#液21 μ L，混勻、瞬离后备用；2) RT-PCR反应取待检测样品、阴性对照和阳性对照RNA模板各2 μ L，分别加入 步骤⑴配制好的各PCR管内，混勻、瞬离后进行以下的RT-PCR反应先42°C cDNA合成 30min，接着94°C预变性5min，之后进入以下循环94°C变性30s，54°C退火45s，72°C延伸 lmin，共35个循环；最后一轮循环之后再72°C延伸IOmin ；3) PCR扩增产物电泳检测=RT-PCR反应结束后，取产物10 μ L，用1. 5%琼脂糖凝胶 电泳进行检测，溴化乙锭染色后在凝胶成像系统上观察并记录实验结果。检测结果含有黄瓜绿斑驳花叶病毒的样品电泳检测结果为在567bp处出现明亮 的DNA条带(如图1)，否则无。序列表.SEQ. txtSEQUENCE LISTING<110>福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心<120>黄瓜绿斑驳花叶病毒一步RT-PCR检测试剂盒及其检测方法<130><160>2<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>20
<212>DNA<213>人工序列<400>1tgcttcttat gttcccgtca 20<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>2gcccatagaa acttcaacgt c 2权利要求
一种黄瓜绿斑驳花叶病毒一步RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括1)A#管，内装黄瓜绿斑驳花叶病毒的上游引物，浓度为10μmol/L，引物序列为5’-TGCTTCTTATGTTCCCGTCA-3’；2)B#管，内装黄瓜绿斑驳花叶病毒的下游引物，浓度为10μmol/L，引物序列为5’-GCCCATAGAAACTTCAACGTC-3’；3)C#管，内装PCRBuffer，浓度为10×；4)D#管，内装Mgcl2，浓度为25mmol/L；5)E#管，内装dNTPs，浓度为10mmol/L；6)F#管，内装RNA酶抑制因子，浓度为40U/μL；7)G#管，内装反转录酶，浓度为5U/μL；8)H#管，内装DNA聚合酶，浓度为5U/μL；9)I#管，内装含有黄瓜绿斑驳花叶病毒的阳性对照CK+；10)J#管，内装不含有黄瓜绿斑驳花叶病毒的阴性对照CK-；11)K#管，内装RNase-free ddH2O。
2.根据权利要求1所述的黄瓜绿斑驳花叶病毒一步RT-PCR检测试剂盒，其特征在于 所述As管-Ks管分别为1管，其中As管的含量为100 μ L ;BS管的含量为100 μ L ;CS管的含 量为150 μ L ;D#管的含量为300 μ L ;Ε#管的含量为150 μ L ;F#管的含量为25 μ L ;G#管的含 量为25 μ L ;Η#管的含量为25 μ L ;1#管的含量为50 μ L ； Jfl管的含量为50 μ L ;Κ#管的含量 为 ImL。
3.根据权利要求1所述黄瓜绿斑驳花叶病毒一步RT-PCR检测试剂盒的检测方法，其特 征在于包括如下步骤1)根据待检测样品的数量，在每PCR管内加入As液2μ L、Bs液2 μ L、Cs液5 μ L、Dfl液 10 μ L、Es液5 μ L、F#液1 μ L、G#液1 μ L、Η#液1 μ L和Ks液21 μ L，混勻、瞬离后备用；2)RT-PCR反应取待检测样品、阴性对照和阳性对照RNA模板各2 μ L，分别加入步骤 1)配制好的各PCR管内，混勻、瞬离后进行以下的RT-PCR反应先42°C cDNA合成30min， 接着94°C预变性5min，之后进入以下循环94°C变性30s，54°C退火45s，72°C延伸lmin，共 35个循环；最后一轮循环之后再72°C延伸IOmin ；3)PCR扩增产物电泳检测=RT-PCR反应结束后，取产物10μL，用1. 5%琼脂糖凝胶电泳 进行检测，溴化乙锭染色后在凝胶成像系统上观察并记录实验结果。
4.根据权利要求3所述黄瓜绿斑驳花叶病毒一步RT-PCR检测试剂盒的检测方法，其特 征在于含有黄瓜绿斑驳花叶病毒的样品电泳检测结果为在567bp处出现明亮的DNA条带。
全文摘要
本发明涉及黄瓜绿斑驳花叶病毒一步RT-PCR检测试剂盒及其检测方法，该试剂盒包括一步RT-PCR反应的各种试剂如下黄瓜绿斑驳花叶病毒的上游引物，黄瓜绿斑驳花叶病毒的下游引物，PCR Buffer，Mgcl2，dNTPs，RNA酶抑制因子，反转录酶，DNA聚合酶，含有黄瓜绿斑驳花叶病毒的阳性对照，不含有黄瓜绿斑驳花叶病毒的阴性对照，RNase-free ddH2O。本发明不仅制作方法简单，便于大规模产业化生产，而且检测方法具有操作简便、灵敏度高、特异性强和准确度好的优点，整个检测过程在一个PCR管内一步完成，既简化操作程序、缩短检测时间，又避免交叉污染、提高检测效率，适合大批量样品的快速检测。
文档编号C12Q1/68GK101845513SQ20091011306
公开日2010年9月29日 申请日期2009年12月25日 优先权日2009年12月25日
发明者林双庆, 沈建国, 王念武, 翁泽斌, 翁瑞泉, 陈劲松 申请人:福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心