专利名称：铁皮石斛原球茎培养物及其大规模继代培养的方法
技术领域：
本发明涉及药用植物的组织培养物及其培养方法，特别是涉及一种铁皮 石斛原球茎培养物及其培养的方法，属植物生物技术工程领域。
背景技术：
铁皮石斛Herba Dendrodii Officinalis别名铁皮兰、黑节草。来源为 兰科植物铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo的茎。植物形 态茎圆柱形，高15 50cm，粗4 8mm。叶鞘带肉质，矩圆状披针形，长3 6.5cm，宽0.8 2cm，顶端略钩。总状花序生于具叶或无叶茎的中部，有花 2 4朵；花淡黄绿色，稍有香气；萼片长1.2 2cm;花瓣短于萼片，唇瓣 卵状披针形，长1.3 1.6cm宽7 9mm，先端渐尖或短渐尖，近上部中间有 圆形紫色斑块，近下部中间有黄色胼胝体。花期4 6月。生于树上和岩石 上。多加工成枫斗。
道教医学经典《道藏》中，铁皮石斛名列中华"九大仙草"之首。明代 李时珍的《本草纲目》中记载石斛除痹下气、补内脏虚劳赢痩，强阴益精。 久服，厚肠胃，补内绝不足。来胃气，长肌肉，益智除惊，轻身延年。1987 年国务院将铁皮石斛列为重点保护的中药材之一 。
目前石斛生产主要采用，试管苗繁殖到温室种植，生产周期较长达3-4年。
发明内容
本发明目的是提供一种铁皮石斛原球茎培养物大规模继代培养的方法， 代替人工种植，有生产周期短，可控环境等特征。 本发明目的是通过如下技术方案实现的。
本发明铁皮石斛原球茎大规模继代培养的方法包括以下步骤 I 、植株诱导-
A、选取健壮铁皮石斛野生苗，选取其茎段为外植体，先用流水冲洗干
净，放入灭菌的广口瓶内再用75%酒精消毒20-30秒，用无菌水冲洗2次，将冲洗后的茎尖用0. 1%的升汞浸泡8-11分钟，然后用无菌水冲洗4-5次， 接种于下列无菌培养及内，诱导无菌侧芽，在温度25±2度，光照强度 1600-2000LUX、光照时间10小时培养30天；
B、 选择生长良好，色泽深绿、大小适中的的侧芽茎段为种源，在超净 工作台上接种于原球茎诱导培养基内，在温度25±2度，光照强度 1600-2000LUX、光照时间10小时培养60天，即可得原球茎。
C、 原球茎增殖筛选驯化将诱导的原球茎，在25±2度，光照强度 1600-2000LUX、光照时间10小时，继代培养，45天/代，经过20代继代筛 选，获得可用于无激素培养的铁皮石斛原球茎；
D、 原球茎继代
将筛选的原球茎在间歇式液态培养基上，接种浓度10%， 25±2度，光 照强度1600-2000LUX、光照时间10小时间歇式培养18-22天，转移到固态 培养基lg/瓶，25±2度，光照强度1600-2000LUX、光照时间10小时培养 45天;
2、根据权利要求所述的铁皮石斛无激素培养方法，所述培养基
分别称取硝酸钾190重量份、硝酸铵165重量份、硫酸镁37重量份、 磷酸二氢钾17重量份、氯化钙44重量份，分别加水1000体积份，并加热 至完全溶解；将5种溶液混合，加水至5000体积份，混合均匀，得MS培养 基母液A， 4'C保存备用；
分别称取硫酸锰6. 76重量份、硫酸锌3. 44重量份、硼酸2. 48重量份、 碘化钾0. 332重量份、钼酸钠0. 1重量份、硫酸铜0. 00005重量份、氯化钴 0.00005重量份，分别加水200体积份，并加热到完全溶解；将7种溶液混 合，加水至2000体积份，混合均匀，得MS培养基母液B， 4。C保存备用；
分别称取EDTA-2Na7. 45重量份、硫酸亚铁5. 57重量份，分别加水1000 体积份，并加热至完全溶解；将2种溶液混匀，加热，加水至2000体积份， 得MS培养基母液C， 4'C保存备用；
称取甘氨酸0. 4重量份、盐酸硫胺素0. 08重量份、盐酸吡哆素0. 1重 量份、烟酸O. l重量份、肌醇20重量份，加水1000体积份，并加热至完全 溶解，加水至1000体积份，混合均匀，得MS培养基母液D， 4T:保存备用；
7取蔗糖120重量份，加水2000体积份溶解，加热至沸腾；加入MS培养 基母液A50体积份、MS培养基母液BIO体积份、MS培养基母液C20体积份、 MS培养基母液D10体积份，得混合培养基母液；取琼脂24重量份，加水2000 体积份搅拌后，加入上述混合培养基母液中，加热至沸腾，琼脂全部溶化； 加水至4000体积份；滴加4%氢氧化钠，调pH至5. 8，得侧芽诱导1/2MS培 养基；分装；灭菌；备用；
选取健壮铁皮石斛野生苗，选取其茎段为外植体，先用流水冲洗干净， 放入灭菌的广口瓶内再用75%酒精消毒20-30秒，用无菌水冲洗2次，将冲 洗后的茎尖用O. 1%的升汞浸泡8-ll分钟，然后用无菌水冲洗4-5次，接种 于下列无菌培养及内，诱导无菌侧芽，在温度25±2度，光照强度 1600-2000LUX、光照时间10小时培养30天；
II、 诱导原球茎
按I步骤中的方法配制MS培养基母液A5000体积份、MS培养基母液 B2000体积份、MS培养基母液C2000体积份、MS培养基母液D1000体积份， 4。C保存备用；取O. 15 0.25重量份NAA，滴加4%氢氧化钠至完全溶解，加 水至1000体积份，摇匀，得NAA母液，4。C保存备用；取0.05 0. 15重量 份6-BA，滴加4%氢氧化钠至完全溶解，加水至500体积份，摇匀，得6-BA 母液，4XM呆存备用；取蔗糖120重量份，加水2000体积份溶解，加热至沸 腾；加入上述MS培养基母液A200体积份、MS培养基母液B20体积份、MS 培养基母液C40体积份、MS培养基母液D20体积份、NAA母液20体积份、 6-BA母液40体积份，得混合培养基母液；取琼脂24重量份，加水2000体 积份，搅拌，加入上述混合培养基母液中，加热至沸腾，琼脂全部溶化；加 水至4000体积份；滴加4°/。氢氧化钠，调pH至5.8，得诱导原球茎MS培养
基；分装；灭菌；备用；
III、 铁皮石斛原球茎筛选
按I步骤中的方法配制MS母液A5000体积份、MS母液B2000体积份、 MS母液C2000体积份、MS母液D1000体积份，4。C保存备用；称取蔗糖1200 重量份，加水20000体积份溶解，加热至沸腾；加入培养基母液A1000体积 份、培养基母液B200体积份、培养基母液C400体积份、培养基母液D200
8体积份、香蕉泥400重量份，得混合培养基母液；取琼脂240重量份，加水 20000体积份搅拌，加入上述混合培养基母液中，加热至沸腾，琼脂全部溶 化；加水至40000体积份；滴加4%氢氧化钠，调pH至5. 8，得继代培养MS 培养基；分装；灭菌；备用；
IV、 石斛间歇式液态培养基
按I步骤中的方法配制MS母液A5000体积份、MS母液B2000体积份、 MS母液C2000体积份、MS母液D1000体积份，4。C保存备用；称取蔗糖1200 重量份，加水20000体积份溶解，加热至沸腾；加入培养基母液A1000体积 份、培养基母液B200体积份、培养基母液C400体积份、培养基母液D200 体积份、香蕉提取液400重量份，得混合培养基母液；取琼脂240重量份， 加水20000体积份搅拌，加入上述混合培养基母液中，加热至沸腾，琼脂全 部溶化；加水至40000体积份；滴加4%氢氧化钠，调pH至5. 8，得液态1/2MS 培养基；分装；灭菌；备用；
V、 石斛原球茎继代
按I步骤中的方法配制MS母液A5000体积份、MS母液B2000体积份、MS母 液C2000体积份、MS母液D1000体积份，4"C保存备用；称取蔗糖1200重量 份，加水20000体积份溶解，加热至沸腾；加入培养基母液A1000体积份、 培养基母液B200体积份、培养基母液C400体积份、培养基母液D200体积 份、香蕉泥400重量份，得混合培养基母液；取琼脂240重量份，加水20000 体积份搅拌，加入上述混合培养基母液中，加热至沸腾，琼脂全部溶化；加 水至40000体积份；滴加4%氢氧化钠，调pH至5. 8，得继代培养MS培养基；
分装；灭菌；备用；
实施例:本发明铁皮石斛原球茎的培养 I 、植株诱导 培养基母液的配制
分别称取硝酸钾190克、硝酸铵165克、硫酸镁37克、磷酸二氢钾17 克、氯化钙44克，分别置于1000ml烧杯中，加水约1000ml，并加热至完全溶解；将5种溶液混合，置5000ml的烧杯中，加水定容至5000ml，混合均 匀，得MS培养基母液A，置试剂瓶中4。C保存备用；
分别称取硫酸锰6. 76克、硫酸锌3. 44克、硼酸2. 48克、碘化钾0. 332 克、钼酸钠O. l克、硫酸铜0.05毫克、氯化钴0.05毫克，分别置于500ml 烧杯中，加水约200ml，并加热到完全溶解；将7种溶液混合，置2000ml 的烧杯中，加水定容至2000ml，混合均匀，得MS培养基母液B，置试剂瓶 中4"C保存备用；
分别称取EDTA-2Na7.45克、硫酸亚铁5. 57克，分别置于1000ml烧杯 中，加水约1000ml，并加热至完全溶解后；将2种溶液混匀，加热约10分 钟，用水定容至2000ml，得MS培养基母液C，置试剂瓶中4。C保存备用；
称取甘氨酸0. 4克、盐酸硫胺素0. 08克、盐酸吡哆素0. 1克、烟酸0. 1 克、肌醇20克，置于1000ml烧杯中，加水约1000ml，并加热至完全溶解， 加水定容至1000ml，混合均匀，得MS培养基母液D，置试剂瓶中4t:保存备 用；
激素的配制
NAA的配制用天平精密称取0.2克NAA，置50ml小烧杯中，滴加4% 氢氧化钠至完全溶解，移入1000ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，置试剂 瓶中4'C保存备用；
6-BA的配制用天平精密称取O. 1克6-BA，置50ml小烧杯中，滴加4% 氢氧化钠至完全溶解，移入500ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，置试剂瓶
中4i:保存备用；
培养基的配制
将洗净控干的培养瓶160瓶摆放于工作台上;用电子秤称取蔗糖120克， 放入不锈钢桶中，加纯水2升溶解，加热至沸腾；用量筒取母液A100毫升、 B20毫升、C40毫升、D20毫升、NAA20毫升、6-BA4毫升加入不锈钢桶中， 得混合培养基母液；称量琼脂24克放入2000ml烧杯中，加水2000ml搅拌， 加入不锈钢桶内，加热至沸腾，琼脂全部溶化；加纯水定容至4升；滴加4% 氢氧化钠，调pH至5.8;
分装将配制好的培养基在凝固前按25毫升/瓶分装于培养瓶中，分装成160瓶，封口用封口膜，外罩报纸封好，用线绳捆紧，放于手推车上； 灭菌
将分装好的培养基码放于灭菌锅内，12rC灭菌20分钟，灭菌结束后，
将培养瓶平放于手推车上，标明批号，推入无菌室或指定位置自然冷却，备 用。
A、 选取健壮铁皮石斛野生苗，选取其茎端为外植体，先用流水冲洗干 净，放入灭菌的广口瓶内再用75%酒精消毒20-30秒，用无菌水冲洗2次， 将冲洗后的茎尖用0. 1%的升汞浸泡8-11分钟，然后用无菌水冲洗4-5次， 接种于下列无菌培养及内，诱导无菌侧芽，在温度25±2度，光照强度 1600-2000LUX、光照时间10小时培养30天；
B、 选择生长良好，色泽深绿、大小适中的的侧芽茎段为材料，在超净 工作台上接种于原球茎诱导培养基内，在温度25士2度，暗培养14天转光 照强度1600-2000LUX、光照时间10小时培养40天，即可得原球茎。
C、 原球茎增殖筛选驯化将诱导的原球茎，在25±2度，光照强度 1600-2000LUX、光照时间10小时，培养基 继代培养，45天/代，经过 20代继代筛选，获得可用于无激素培养的铁皮石斛原球茎；
D、 原球茎继代
将筛选的原球茎在间歇式液态培养基上，接种浓度10%， 25±2度，光 照强度1600-2000LUX、光照时间10小时间歇式培养18-22天，转移到固态 培养基lg/瓶，25±2度，光照强度1600-2000LUX、光照时间10小时培养 45天。
ii
权利要求
1、一种铁皮石斛原球茎，其特征在于该培养物是经如下步骤得到的I、植株诱导A、选取健壮铁皮石斛野生苗，选取其茎端为外植体，先用流水冲洗干净，放入灭菌的广口瓶内再用75％酒精消毒20-30秒，用无菌水冲洗2次，将冲洗后的茎尖用0.1％的升汞浸泡8-11分钟，然后用无菌水冲洗4-5次，接种于下列无菌培养及内，诱导无菌侧芽，在温度25±2度，光照强度1600-2000LUX、光照时间10小时培养30天；B、选择生长良好，色泽深绿、大小适中的的侧芽茎段为材料，在超净工作台上接种于原球茎诱导培养基内，在温度25±2度，暗培养14天转光照强度1600-2000LUX、光照时间10小时培养40天，即可得原球茎。C、原球茎增殖筛选驯化将诱导的原球茎，在25±2度，光照强度1600-2000LUX、光照时间10小时，继代培养，45天/代，经过10代继代筛选，获得可用于无激素培养的铁皮石斛原球茎；D、原球茎继代将筛选的原球茎在间歇式液态培养基上，接种浓度8-10％，25±2度，光照强度1600-2000LUX、光照时间10小时间歇式培养18-22天，转移到固态培养基1-1.5g/瓶，25±2度，光照强度1600-2000LUX、光照时间10小时培养45天
2、 根据权利要求1所述的铁皮石斛无激素培养方法，所述培养基分别称取硝酸钾190重量份、硝酸铵165重量份、硫酸镁37重量份、磷酸二氢钾17重量份、氯化钙44重量份，分别加水1000体积份，并加热至完全溶解；将5种溶液混合，加水至5000体积份，混合均匀，得MS培养基母液A， 4T:保存备用；分别称取硫酸锰6. 76重量份、硫酸锌3. 44重量份、硼酸2. 48重量份、碘化钾0. 332重量份、钼酸钠0. 1重量份、硫酸铜0. 00005重量份、氯化钴0. 00005重量份，分别加水200体积份，并加热到完全溶解；将7种溶液混合，加水至2000体积份，混合均匀，得MS培养基母液B， 4"C保存备用；分别称取EDTA-2Na7. 45重量份、硫酸亚铁5. 57重量份，分别加水1000体积份，并加热至完全溶解；将2种溶液混匀，加热，加水至2000体积份，得MS培养基母液C， 4X:保存备用；称取甘氨酸0. 4重量份、盐酸硫胺素0. 08重量份、盐酸吡哆素0. 1重量份、烟酸0. 1重量份、肌醇20重量份，加水1000体积份，并加热至完全溶解，加水至1000体积份，混合均匀，得MS培养基母液D， 4"C保存备用；取蔗糖120重量份，加水2000体积份溶解，加热至沸腾；加入MS培养基母液A50体积份、MS培养基母液B10体积份、MS培养基母液C20体积份、MS培养基母液D10体积份，得混合培养基母液；取琼脂24重量份，加水2000体积份搅拌后，加入上述混合培养基母液中，加热至沸腾，琼脂全部溶化；加水至4000体积份；滴加4%氢氧化钠，调pH至5.8，得侧芽诱导1/2MS培养基；分装；灭菌；备用；选取健壮铁皮石斛野生苗，选取其茎段为外植体，先用流水冲洗干净，放入灭菌的广口瓶内再用75%酒精消毒20-30秒，用无菌水冲洗2次，将冲洗后的茎尖用O. 1%的升汞浸泡8-ll分钟，然后用无菌水冲洗4-5次，接种于下列无菌培养及内，诱导无菌侧芽，在温度25土2度，光照强度1600-2000LUX、光照时间IO小时培养30天；II、诱导原球茎按I步骤中的方法配制MS培养基母液A5000体积份、MS培养基母液B2000体积份、MS培养基母液C2000体积份、MS培养基母液D1000体积份，4'C保存备用；取0. 15 0. 25重量份NAA，滴加4%氢氧化钠至完全溶解，加水至1000体积份，摇匀，得NAA母液，4。C保存备用；取0. 05 0. 15重量份6-BA，滴加4。/。氢氧化钠至完全溶解，加水至500体积份，摇匀，得6-BA母液，4"C保存备用；取蔗糖120重量份，加水2000体积份溶解，加热至沸腾；加入上述MS培养基母液A200体积份、MS培养基母液B20体积份、MS培养基母液C40体积份、MS培养基母液D20体积份、NAA母液20体积份、6-BA母液40体积份，得混合培养基母液；取琼脂24重量份，加水2000体积份，搅拌，加入上述混合培养基母液中，加热至沸腾，琼脂全部溶化；加水至4000体积份；滴加4%氢氧化钠，调pH至5.8，得诱导原球茎MS培养基；分装；灭菌；备用；III、铁皮石斛原球茎筛选按I步骤中的方法配制MS母液A5000体积份、MS母液B2000体积份、MS母液C2000体积份、MS母液D1000体积份，4'C保存备用；称取蔗糖1200重量份，加水20000体积份溶解，加热至沸腾；加入培养基母液A1000体积份、培养基母液B200体积份、培养基母液C400体积份、培养基母液D200体积份、香蕉泥400重量份，得混合培养基母液；取琼脂240重量份，加水20000体积份搅拌，加入上述混合培养基母液中，加热至沸腾，琼脂全部溶化；加水至40000体积份；滴加4%氢氧化钠，调pH至5.8，得继代培养MS培养基；分装；灭菌；备用；iv、石斛间歇式液态培养基按I步骤中的方法配制MS母液A5000体积份、MS母液B2000体积份、MS母液C2000体积份、MS母液D1000体积份，4'C保存备用；称取蔗糖1200重量份，加水20000体积份溶解，加热至沸腾；加入培养基母液A1000体积份、培养基母液B200体积份、培养基母液C400体积份、培养基母液D200体积份、香蕉提取液400重量份，得混合培养基母液；取琼脂240重量份，加水20000体积份搅拌，加入上述混合培养基母液中，加热至沸腾，琼脂全部溶化；加水至40000体积份；滴加4%氢氧化钠，调pH至5. 8，得液态1/2MS培养基；分装；灭菌；备用；V、石斛原球茎继代按I步骤中的方法配制MS母液A5000体积份、MS母液B2000体积份、MS母液C2000体积份、MS母液D1000体积份，4'C保存备用；称取蔗糖1200重量份，加水20000体积份溶解，加热至沸腾；加入培养基母液A1000体积份、培养基母液B200体积份、培养基母液C400体积份、培养基母液D200体积份、香蕉泥400重量份，得混合培养基母液；取琼脂240重量份，加水20000体积 份搅拌，加入上述混合培养基母液中，加热至沸腾，琼脂全部溶化；加水至40000 体积份；滴加4%氢氧化钠，调pH至5.8，得继代培养MS培养基；分装；灭菌； 备用；VI、 如权利要求l所述的铁皮石斛原球茎，其特征在于所收集的铁皮石斛 原球茎应符合如下质量标准水分不得过12.0。％，总灰分不得过12.0%,酸 不溶性灰分不得过3.0%，浸出物不得少于15%;多糖含量得少于10%VII、 如权利要求IV或V所述的铁皮石斛原球茎的培养的方法，其特征在于 所述m步骤培养基MS培养基添加香蕉泥，原球茎的培养温度为25°C，培养周 期为45天。
全文摘要
本发明属于生物技术领域。具体涉及一种无激素大规模培养铁皮石斛原球茎的新方法。本发明以优质铁皮石斛为原材料，获得铁皮石斛原球茎进行无菌培养，适合建立大规模无激素培养铁皮石斛原球茎代替种植系统，培养无有效成分接近野生铁皮石斛，并具有野生铁皮石斛的各项功效。
文档编号C12N5/04GK101475928SQ200910010108
公开日2009年7月8日 申请日期2009年1月14日 优先权日2009年1月14日
发明者刘汉石 申请人:大连普瑞康生物技术有限公司;张显林;李雯雯