高产纤维素酶的酵母菌株及其筛选方法

专利名称：高产纤维素酶的酵母菌株及其筛选方法
技术领域：
本发明涉及微生物领域，特别涉及高产纤维素酶的酵母菌株及其筛选方法。
背景技术：
纤维素是植物细胞壁的主要成分，约占植物干重的1/3 1/2，是地球上分布最广、含量最丰富、生成量最高的有机化合物，是自然界中数量最大的可再生资源，纤维素的利用与转化对于解决目前世界能源危机、粮食短缺和环境污染等问题具有十分重要的意义。纤维素降解主要有酸降解和酶降解，酸降解需要一定的压力和温度，对设备的要求较高，生产过程会产生大量的废弃物，难于达到环保的要求。酶降解反应条件温和，是纤 维素利用与转化的发展目标。纤维素酶的来源广泛，广泛存在于自然界的生物体中，细菌、真菌、动物体内等都能产生纤维素酶。研究表明，细菌产生的纤维素酶的量较低，主要是葡聚糖内切酶，少数细菌能分泌外切葡聚糖酶，而且这些酶主要是胞内酶或是附于细胞壁上，很少能分泌到细胞外，增加了提纯的难度，在工业上很少采用。放线菌中的分枝杆菌和原放线菌几乎不产纤维素酶或产量极低，产量稍高的主要是黑红旋丝放线菌、玫瑰色放线菌和纤维放线菌，但在工业上仍难以应用。用于生产的纤维素酶一般来自于霉菌，比较典型的有木霉属、曲霉属和青霉属。绿色木霉及其近缘菌株等较为典型，是目前公认的较好的纤维素酶生产菌。木霉菌株具有产酶量大和酶系比较齐全等优点，但它们却不能利用木质素，其纤维素酶比活力及￠-葡萄糖苷酶活力不太高，并且生产较缓慢。鉴于酵母生长快、易于培养等优势，近年来不断有研究采用生物技术通过重组基因工程菌的方法获得了一些产纤维素酶的酵母菌株。酵母菌菌株生产纤维素酶的重要研究意义在于，利用产纤维素酶的酵母菌转化纤维素类物质生产单细胞蛋白比其他有用产物要比细菌和丝状真菌更有优势，特别是酵母菌可以直接利用纤维素生产酒精，这一潜在用途使其极具研究价值。如文献报道了从康氏木霉TK-4-775菌株中克隆到cbhl基因，并在毕赤酵母中成功实现cbhl的分泌型活性表达，但酶活为仅为24. 1U/L (康氏木霉纤维素酶CBHI基因克隆及在毕赤酵母中的表达研究.酿酒科技.2011年第I期)。虽然这种利用重组基因工程菌的方法获得产纤维素酶的酵母菌有较大的应用潜力，但菌株的遗传性能往往不太稳定，且其安全性如果应用于食品、动物饲料等领域则还需进一步进行评估才能用于生产。非人工转基因的酵母产纤维素酶在遗传性能和安全性上更有优势，但目前研究结果表明一般的酵母菌很少产纤维素酶或不产酶，国外有报道筛选出了关来自于热带植物叶面酵母菌菌株产生纤维素酶，但酶活较低。国内最近报道了从来自于海洋环境的酵母菌种库中筛选得到了能产纤维素酶的酵母菌(一株产纤维素酶海洋酵母菌的筛选、鉴定及发酵条件优化.中国海洋大学学报.2007年12月增刊II)，报道并对其产酶培养基做了优化，其最终纤维素酶产葡聚糖内切酶(CMCase)活达到4. 51U/mg,滤纸酶活达到4. 75U/mg，酶活较低。因此，提供一种高产纤维素酶的酵母菌株及其筛选方法具有现实意义。

发明内容
有鉴于此，本发明提供高产纤维素酶的酵母菌株及其筛选方法。该高产纤维素酶的酵母菌株的保藏编号为CGMCC No. 6057，该酵母菌株易培养，生产安全性高，遗传稳定性较好，其代谢产物纤维素酶容易分离纯化，且其代谢产物纤维素酶的酶活较高。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案本发明提供了一种高产纤维素酶的酵母菌株，其保藏编号为CGMCC No. 6057。本发明提供的高产纤维素酶的酵母菌株为东方伊萨酵母(Issatchenkiaorientalis)已于2012年04月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)进行保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 6057。海南岛盛产一种以椰子水作为生产培养基的发酵产品“椰纤果”(俗称“椰果”或“高纤椰果”)，这种发酵产物主要成分是细菌纤维素(Bacterial cellulose, BC)，纤维素通常占干重的95%以上。由于采用浅盘静置发酵，最终的发酵得到的细菌纤维素具有一定厚度，呈白色凝胶状。细菌纤维素的结构与植物纤维素的结构一致，同属于天然纤维素，其分子结构上与天然(植物)纤维素相同，均是D-葡萄糖之间以P -1，4糖苷键聚合而成，细菌纤维素与植物纤维素的主要区别在于无木质素、果胶和半纤维素等伴生产物，具有高结晶度(可达95%，植物纤维素的为65%)，以及高的聚合度(DP值2000 8000)。从分子结构和纤维素酶催化水解纤维素的机理来看，能够降解植物纤维素的纤维素酶也能够降解细菌纤维素，但目前这方面的研究较少报道。目前细菌纤维素主要的规模化生产方式是浅盘培养，这种发酵方式是在一个相对洁净的发酵房内摆放相当数量的浅盘，在浅盘中装入经灭菌的培养基，然后接入能产纤维素的木醋杆菌菌种，经静置发酵后，块状的纤维素凝胶就在浅盘中产生，这种发酵方式导致在发酵生产的过程中特别容易遭受污染，通常是微生物污染，导致细菌纤维素发酵失败。在研究细菌纤维素生产过程中的污染发现，有些浅盘由于在发酵过程中被污染，导致细菌纤维素凝胶膜不能形成，但有些浅盘中，发酵开始的2-3天内形成了一定厚度的纤维素凝胶膜，随着培养时间的延长，这层纤维素膜并没有像正常的浅盘内会越来越厚，最终会“消失”或“部分消失”，消失的部分似乎被“溶解”，不再呈现完整的纤维素膜。结果表明，被污染的细菌纤维素凝胶膜被降解了，或者说纤维素被降解成了小分子的物质。本发明发现，这是由于某些能够污染“细菌纤维素凝胶”的微生物产生了一些可以降解纤维素的物质，而且这种降解高效，推测有纤维素酶的参与。更深入的研究发现能够降解“椰果”的微生物有三类较为普通的两类为霉菌和细菌，这两类微生物能够产纤维酶已有较多的报道和研究，另外一类为酵母菌，鲜有报导。本发明发现，获得的酵母菌不仅能够产纤维素酶，而且纤维素酶的活性更高，能更有效率的降解细菌纤维素凝胶膜。通常如果在浅盘中培养的细菌纤维素凝胶上污染了霉菌或细菌，一般不会完全降解纤维素凝胶膜，仅有局部少量的纤维素凝胶被降解。而在细菌纤维素凝胶的浅盘生产中如果污染了本发明提供的能降解纤维素的酵母菌，大面积甚至是整片凝胶膜都完全被降解。因此，本发明提供了上述高产纤维素酶的酵母菌株，其保藏编号为CGMCC No. 6057。本发明还提供了一种保藏编号为CGMCC No. 6057的高产纤维素酶的酵母菌株的筛选方法，包括如下步骤步骤I :浅盘发酵生产纤维素凝胶，选取降解的纤维素凝胶，收集降解的纤维素凝胶中降解部分的培养液；步骤2 :取培养液于培养基中培养获得第二培养液，纯化、鉴定即得。作为优选,培养基的配制方法为I 5g白砂糖或果葡糖衆作为碳源,0. 05 0. Ig硫酸铵或尿素作为氮源，用100 150mL的椰子水进行溶解，调节pH值至4. 5 6. 5，杀菌。作为优选，椰子水中总固形物含量为3. 8% 4. 2%，还原糖含量为1%_1. 5%，钾含量为300 400mg/100mL，钙含量为20 30mg/100mL，维生素C含量为4 6mg/100mL。作为优选，杀菌具体为于100°C杀菌5 15min。作为优选，纯化具体为取所述第二培养液接种到固体培养基中经平板涂布法分离，挑取菌落，即得。作为优选，固体培养基的配制方法为取I 5g白砂糖或果葡糖浆作为碳源，
0.05 0. Ig硫酸铵或尿素作为氮源，琼脂I 2g，用100 150mL的椰子水进行溶解，调节pH值至4. 5 6,于121°C杀菌3 5min。作为优选，椰子水中总固形物含量为3. 8% 4. 2%，还原糖含量为1%_1. 5%，钾含量为300 400mg/100mL，钙含量为20 30mg/100mL，维生素C含量为4 6mg/100mL。作为优选，鉴定包括生理生化检验、16sRNA鉴定。作为优选，鉴定还包括挑取菌落接种于纤维素凝胶培养，检测纤维素凝胶是否降解。具体地，高产纤维素酶酵母的筛选采用下述方法进行采样在采用浅盘发酵生产细菌纤维素凝胶的椰果厂中取样，挑选那些被微生物污染而造成降解的纤维素凝胶膜，用灭过菌的滤纸条沾取污染区域的培养液，放入无菌的空试管中，塞上棉花塞备用。培养将采样的滤纸放入液体培养基中培养，培养温度为25 V 35°C，培养时间为2天飞天。上述液体培养基配方为1克飞克白砂糖或果葡糖浆作为碳源，0. 05克I克硫酸铵或尿素作为氮源，用100ml-150ml的新鲜椰子水进行溶解，调节pH值至4. 5-6. 5。培养基采用100°C杀菌5分钟 15分钟。分离由于采样中的微生物种类较多，将上述培养液中的微生物采用平板涂布法进行分离，对酵母菌落进行编号备用。平板涂布法采用的固体培养基为配方为1克飞克白砂糖或果葡糖浆作为碳源，0. 05克I克硫酸铵或尿素作为氮源，琼脂I克-2克，用 100ml-150ml的新鲜椰子水进行溶解，调节pH值至4. 5飞.5。培养基采用121°C杀菌3分钟 5分钟。筛选将步骤3中挑选出的酵母菌落进行筛选，挑选出能产纤维素酶的酵母菌。方法如下在若干个广口的玻璃瓶中培养细菌纤维素凝胶，培养至凝胶厚度0. 2cnT0. 5cm时，将步骤3中编号的酵母菌用接种环接入纤维素凝胶表面，培养I天天，培养温度25°C 35°C，观察细菌纤维素凝胶表面接入酵母的部位是否被降解，能降解的则为产纤维素酶的酵母。
再经生理生化试验鉴定为酵母菌。经16sRNA鉴定，本发明提供的高产纤维素酶的酵母菌住与标准株的同源性为99. 0%。保藏将筛选出的产纤维素酶的酵母菌用试管斜面法进行保藏，斜面培养基为麦芽汁培养基。本发明提供高产纤维素酶的酵母菌株及其筛选方法。该高产纤维素酶的酵母菌株的保藏编号为CGMCC No. 6057，该酵母菌株易培养，生产安全性高，遗传稳定性较好，其代谢产物纤维素酶容易分离纯化，且其代谢产物纤维素酶的酶活较高，具有较高的应用价值。本发明还提供了一种产纤维素酶的酵母菌株的筛选方法，通过从采用浅盘发酵生产方式的细菌纤维素凝胶中，对被微生物污染并发生降解的纤维素凝胶中进行采样，然后分离纯化出可以产纤维素酶的酵母菌株。生物保藏说明高产纤维素酶的酵母菌株，分类命名为东方伊萨酵母(Issatchenkiaorientalis),于2012年04月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码为100101，保藏编号为CGMCC No. 6057。


图I示葡萄糖标准曲线；其中横坐标为葡萄糖浓度，单位为mg/mL ;纵坐标为OD值；标准曲线方程为 y=0. 253x+0. 0989，R2=O. 9993 ；图2示本发明提供的高产纤维素酵母菌株CMCA酶活力测定结果；其中，横坐标为实验组，从左至右分别为实施例I至6提供的酵母菌株，纵坐标为酶活，单位为ymol/(mL min);从左至右酶活分别为 70. 9,80. 05,71. 40,70. 9,72. 21,74. 50 ；图3示本发明提供的高产纤维素酵母菌株FPA酶活力测定结果；其中，横坐标为实验组，从左至右分别为实施例I至6提供的酵母菌株，纵坐标为酶活，单位为U mol/(mL min);酶活分别为 37. 23,39. 75,45. 94,41. 63,46. 75,40. 98 ；图4示本发明提供的高产纤维素酵母菌株显微镜图。
具体实施例方式本发明公开了高产纤维素酶的酵母菌株及其筛选方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明提供的高产纤维素酶的酵母菌株及其筛选方法中所用原料及试剂均可由市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明实施例I采样在采用浅盘发酵生产细菌纤维素凝胶的椰果厂中取样，挑选那些被微生物污染而造成降解的纤维素凝胶膜，用灭过菌的滤纸条沾取污染区域的培养液，放入无菌的空试管中，塞上棉花塞备用。培养将采样的滤纸放入液体培养基中培养，培养温度为25 V，培养时间为5天。上述液体培养基配方为2克白砂糖作为碳源，0. 05克尿素作为氮源，用IOOml的新鲜椰子水进行溶解，调节pH值至5. 5。培养基采用100°C杀菌5分钟。分离将微生物采用平板涂布法进行分离，对酵母菌落进行编号备用。平板涂布法采用的固体培养基为配方为琼脂2克，其他成分同步骤2中的液体培养基。培养基采用121°C杀菌3分钟。筛选将挑选出的酵母菌落进行筛选，挑选出能产纤维素酶的酵母菌。方法如下在若干个广口的玻璃瓶中培养细菌纤维素凝胶，培养至凝胶厚度0. 2cm时，将编号的酵母菌用接种环接入纤维素凝胶表面，培养I天天，培养温度30°C，观察细菌纤维素凝胶表面接入酵母的部位是否被降解，能降解的则为产纤维素酶的酵母。再经生理生化试验鉴定为酵母菌。经16sRNA鉴定，本发明提供的高产纤维素酶的 酵母菌株与东方伊萨酵母标准株的同源性为99. 0%。保藏将筛选出的产纤维素酶的酵母菌用试管斜面法进行保藏备用。其中，椰子水中总固形物含量为3. 8% 4. 2%，还原糖含量为1%_1. 5%，钾含量为300 400mg/100mL，钙含量为 20 30mg/100mL，维生素 C 含量为 4 6mg/100mL。实施例2采样在采用浅盘发酵生产细菌纤维素凝胶的椰果厂中取样，挑选被微生物污染而造成降解的纤维素凝胶膜，用灭过菌的滤纸条沾取污染区域的培养液，放入无菌的空试管中，塞上棉花塞备用。培养将采样的滤纸放入液体培养基中培养，培养温度为35 V，培养时间为2天。上述液体培养基配方为5克果葡糖浆作为碳源，0. I克硫酸铵或尿素作为氮源，用150ml的新鲜椰子水进行溶解，调节PH值至5. O。培养基采用100°C杀菌10分钟。分离由于采样中的微生物种类较多，将上述培养液中的微生物采用平板涂布法进行分离，对酵母菌落进行编号备用。平板涂布法采用的固体培养基为配方为琼脂2克，其他成分同步骤2中的液体培养基。培养基采用121°C杀菌3分钟。培养基采用121°C杀菌5分钟。筛选将挑选出的酵母菌落进行筛选，挑选出能产纤维素酶的酵母菌。方法如下在若干个广口的玻璃瓶中培养细菌纤维素凝胶，培养至凝胶厚度0. 2cm时，将编号的酵母菌用接种环接入纤维素凝胶表面，培养I天，培养温度常温，观察细菌纤维素凝胶表面接入酵母的部位是否被降解，能降解的则为产纤维素酶的酵母。再经生理生化试验鉴定为酵母菌。经16sRNA鉴定，本发明提供的高产纤维素酶的酵母菌株与东方伊萨酵母标准株的同源性为99. 0%。保藏将筛选出的产纤维素酶的酵母菌用试管斜面法进行保藏，斜面培养基为麦芽汁培养基。其中，椰子水中总固形物含量为3. 8% 4. 2%，还原糖含量为1%_1. 5%，钾含量为300 400mg/100mL，钙含量为 20 30mg/100mL，维生素 C 含量为 4 6mg/100mL。实施例3采样在采用浅盘发酵生产细菌纤维素凝胶的椰果厂中取样，挑选那些被微生物污染而造成降解的纤维素凝胶膜，用灭过菌的滤纸条沾取污染区域的培养液，放入无菌的空试管中，塞上棉花塞备用。培养将采样的滤纸放入液体培养基中培养，培养温度为32°C，培养时间为3天。上述液体培养基配方为5克白砂糖作为碳源，0. I克硫酸铵作为氮源，用150ml的新鲜椰子水进行溶解，调节pH值至5. O。培养基采用100°C杀菌5分钟。分离由于采样中的微生物种类较多，将上述培养液中的微生物采用平板涂布法进行分离，对酵母菌落进行编号备用。平板涂布法采用的固体培养基为配方为琼脂1.5克，其他成分同步骤2中的液体培养基。培养基采用121°C杀菌3分钟。培养基采用121°C杀菌5分钟。筛选将中挑选出的酵母菌落进行筛选，挑选出能产纤维素酶的酵母菌。方法如下在若干个广口的玻璃瓶中培养细菌纤维素凝胶，培养至凝胶厚度0. 5cm时，将编号的酵母菌用接种环接入纤维素凝胶表面，培养2天，培养温度常温，观察细菌纤维素凝胶表面接入酵母的部位是否被降解，能降解的则为产纤维素酶的酵母。·再经生理生化试验鉴定为酵母菌。经16sRNA鉴定，本发明提供的高产纤维素酶的酵母菌株与东方伊萨酵母标准株的同源性为99. 0%。保藏将筛选出的产纤维素酶的酵母菌用试管斜面法进行保藏，斜面培养基为麦芽汁培养基。其中，椰子水中总固形物含量为3. 8% 4. 2%，还原糖含量为1%_1. 5%，钾含量为300 400mg/100mL，钙含量为 20 30mg/100mL，维生素 C 含量为 4 6mg/100mL。实施例4采样在采用浅盘发酵生产细菌纤维素凝胶的椰果厂中取样，挑选那些被微生物污染而造成降解的纤维素凝胶膜，用灭过菌的滤纸条沾取污染区域的培养液，放入无菌的空试管中，塞上棉花塞备用。培养将采样的滤纸放入液体培养基中培养，培养温度为25°C，培养时间为5天。上述液体培养基配方为1克白砂糖作为碳源，0. 08克尿素作为氮源，用IOOml的新鲜椰子水进行溶解，调节PH值至4. 5。培养基采用100°C杀菌15分钟。分离将微生物采用平板涂布法进行分离，对酵母菌落进行编号备用。平板涂布法采用的固体培养基为配方为琼脂I克，其他成分同步骤2中的液体培养基。培养基采用121°C杀菌3分钟。筛选将挑选出的酵母菌落进行筛选，挑选出能产纤维素酶的酵母菌。方法如下在若干个广口的玻璃瓶中培养细菌纤维素凝胶，培养至凝胶厚度0. 2cm时，将编号的酵母菌用接种环接入纤维素凝胶表面，培养I天天，培养温度25°C，观察细菌纤维素凝胶表面接入酵母的部位是否被降解，能降解的则为产纤维素酶的酵母。再经生理生化试验鉴定为酵母菌。经16sRNA鉴定，本发明提供的高产纤维素酶的酵母菌株与东方伊萨酵母标准株的同源性为99. 0%。保藏将筛选出的产纤维素酶的酵母菌用试管斜面法进行保藏备用。其中，椰子水中总固形物含量为3. 8% 4. 2%，还原糖含量为1%_1. 5%，钾含量为300 400mg/100mL，钙含量为 20 30mg/100mL，维生素 C 含量为 4 6mg/100mL。实施例5
采样在采用浅盘发酵生产细菌纤维素凝胶的椰果厂中取样，挑选那些被微生物污染而造成降解的纤维素凝胶膜，用灭过菌的滤纸条沾取污染区域的培养液，放入无菌的空试管中，塞上棉花塞备用。培养将采样的滤纸放入液体培养基中培养，培养温度为35°C，培养时间为5天。上述液体培养基配方为4克白砂糖作为碳源，0. 09克尿素作为氮源，用150ml的新鲜椰子水进行溶解，调节pH值至6. 5。培养基采用100°C杀菌15分钟。分离将微生物采用平板涂布法进行分离，对酵母菌落进行编号备用。平板涂布法采用的固体培养基为配方为琼脂I克，其他成分同步骤2中的液体培养基。培养基采用121°C杀菌3分钟。筛选将挑选出的酵母菌落进行筛选，挑选出能产纤维素酶的酵母菌。方法如下在若干个广口的玻璃瓶中培养细菌纤维素凝胶，培养至凝胶厚度0. 2cm时，将编号的酵母菌用接种环接入纤维素凝胶表面，培养I天天，培养温度35°C，观察细菌纤维素凝胶表面接入酵母的部位是否被降解，能降解的则为产纤维素酶的酵母。再经生理生化试验鉴定为酵母菌。经16sRNA鉴定，本发明提供的高产纤维素酶的酵母菌株与东方伊萨酵母标准株的同源性为99. 0%。保藏将筛选出的产纤维素酶的酵母菌用试管斜面法进行保藏备用。其中，椰子水中总固形物含量为3. 8% 4. 2%，还原糖含量为1%_1. 5%，钾含量为300 400mg/100mL，钙含量为 20 30mg/100mL，维生素 C 含量为 4 6mg/100mL。实施例6采样在采用浅盘发酵生产细菌纤维素凝胶的椰果厂中取样，挑选那些被微生物污染而造成降解的纤维素凝胶膜，用灭过菌的滤纸条沾取污染区域的培养液，放入无菌的空试管中，塞上棉花塞备用。一次平板划线分离融化培养基将麦芽糖琼脂培养基放入水浴中加热至融化。 倒平板待培养基冷却至50°C左右，按无菌操作法倒4只平板(每皿约15ml)，平置，待凝固。倒平板的方法右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰；然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住管(瓶)塞(也可将试管塞或瓶塞放在左手边缘或小指与无名指之间夹住。如果试管内或三角瓶内的培养基一次用完，管塞或瓶塞则不必夹在手中)。左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。作分区标记在皿底将整个平板划分成A、B、C、D四个面积不等的区域。各区之间的交角应为120°C左右(平板转动一定角度约60°C)，以便充分利用整个平板的面积，而且采用这种分区法可使D区与A区划出的线条相平行，并可避免此两区线条相接触。划线操作挑取样品选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法挑取少量菌种。划A区将平板倒置于煤气(酒精)灯旁，左手拿出皿底并尽量使平板垂直于桌面，有培养基一面向着煤气灯(这时皿盖朝上，仍留在煤气灯旁)，右手拿接种环先在A区划3— 4条连续的平行线(线条多少应依挑菌量的多少面定)。划完A区后应立即烧掉环上的残菌，以免因菌过多而影响后面各区的分离效果。在烧接种环时，左手持皿底并将其覆盖在皿盖上方(不要放入皿盖内)，以防止杂菌的污染。划其他区将烧去残菌后的接种环在平板培养基边缘冷却一下，并使B区转到上方，接种环通过A区(菌源区)将菌带到B区，随即划数条致密的平行线。再从B区作C区的划线。最后经C区作D区的划线，D区的线条应与A区平行，但划D区时切勿重新接触A、B区，以免极该两区中浓密的菌液带到D区，影响单菌落的形成。随即将皿底放入皿盖中。烧去接种环上的残菌。恒温培养将划线平板倒置，于37°C培养2-3天后观察。
二次平板划线分离待一次平板分离各菌株长成后，选取酵母菌株进行二次平板划线分离，操作同上。菌种涂布稀释分离纯化用灭菌好的固体培养基在电磁炉的铁锅中水浴加热至融化，冷却到大约50°C左右，于无菌操作室中进行操作。倒大概15-20毫升培养基于已灭菌好的平板内并摇匀，待平板冷却后，用接种环挑取二次平板划线分离所得酵母菌种放入灭菌好的第一根9ml放有无菌水的试管中摇匀，然后吸取Iml的菌液转移到第二根试管中，依次操作直至稀释五个数量级为止，每个数量级使用一支移液管，然后分别用无菌的移液管从相对应试管菌液中吸取0. 3ml滴到相应平板培养基上，再用灭菌的涂棒进行涂匀。盖上培养皿盖，倒置，放于37 °C生化培养箱中培养2-3天。将挑选出的酵母菌落进行筛选，挑选出能产纤维素酶的酵母菌。方法如下在若干个广口的玻璃瓶中培养细菌纤维素凝胶，培养至凝胶厚度0. 2cm时，将编号的酵母菌用接种环接入纤维素凝胶表面，培养I天天，培养温度35 °C，观察细菌纤维素凝胶表面接入酵母的部位是否被降解，能降解的则为产纤维素酶的酵母。再经生理生化试验鉴定为酵母菌。经16sRNA鉴定，本发明提供的高产纤维素酶的酵母菌株与东方伊萨酵母标准株的同源性为99. 0%。实施例7实验组取实施例I至6提供的酵母菌株，备用。对照组取纤维素酶(来源于绿色木霉)，进口分装，购自海南青鸟生物科技有限公司。斜面菌种的活化当平板上的酵母菌有菌落长出时，在无菌操作室中将菌株接种到麦芽汁斜面固体培养基上，于37°C恒温生化培养箱中培养2-3天，待有菌落长出时保存于4°C冰箱中备用。菌株培养菌种一代发酵培养将不同样液所得的酵母菌分别挑取两环，接种到装有50ml YH)液体培养基的250ml三角瓶中，在28°C，180r/min振荡摇床下，培养48h，作为种子液。菌种二代产酶培养将一代发酵培养所得的种子液接种到含50ml液体培养基的250ml三角瓶中再次进行摇瓶发酵，在28°C，160r/min振荡摇床下，培养24h，获得二代产酶培养液。离心分离
取IOmL菌种二代产酶培养液，用高速离心机以5000r/min离心20min，离心完成后收集上清液，在0 4°C下保存，所得上清液作为酶液进行酶活测定。还原糖测定方法取上清液，按照Miller的方法，使用DNS试剂，通过测定540nm波长下的光吸收值来确定还原糖的含量，并以葡萄糖为标准来表示。纤维素酶活力测定方法采用Mandels等的测定方法滤纸酶活(FilterPaper Activity,简称 FPA)
取25ml的刻度试管，加入经稀释的0. 5ml酶液和I. 5ml相应ph的缓冲液，并加入一条lcmX6cm的滤纸，50°C下保温lh。用DNS试剂测定所形成的还原糖量，并扣去空白。其酶活力单位用国际单位(I y mol/(min ml))来表示。羧甲基纤维素(还原糖法)酶活力(CMCA-DNS)测定方法取25ml的刻度试管，加入经适当稀释的酶液0. 5mL和ImL质量分数为1%的CMC-Na缓冲溶液，50°C保温30min。将酶液置于沸水浴中灭活5min作为对照组。用DNS试剂来测定所形成的还原糖量，并扣去空白。其酶活力单位用国际单位(I u mol/(min -mL))来表示。纤维素酶酶活力单位的定义在酶的催化下，每分钟形成Iumol葡萄糖时所用该酶的量为I个酶活国际单位(I U mol/(min mL))。葡萄糖标准曲线的制作用不同浓度的葡萄糖溶液作为标准溶液，与DNS共热反应显色后，测出其吸光度OD值，结果如图I所示。从图I可知，标准曲线y=0. 253x+0. 0989，线性相关系数R2为
0.9993，线性相当好，可以用于酶活力的测定。酶活力测定结果CMCA酶活力测定结果对筛选出13株酵母上述方法进行产酶培养后，离心分离后测定其上清夜CMCA酶活力，结果发现各株酵母培养液均有一定CMCA酶活。FPA酶活力的测定结果对筛选出13株酵母上述方法进行产酶培养后，离心分离后测定其上清液FPA酶活力，结果发现各株酵母培养液均有一定FPA酶活，如图3所示。本发明提供的酵母菌株实验组在产酶培养液中培养5天，测定的CMCA酶活达74. 6 u mol/ml. min)，FPA滤纸酶活达46. 7 u mol/ (ml. min)，离心后的清液干物重为4%,如按干重计算 CMCA 酶活达 1865 u mol/ (ml. min), FPA 滤纸酶活达 1167. 5 u mol/ (ml. min)。而对照组来自于木霉的酶制剂，CMCA酶活在1200-1800 u mol/(ml. min)，FPA滤纸酶活在300-600 u mol/ (ml. min)左右。相对于对照组的酶制剂来说，本发明提供的保藏编号为CGMCC No. 6057的酵母菌株具有显著的高产纤维素酶的特点，试验组中的酵母菌株经产酶培养后的培养液具有的酶活力都显著高于对照组的商品化酶制剂，可想而知，本发明提供的酵母菌株经产酶培养后的培养液经浓缩后(浓缩倍数与对照组商品化酶制剂浓缩倍数相同)制得酶制剂极显著高于对照组商品化的酶制剂的酶活。试验结果表明，本发明提供的酵母菌株经产酶培养后的培养液经浓缩后(浓缩倍数与对照组商品化酶制剂浓缩倍数相同)制得酶制剂极显著高于对照组商品化的酶制剂的酶活(P ( 0.01)。综合上述分析，本发明实施例I至6提供的酵母菌能大量地产生纤维素酶，而且具 有较高的酶活力。酵母菌安全性高，而且具有酶的外分泌性和产酶量高的特点，全面系统地收集分离产酶酵母，建立产酶酵母种质资源库，对研究酵母菌及其它微生物的产纤维素酶机理、酶的修饰、酶的结构与组成、产酶基因及克隆、直至生产应用等都有重要的意义。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种高产纤维素酶的酵母菌株，其特征在于，其保藏编号为CGMCC No. 6057。
2.一种保藏编号为CGMCC No. 6057的高产纤维素酶的酵母菌株的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤 步骤I :浅盘发酵生产纤维素凝胶，选取降解的纤维素凝胶，收集所述降解的纤维素凝胶中降解部分的培养液； 步骤2 :取所述培养液于培养基中培养获得第二培养液，纯化、鉴定即得。
3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述培养基的配制方法为I 5g白砂糖或果葡糖衆作为碳源，0. 05 0. Ig硫酸铵或尿素作为氮源,用100 150mL的椰子水进行溶解，调节pH值至4. 5 6. 5，杀菌。
4.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，所述椰子水中总固形物含量为3. 8% 4. 2%,还原糖含量为1%_1. 5%,钾含量为300 400mg/100mL，钙含量为20 30mg/IOOmL,维生素 C 含量为 4 6mg/100mL。
5.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，所述杀菌具体为于10(TC杀菌5 15min。
6.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述纯化具体为取所述第二培养液接种到固体培养基中经平板涂布法分离，挑取菌落，即得。
7.根据权利要求6所述的筛选方法，其特征在于，所述固体培养基的配制方法为取I 5g白砂糖或果葡糖衆作为碳源，0. 05 0. Ig硫酸铵或尿素作为氮源,琼脂I 2g,用100 150mL的椰子水进行溶解，调节pH值至4. 5 6，于121°C杀菌3 5min。
8.根据权利要求7所述的筛选方法，其特征在于，所述椰子水中总固形物含量为3.8% 4. 2%,还原糖含量为1%_1. 5%,钾含量为300 400mg/100mL，钙含量为20 30mg/100mL,维生素 C 含量为 4 6mg/100mL。
9.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述鉴定包括生理生化检验、16sRNA鉴定。
10.根据权利要求9所述的筛选方法，其特征在于，所述鉴定还包括挑取所述菌落接种于纤维素凝胶培养，检测所述纤维素凝胶是否降解。
全文摘要
本发明涉及微生物领域，特别涉及高产纤维素酶的酵母菌株及其筛选方法。该高产纤维素酶的酵母菌株的保藏编号为CGMCC No.6057，该酵母菌株易培养，生产安全性高，遗传稳定性较好，其代谢产物纤维素酶容易分离纯化，且其代谢产物纤维素酶的酶活较高，具有较高的应用价值。本发明还提供了一种产纤维素酶的酵母菌株的筛选方法，通过从采用浅盘发酵生产方式的细菌纤维素凝胶中，对被微生物污染并发生降解的纤维素凝胶中进行采样，然后分离纯化出可以产纤维素酶的酵母菌株。
文档编号C12Q1/04GK102703337SQ20121018938
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月8日 优先权日2012年6月8日
发明者冯爱国, 向东, 李斌, 王志国, 王锡彬, 钟春燕 申请人:海南光宇生物科技有限公司, 海南大学