专利名称：蝙蝠sars样冠状病毒刺突蛋白免疫决定区及制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，更具体涉及ー种蝙蝠SARS样冠状病毒刺突蛋白(Rp3-S)免疫决定区，同时还涉及ー种蝙蝠SARS样冠状病毒刺突蛋白(Rp3-S)免疫决定区的制备方法，还涉及ー种蝙蝠SARS样冠状病毒刺突蛋白(Rp3-S)免疫决定区的用途。
背景技术：
SARS冠状病毒是2002-2003年在中国暴发的SARS的病原。而蝙蝠SARS样冠状病毒与SARS冠状病毒存在很高的同源性。自2005年被本课题组首次发现后，世界范围内均有关于类似病毒的报道，但关于蝙fe SARS样冠状病毒免疫原性的报道却不多。香港大学通 过信息学分析认为，该病毒有逃逸并传播于人类的危险。研究表明，蝙fe SARS样冠状病毒与SARS冠状病毒的主要差异在S蛋白，即主要负责和细胞受体结合、诱导机体产生中和抗体的蛋白。蝙蝠SARS样冠状病毒只要获得人SARS冠状病毒S蛋白上的一小段，便可以对小鼠致病。由此可见，此病毒有潜在致病性。因而，关于该病毒免疫原性的研究对于设计特异性疫苗或诊断方法就显得特别重要。申请人:前期的工作发现，蝙蝠SARS样冠状病毒感染的蝙蝠血清与人SARS冠状病毒S蛋白有交叉反应，但不能中和人SARS冠状病毒，说明蝙蝠SARS样冠状病毒和人SARS冠状病毒S蛋白之间存在着很大的差异。这可以归因于两个病毒S蛋白与受体结合的部分，即诱导机体产生中和抗体的区域存在着相对较低的同源(图I)。本研究组在前期的工作中利用假病毒入侵实验证实了蝙蝠SARS样冠状病毒S蛋白的免疫决定区位于其受体结合区对应的区域。该免疫决定区的具体位置的确定对于设计蝙蝠SARS样冠状病毒特异诊断、保护性疫苗、和抗病毒药物的研发极为重要。
发明内容
本发明的目的是在于提供了ー种蝙蝠SARS样冠状病毒(Rp3)刺突蛋白(Rp3_S)免疫决定区蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO. I所示。该决定区信息为首次鉴定，可用于蝙蝠SARS样冠状病毒的特异性的诊断。本发明的另ー个目的是在于提供了ー种蝙蝠SARS样冠状病毒刺突蛋白(Rp3_S)免疫决定区蛋白的制备方法。该方法简单易行，操作方便，易于生产。本发明的再ー个目的是在于提供了ー种蝙蝠SARS样冠状病毒刺突蛋白(Rp3_S)中的S280-455多肽片段在鉴定小鼠抗S单克隆抗体表位中的应用。该方法特异性好，操作简单，实验易于重复。为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施ー种蝙蝠SARS样冠状病毒刺突蛋白(S)免疫决定区蛋白及其制备方法，它包括以下步骤根据本研究组前期的工作，申请人比较了蝙蝠SARS样冠状病毒和SARS-CoV S蛋白免疫原性的差别，认识到它们免疫显性区的差异可能在于其受体结合区。然而，申请人依然不清楚其免疫显性区的具体氨基酸位置。为此，申请人将S基因(GenBank序列号:DQ071615,在基因组核苷酸序列的位置21486-25211bp)序列截成6段(图2)，分别进行原核蛋白表达，而后应用了鼠源的全长S单抗克隆抗体、多克隆抗体鉴定S免疫决定区的具体位置。A. Rp3-s六个截断的片段的PCR扩增Rp3_S蛋白的SI区及其截断的五个区域分别为l_666aa，表达的蛋白命名为 S1-666，核苷酸序列为SEQ ID NO. 2所示；l_81aa，表达的蛋白命名为S1-82核苷酸序列为SEQID NO. 3所示；82-280aa，表达蛋白质命名为S82-280，核苷酸序列为SEQ ID NO. 4所示；280-455aa，表达的蛋白质命名为S280-455，核苷酸序列为SEQ ID NO. 5所示；429_574aa，表达的蛋白质命名为S429-574，核苷酸序列为SEQ ID NO. 6所示；561_666aa，蛋白质命名为S561-666，核苷酸序列为SEQ ID NO. 7所示。根据六个片段的核苷酸序列，设计的6对引物如下1-666 :正向5 ’ -GGCCGAATTCATGAAAATTTTAAT-3 ’，反向5，-CAGTGTCGACTTAAGACATAGTGTAAGCCAC-3，，l-81aa :正向5，-GGCCGGATCCATGAAAATTTTAAT-3，，反向5，-ACTTGTCGACGTAGGTAAACCTAT-3，；82-280aa :正向5，-GGCCGGATCCTTTGACAATCCTAT-3，，反向5’-CTCAGTCGACAATAGCATTGGTAA-3’ ；280-455aa :正向5’ -TGCCGGATCCATTGATTGTGCTCA-3 ’，即为 SEQ ID NO. 8，反向5’-CAGTGTCGACTTAAGAAAGGTCTCTCTCAAA-3’，即为 SEQ IDN0. 9 ；429-574aa :正向5，-GGACGGATCCACTGCAAAGCAGGATCAA-3，，反向5’-GAACGTCGACTGTTCCTGGTGTAATTAC-3’ ；561-666aa :正向5，-GGCTGGATCCCCATGCTCTTTTGG-3，；反向5，-CAGTGTCGACTTAAGACATAGTGTAAGCCAC-3，。PCR反应的试剂如下将5μ I的IOxTaq聚合酶缓冲液、4μ I的dNTP混合物、
O.25 μ I 的 TaqDNA 聚合酶、I μ I 含 Rp3_S 基因的质粒 pCDNA3.ト Rp-S (Ren, ff.，Qu, X.，Li, ff. , Han, Z. , Yu, Μ. , Zhang, S. , Wang, L. F. , Deng, H. , Shi, Z. Difference in receptorusage between SARScoronavirus and SARS-Iike coronavirus of bat origin.JVirol, 2008, 82(4) :1899 - 1907)，引物对各用I μ I和37. 75 μ I的无菌水混合。PCR反应条件94°C预变性300秒、94°C变性30秒、56°C复性30秒、72°C延伸60秒，循环30次后72°C最后延伸600秒。B.载体构建通过上述扩增后得到的Rp3_Sl通过BamHI和XhoI酶切后连接于表达载体pMAL-C2X(购自New England Biolabs)，五个截断片段通过BamHI和XhoI酶切后分别连接于表达载体pET32a上(购自Novagen)。所有的构建质粒都通过测序确定无误。C.蛋白的表达和纯化将重组质粒纯化后，转化BL21 (购自Promega)感受态细胞，再培养于含氨苄青霉素(Amp)抗性平板上。次日挑取单克隆进行培养，然后在终浓度为0. 3mMIPTG的培养基中30°C诱导6小吋。收集菌体超声波破碎后进行纯化。以pMALc2x载体表达的SI蛋白需要用MBP树脂柱进行纯化，用pET32a表达载体上带有His Tag标签，表达的蛋白均用His Tag纯化试剂盒进行纯化。所有纯化步骤均按照Promega公司的His_band试剂盒说明进行。纯化后在SDS-PAGE中检测蛋白的纯度(图3)，即得到目的蛋白。所有的蛋白纯度都达到了90%以上。D.蝙蝠SARS样冠状病毒S DNA免疫的小鼠血清的制备pCDNA3. l_Rp3_S被以体内电击的方式注射6_8周龄雌性BALB/c小鼠，分别在0、3和5周时免疫小鼠，在第八周的时候提取小鼠血清，这些血清即为含蝙蝠SARS样冠状病毒S蛋白多克隆抗体的抗血清。同时采健康小鼠的血清一份作为阴性对照，共五份血清样本，阳性血清样本依次命名为Rp-SfRp-S4。E. ー种蝙蝠SARS样冠状病毒刺突蛋白(Rp3_S)免疫决定区蛋白的确立，其步骤 为首先用5个纯化的截断SI蛋白作为包被抗原，小鼠抗S蛋白血清作为ー抗，HRP标记的羊抗鼠ニ抗进行ELISA反应。结果显示5只小鼠血清与5个蛋白反应各异(图4)。结果显示，大多数免疫小鼠血清都可以与S280-455和S561-666反应Rp-Sl Rp-S4四份免疫小鼠血清都可与S280-455反应，Rp-Sl, Rp_S3和Rp_S4与S561-666反应，只有Rp_S2 —份血清与S429-574反应，没有血清可以跟S1-82及S82-455反应。鉴于S561-666区段存在着冠状病毒中非常保守的免疫显性区，因而不能作为蝙蝠SARS样冠状病毒特异检测的表位，而S280-455存在着蝙蝠SARS样冠状病毒和人SARS冠状病毒S蛋白主要区别之一，因而申请人认为S280-455存在着可以被小鼠抗体识别且可被应用的主要免疫决定表位，其氨基酸序列为SEQ ID NO. I所示。该肽段具有最好的免疫原性，是S蛋白的主要免疫区，而该区域与人SARS冠状病毒S蛋白的主要免疫决定区并不完全重叠，此发现对于构建针对蝙蝠SARS样冠状病毒的特异检测方法，以及设计针对该病毒的疫苗都要重要的意义，在未来该类病毒特异鉴定工作中具有良好的前景。—种編幅SARS样诞状病韋刺突蛋白免疫决定区蛋白在鉴定小鼠抗S单克隆抗体表位中的应用，其步骤为A.小鼠抗蝙蝠SARS样冠状病毒S单克隆抗体的制备申请人将含蝙蝠SARS样冠状病毒Rp3株S蛋白的假病毒(HIV/Rp3-S)作为抗原在BALB/c小鼠中按照标准方法(Evan, G. let al，1985，Isolation of monoclonal antibodies specific for human c-mycproto-oncoge ne product. Mol Cell Biol 5:3610-6.)制备。将挑选阳性的克隆扩大培养并腹腔注射入同来源小鼠，并收集腹水。其效价随后通过ELISA进行鉴定。为了避免这些单克隆抗体与载体pET32a tag (购自Novagen)的交叉反应,在应用之前,所有的单抗均用含pET32a tag的细菌裂解物进行了中和。B.用S280-455鉴定小鼠抗S单克隆抗体的蛋白杂交反应。用S280-455蛋白作为抗原，小鼠抗S单克隆抗体作为检测抗体进行蛋白杂交反应。筛选到四个S蛋白单克隆抗体，命名SmAbl-SmAb4，均可以特异的识别S280-455而不是pET32a Tag或其它四个截断表达的S蛋白。这些数据印证了 S280-455是主要的免疫决定区(图5)。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果
首先，鉴定出的蝙蝠SARS样冠状病毒S蛋白主要免疫决定区S280-455，该肽段具有最好的免疫原性，是S蛋白的主要免疫区，而该区域与人SARS冠状病毒S蛋白的主要免疫决定区并不完全重叠，此发现对于构建针对蝙蝠SARS样冠状病毒的特异检测方法，以及设计针对该病毒的疫苗都要重要的意义，在未来该类病毒特异鉴定工作中具有良好的前
旦
牙ヽ；其次，提供的蝙蝠SARS样冠状病毒刺突蛋白(S)免疫决定区蛋白的制备方法，该方法简单易行，操作方便，易于生产；再次，提供的S280-455多肽片段在鉴定小鼠抗S单克隆抗体表位中的应用方法特异性好，操作简单，易于重复。
图I为ー种蝙蝠SARS样冠状病毒Rp3_S对应于SARS冠状病毒Tor2_S蛋白的受体结合区示意图。图中数字为氨基酸位点。下划线部分为两者差异最大的部分，也是Tor2-S蛋白与受体结合核心部分。图2为ー种全长的蝙蝠SARS样冠状病毒SI部分及五个截断的S片段示意图。图3为ー种Rp3_S蛋白的SI区及其五个截断的SARS样冠状病毒S蛋白纯化后的SDS-PAGE示意图。蛋白均带有20kD的标签。图4为蝙蝠SARS样冠状病毒SI上可被小鼠S抗体识别的免疫显性区示意图。截断表达的S蛋白作为包被抗原，它们与四份Rp3_S DNA免疫的小鼠血清(命名为Rp-Sl到Rp-S4)反应。ー份正常鼠血清用作阴性对照。数据表示为平均值土标准误差。图5为ー种鉴定Rp3 SI小鼠单抗的效价及其所识别的表位示意图。在蛋白杂交反应中，只有S280-455可以被单抗识别。单抗I :250稀释使用。图中的数字1，pET32a tag 蛋白；2，S280-455 蛋白。
具体实施例方式实施例I :设计扩增蝙蝠SARS样冠状病毒S基因截断片段，其步骤是基于本实验室前期工作得到的蝙蝠SARS样冠状病毒S基因的序列(GenBank序列号DQ071615，在基因组核苷酸序列的位置21486-25211)，分别设计引物进行PCR扩增获取Rp3-Sl及其五个截断S的目的基因。引物分别如下1-666 :正向5’ -GGCCGAATTCATGAAAATTTTAAT-3，，反向5，-CAGTGTCGACTTAAGACATAGTGTAAGCCAC-3，；l-81aa :正向5，-GGCCGGATCCATGAAAATTTTAAT-3，，反向5，-ACTTGTCGACGTAGGTAAACCTAT-3，；82-280aa :正向5，-GGCCGGATCCTTTGACAATCCTAT-3，；反向5，-CTCAGTCGACAATAGCATTGGTAA-3，；280-455aa :正向5，-TGCCGGATCCATTGATTGTGCTCA-3，，反向5’-CAGTGTCGACTTAAGAAAGGTCTCTCTCAAA-3’ ；429-574aa :正向5，-GGACGGATCCACTGCAAAGCAGGATCAA-3，，
反向5’-GAACGTCGACTGTTCCTGGTGTAATTAC-3’ ；561-666aa :正向5，-GGCTGGATCCCCATGCTCTTTTGG-3，，反向5，-CAGTGTCGACTTAAGACATAGTGTAAGCCAC-3，。每个基因各用上述的ー对引物进行PCR扩增。PCR反应的试剂如下将5μ I的IOxTaq聚合酶缓冲液、4 μ I的dNTP混合物、O. 25 μ I的TaqDNA聚合酶、I μ含有pcDNA3. 1-Rp3-S质粒，引物对各用I μ 1，和37. 75 μ I的无菌水混合。PCR反应条件94°C预变性300秒、94°C变性30秒、56°C复性30秒、72°C延伸60秒，循环30次后72°C最后延伸600 秒。实施例2 蝙蝠SARS样冠状病毒S截断蛋白重组表达载体的构建及其表达和纯化，其步骤 是用限制性内切酶BamHI和XhoI (Takara公司产品)对回收的PCR产物和表达载体pET32a质粒进行酶切。酶切反应出&111!11和乂1101各1レ1，10倍!1缓冲液2レ1，，PCR产物或pET32a质粒质粒50-100ng，加无菌水至总体积为20 μ I。37°C I小时，酶切产物经DNA回收后用T4DNA连接酶(Takara公司产品)将PCR产物与表达载体pET32a连接。连接反应T4DNA连接酶(lU/μ I) I μ l，PCR产物与表达载体pET32a的摩尔比为3 :1，并且DNA总量为O. I μ g，5倍连接酶反应缓冲液4 μ 1，加无菌水至总体积为20 μ 1，16°C放置24小吋。将2μ I连接反应液加到60μ I的DH5 α感受态细胞，混匀，电击转化，37°C摇床(220rpm)温育I小时；摇匀菌液，取100 μ I涂布于LB/ΑΡ+琼脂平板上，待菌液吸干后倒置于37°C培养12 16小时，观察結果。次日挑取单菌落10个，于4ml含氨苄的LB液体培养基中37°C培养过夜。待菌液培养结束，取菌液提取质粒并以BamHI和XhoI进行酶切鉴定。有插入片段的阳性克隆子送测序公司进行测序分析。挑选样阳性单克隆，接种新鲜Amp LB培养基。250rpm，37°C，震荡培养过夜。第三天，将过夜培养菌液，按1:100比例，接种新鲜LB培养基，同样加入Amp抗性。于37°C，250rpm震荡培养3_4小时，至菌液浓度达到0D260=0. 6 I. 0，此时细菌达到对数生长期。加入终浓度为O. 3mM的IPTG进行诱导表达。250rpm，30°C，继续震荡培养6小时，离心收获菌体。用PBS溶液洗涤两遍后，重悬于适量O. 01mol/L PBS中(浓缩比例为200ml原始菌液到20mlPBS中)。_80°C反复冻融三次后，进行超声波破碎和蛋白纯化。因为pET32a表达载体上带有His Tag标签,所以表达的蛋白可以用His Tag纯化试剂盒(Hisband,购自Novagen)进行纯化。纯化过程如下首先对诱导细胞进行超声波破碎，之后，16000rpm,4°C,离心15min,收取上清,用O. 45nm孔径滤器过滤。接下来用His Bind纯化试剂盒纯化,主要步骤包括首先，依次加入3倍的双蒸水，5倍的Charge Buffer,3倍的Bi nding Buffer对柱子进行平衡；将过滤后的上清通过柱子；依次加入10倍的Binding Buff er, 6倍的WashBuffer洗涤；最后用6倍的Elute Buffer进行蛋白洗脱。全部纯化完毕后，对His Bind纯化柱子进行再生。最终纯化出的蛋白均通过SDS-PAGE、蛋白浓度测定保证纯度达到95%以上和浓度大于IOOng/μ I (图3)。l_81aa经表达后得到的蛋白质命名为Sl_82 ;82_280aa经表达后得到的蛋白质为S82-280 ;280-455aa经表达后得到的蛋白质命名为S280-455 ;429_574aa经表达后得到的蛋白质命名为S429-574 ;561-666aa经表达后得到的蛋白质命名为S561-666。
实施例3 蝙蝠SARS样冠状病毒S截断片段与S DNA免疫的小鼠血清的ELISA反应。小鼠抗全长S的血清来自于DNA免疫的以下质粒构建于P⑶NA3. I (+)密码子优化过的 Rp3_S (Ren et al, 2008, Journal of Virology, Difference in Receptor Usagebetween Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS)Coronavirus and SARS-LikeCoronavirus of Bat Origin))以及 pO)NA3· I (+)空载体质粒(Introgen 公司)被用作阴性对照。将30 μ g质粒用30 μ I的PBS稀释后以体内电击的方式注射6-8周龄雌性BALB/c小鼠，实验共分为 2 组(详见 zhou et al, 2009, BBRC, Immunogenicity difference betweenthe SARS coronavir us and the batSARS-like coronavirus spike (S) proteins),母组有5只小鼠。分别在0、3和5周时免疫小鼠，在第八周的时候取小鼠 血清。5只被Rp3-S免疫的小鼠血清命名为Rp-SfRp-S4，Pre-bleed为免疫前小鼠血清对照组。制得抗体后，申请人进行酶联免疫反应测定表达片段与抗体的反应性。方法如下首先用纯化的蛋白包被96孔酶标板，每孔加入100 μ I底物包被酶标板，4°C过夜。次日，取出用PBS-T (含有体积比为0. I %的Tween-20的PBS)洗涤三次，每次5分钟。然后，加入3% (质量体积比)牛血清蛋白，200 μ I每孔，37°C，静置I小时，进行封闭。I个小时后，取出，PBS-T洗涤三次，每次5分钟。洗涤之后进行待测抗血清的检测。每孔加入待测血清，终体积为100μ I。同时，做正常血清和PBS溶液的阴性对照组。37°C，孵育I小时后，取出反应样品，PBS-T洗涤五次，每次3分钟。以I :4000比例稀释HRP标记羊抗鼠ニ抗(武汉三鹰公司)，每孔加入100 μ I。37°C，再次孵育I小时。取出，PBS-T再次洗涤五次后，依次加入底物A (体积比30%过氧化氢)、B (3，3，5，5，依四甲基联苯胺，TMB缓冲液)液各50 μ 1，37°C，避光显色5分钟。最后，每孔加入50 μ I 2M/L H2SO4-止反应。酶标仪读取0D450的值。OD值大于阴性对照孔的2. I倍确定为阳性反应。结果如图4所示大多数被免疫的小鼠血清都可以与S280-455和S561-666反应Rp_Sl Rp_S4四份小鼠血清都可与S280-455反应，Rp-Sl, Rp-S3和Rp-S4与S561-666反应，只有Rp_S2 —份血清与S429-574反应，没有血清可以跟S1-82及S82-280反应。鉴于S561-666区段存在着冠状病毒中非常保守的免疫显性区，因而不能作为蝙蝠SARS样冠状病毒特异检测的表位，而S280-455存在着蝙蝠SARS样冠状病毒和人SARS冠状病毒S蛋白主要区别之一，因而申请人认为S280-455存在着可以被小鼠抗体识别且可被应用的主要免疫决定表位，其氨基酸序列为SEQ ID NO. I所
/Jn ο实施例4 S280-455在鉴定S小鼠单克隆抗体识别表位中的应用，其应用过程为针对Rp3-S_的假病毒(HIV/Rp3_S)制备过程如下利用HIVNL4-3 ( Δ ENV) Iuc质粒(缺失囊膜基因ENV，带有ー个荧光素酶报告基因)，外来质粒表达的人SARS-CoVBJ01，SL-CoVRp3 S蛋白或ー个RBD区被替换为SSARS的嵌合体SSL，替代ENV蛋白的位置，构成HIV/BJ01-S、HIV/Rp3-S或HIV/CS310-518假病毒，假病毒的感染成功与否可用荧光素酶的活性表示。具体的包装步骤如下转染前一天将293T细胞按4xl06/皿密度接种于IOcm直径细胞培养皿中，转染前给293T细胞换新鲜培养基(或者换一半培养基)，转染时分2个I. 5ml离心管离心管A(CaCl2+DNA 混合物)500 μ I (用超纯水补齐)，包括HIV_luc 质粒 pNL-Luc-E-R- (RongLiu, Benjamin Chen and Nathaniel R. Landau. Use of Luciferase Reporter Viruses forStudying HIV Entry. HIV Protocols, Methods in Molecular Medicine, 1999, HIV Volume17，I, 35-40, DOI :10. 1385/0-89603-369-4:35) 12 μ g, Rp3_S 表达质粒 pCDNA3.トRp3_SDNA 12 μ g,向上述DNA溶液中加入62 μ 12Μ CaCl2,，轻轻吹吸混匀。取一个新的I. 5ml离心管(管 B)，加入 500 μ 12xHBS (280mMNaCl, I. 5mMNa2HP02 , 50mMHepes, pH 7. 10)，将 500 μ I管A溶液逐滴加入管B溶液中，边加入边用枪头或轻弹混匀，室温放置20-30min,将上述Iml混合液体逐滴均匀地加入293T细胞培养皿中，转染8至12h之后给细胞换新鲜培养基10ml，转染48h后，收集293T细胞的培养基上清，3000转低速离心5min去除细胞碎片，上清再用0. 45 μ m滤器过滤除去细小细胞碎片及可能的细菌，将过滤好的病毒上清分装冻存于_80°C或直接用于感染试验。针对S全长的鼠源单抗制作过程如下申请人首先将含Rp3_S的假病毒(HIV/ Rp3-S)注射BALB/c小鼠，然后将小鼠杀死后将其脾脏细胞取出并与Sp2/0骨髓瘤细胞融合而成)进行融合。杂交瘤细胞培养上清以ELISA进行Rp3-S抗体阳性筛选，包被抗原为假病毒HIV/Rp3-S和纯化的Rp3-Sl (实施例4)。将挑选阳性的克隆扩大培养并腹腔注射入同来源小鼠，并收集腹水。其效价随后通过ELISA进行鉴定。为了避免这些单克隆抗体与pET32a tag的交叉反应，在应用之前，所有的单抗均用含pET32a tag的细菌裂解物进行了中和。接下来应用蛋白杂交试验测试S蛋白片段中单克隆抗体的抗原表位，其步骤是用IX 样品处理液(50mM Tris-HCl (pH6. 8),2% (ff/V)SDS,0. 1% (W/V)溴酚蓝，10% (V/V)甘油，1% (W/V) β-巯基こ醇)纯化的S片段蛋白并在沸水浴中煮10分钟，然后以12%的SDS-PAGE进行分离。然后将蛋白胶或进行考马斯亮蓝染色或转到PVDF膜上。PVDF膜在含5% (质量体积比)脱脂奶粉的TBS(20mMTris base, 137mMNaCl, pH 7. 6)溶液中封闭过夜。用TBST (含体积比为0. 1% TWeen-20TBS溶液)洗涤3次，每次lOmin。然后以I :1000稀释的DNA免疫得到的S蛋白抗体、I :250稀释的S蛋白单抗37°C孵育一小吋，抗体孵育液为含1% (质量体积比)脱脂奶粉的TBST。弃去ー抗孵育液，用TBST洗涤3次，每次lOmin。加入AP标记1:2000稀释的羊抗鼠ニ抗37°C孵育一小时。弃去ニ抗孵育液，用TBST洗涤3次，每次lOmin。PVDF膜在IOmL碱性磷酸酶显色液(33 μ 15-溴-4-氯吲哚磷酸盐+66 μ I氯化硝基四氮唑蓝)避光显示，并及时終止反应。所有的四个单抗均可以特异的识别S280-455而不是pET32a Tag或其它四个截断表达的S。这些数据印证了该区域是重要的免疫显性区。
权利要求
1.一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列。
2.权利要求I所述蛋白的制备方法，其步骤是 A、PCR扩增以蝙蝠SARS样冠状病毒S基因为模板设计引物，扩增 正向引物5’ -TGCCGGATCCATTGATTGTGCTCA-3’，即为 SEQ ID NO. 8 ； 反向引物5’ -CAGTGTCGACTTAAGAAAGGTCTCTCTCAAA-3’，即为 SEQ ID NO. 9 ； PCR反应的试剂如下将5 μ I的IOxTaq聚合酶缓冲液、4 μ I的dNTP混合物、O. 25 μ I的TaqDNA聚合酶、I μ I含Rp3_S基因的质粒pCDNA3. l_Rp_S，引物对各用I μ I和37. 75 μ I的无菌水混合； PCR反应条件94°C预变性300秒、94°C变性30秒、56°C复性30秒、72°C延伸60秒，循环30次后72 °C最后延伸600秒； B、通过上述扩增后得到的片段用BamHI和XhoI酶切后连接于表达载体pET32a上，并测序确定无误； C、将重组质粒纯化后，转化BL21感受态细胞，在培养于含氨苄青霉素抗性平板上；次日挑取单克隆进行培养，然后在终浓度为O. 3mM IPTG的培养基中30°C诱导6小时；收集菌体超声波破碎后进行纯化，用His Tag纯化试剂盒进行纯化，纯化后在SDS-PAGE中检测蛋白的纯度，即得到目的蛋白。
3.权利要求I所述蛋白在鉴定小鼠抗S单克隆抗体表位中的应用。
全文摘要
本发明公开了蝙蝠SARS样冠状病毒刺突蛋白免疫决定区及制备方法和用途，其步骤是A、以蝙蝠SARS样冠状病毒S基因为模板设计引物，扩增；B、通过上述扩增后得到的片段用BamHI和XhoI酶切后连接于表达载体pET32a上，并测序确定无误；C、将重组质粒纯化后，转化BL21感受态细胞，挑取单克隆进行培养，在终浓度为0.3mMIPTG的培养基中30度诱导；收集菌体超声波破碎后进行纯化，用HisTag纯化试剂盒进行纯化，纯化后在SDS-PAGE中检测蛋白的纯度，得到目的蛋白。该方法简单易行，操作方便，易于生产；该肽段具有最好的免疫原性，在鉴定小鼠抗S单克隆抗体表位中的应用方法特异性好，操作简单，易于重复。
文档编号C12N15/50GK102690336SQ20121018971
公开日2012年9月26日 申请日期2012年6月11日 优先权日2012年6月11日
发明者周鹏, 石正丽, 韩正刚 申请人:中国科学院武汉病毒研究所