专利名称：大肠埃希氏菌及由其高效分泌表达人表皮生长因子的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，涉及利用基因工程的方法构建表达菌株，发酵生产人表皮生长因子(hEGF)，更具体地说是涉及一种大肠埃希氏菌及由其高效分泌表达人表皮生长因子的方法。
背景技术：
人表皮生长因子(Human epidermal growth factor,简称hEGF)又名尿抑胃素，hEGF见于人正常生理状态下的几乎所有体液中，如尿、乳液、血液、唾液、泪液、胃液、骨髓液等中都含有EGF，一般认为肾内尿液、乳液中含量较多(Orsinib B, et al. ClinBiochem, 1991，24:135-137)。Cohen S (Cohen S，et al. Proc. Natl. Acad. Sci, USA,1975, 72:1317-1321)和 Gregorg H (Gregorg H, et al. Nature, 1975, 257:325-327)于1975年都在尿液中分离得到hEGF，其一级结构也于同年阐明，hEGF成熟肽由53个氨基酸组成，分子量为6. 2 KD，等电点约为pH 4.6-4. 7，分子内有三对二硫键，以维持其蛋白构型和生物活性。hEGF是一种重要的生长因子，也是最早发现并用于临床的生长因子之一，临床试验表明hEGF可促使外胚层细 胞和毛细血管生长，促进烧伤、创伤及外科伤口的愈合，加速移植表皮和移植角膜的生长，因此对创伤性皮肤、角膜移植和外伤性皮肤溃疡等治疗有重要作用(Huang BR, Basic Clin Med, 1991, 11:87-91) 另外hEGF还广泛应用于高端化妆品(王丽明，山东科学，2006，4: 71-73)。现在报道的hEGF有三种生产的方法化学合成的方法，1988年March D (MarchD, et al. American Pepetide Symposium , 1988, 10:202-203)首先完成了 hEGF 的全合成，但由于hEGF分子内的二硫键及很多活性位点的存在，致使合成产物的纯度、产率及活性都无法满足工业化的生产要求；再有从生物来源中提取(美国专利19840619708)，主要从尿液中分离提取，但天然来源原料hEGF浓度很低，致使分离提纯效率低成本高，很难规模化生产；基因工程技术构建表达菌株，发酵生产hEGF是现在规模化生产的主要方法。已经报道很多发酵生产hEGF的技术和方法，包括使用大肠杆菌、芽孢杆菌(Wang GL, et al. Yi Chuan Xue Bao, 2003，30 (2) : 267-271 )、酵母(Clements JM, et al.Gene, 1991，106(2) : 267-271 )、藻类细胞(戴激，等，植物学报，2001，43 (12) : 1260-1261 )、动物细胞(Mroczkowshi B. Methods Enzymol, 1991, 198:175-177)植物组织细胞(W0patent:W09821348)等作为宿主发酵表达rhEGF。现在生产中主要还是利用原核细胞进行表达生产，大肠杆菌以其生长速度快，遗传背景清晰，易于改造，工艺简单，已经有大规模的发酵医用蛋白的经验，使之成为外源表达rhEGF的首选宿主菌。非组成型表达方式的大肠杆菌在生长表达过程中一般分两个阶段，菌体的生长阶段和诱导表达阶段，诱导阶段的诱导表达方式有多种，有些诱导启动子启动表达需要添加相应诱导剂如乳糖、IPTG、阿拉伯糖等，加入诱导剂后往往会造成菌体生理状态变化、裂解或者诱导过快造成表达量剧增对细胞产生毒害，而且有些诱导剂(如IPTG)本身具有毒性，在很多国家医药生产中禁止使用；有的诱导方式不需要添加诱导剂而使用营养限制型的启动子，如碱性磷酸酯酶启动子，色氨酸启动子等，但这类启动子都对培养基要求比较苛刻，而且诱导物质本身也是营养成分致使发酵不易控制，增加了发酵成本。大肠杆菌同样具有细胞内表达和分泌(分泌至周质)表达方式，分泌表达方式所表达的多肽结构均一'I"生强、活性高、利于纯化、且成本低，因此成为现在生产rhEGF的主要表达方式。但利用大肠杆菌分泌表达也有相对胞内表达的缺点，如表达量较低。Grossman TH 报道了(Grossman TH, et al. GENE, USA, 1998, 209:95-103)在复合培养基中用乳糖启动子控制的大肠杆菌PET表达系统可以在没有专门诱导剂诱导情况下表达，cAMP在启动表达中起到关键作用，而且以此种方式表达的宿主菌质粒保存率优于诱导表达的方式；魏东芝等人(Fu XY, et al. Chem Technol Biotechnol, 2006, 81:1866- 1871)研究了大肠杆菌pET表达系统在不需要专门诱导时酵母抽提物对其表达Trx - hPTH的影响，发现在复杂培养基中不同来源和不同浓度的酵母抽提物对大肠杆菌表达影响很大，高浓度的酵母抽提物有利于表达。
发明内容
鉴于以上原因发明人设计并得到了一个大肠杆菌高效分泌表达hEGF的方法。本发明公开了一种大肠杆菌不需要专门诱导高效分泌表达重组人表皮生长因子(rhEGF)的方法。大肠埃希氏菌(E. coli)通常称为大肠杆菌。具体说来，发明人提供如下的技术方案
一种大肠埃希氏菌(Escherichia coli) BTE-9,于2012年4月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为=CGMCC NO. 6014。
上述的大肠埃希氏菌BTE-9，其特征包括质粒pTEGF9，此质粒带有T71ac启动子序列、碱性磷酸酯酶信号肽基因、大肠杆菌偏好性密码子的hEGF基因、卡那霉素抗性基因，宿主菌为万.BL21 (DE3)[基因型:F-, ompT, hsdS (rBB-mB-)，gal, dcm(DE3)]。本发明还提供了上述的大肠埃希氏菌BTE-9高效分泌表达人表皮生长因子的方法，包括
(O大肠埃希氏菌BTE-9菌株的构建及高表达菌株的筛选，
(2)摇瓶发酵培养大肠埃希氏菌BTE-9表达人表皮生长因子，
(3)产物纯化。作为优选方案，根据本发明所述的大肠埃希氏菌BTE-9高效分泌表达人表皮生长因子的方法，其中，所述的步骤(I)大肠埃希氏菌BTE-9菌株的构建及高表达菌株的筛选为
(1. O构建表达质粒PTEGF9，
(1. 2)将质粒pTEGF9用CaCl2转化方法转入β. coli BL21(DE3)感受态细胞并涂布含有卡那霉素的LB平板，培养，电泳分析发酵液中hEGF含量，筛选出高表达的菌株命名为B. coli BL21 (DE3)/pTEGF9，即大肠埃希氏菌 BTE-9。作为优选方案，根据本发明所述的大肠埃希氏菌BTE-9高效分泌表达人表皮生长因子的方法，其中，所述的步骤(2)中摇瓶培养基以100 mL计含如下成分多聚蛋白胨Ig、酵母抽提物0.8 g、葡萄糖0.8 g、磷酸二氢钾0.08 g、磷酸氢二钾0.2 g、硫酸铵0.2g、无水硫酸镁0.05 g、甘氨酸0. lg、饱和酚红200 μ I。
本发明还提供了另外一种上述的大肠埃希氏菌BTE-9高效分泌表达人表皮生长因子的方法，包括
(O大肠埃希氏菌BTE-9菌株的构建及高表达菌株的筛选，
(2)发酵罐发酵培养大肠埃希氏菌BTE-9表达人表皮生长因子，
(3)产物纯化。第二种方案中，作为优选方案，根据本发明所述的大肠埃希氏菌BTE-9高效分泌表达人表皮生长因子的方法，其中，所述的步骤(I)大肠埃希氏菌BTE-9菌株的构建及高表达菌株的筛选为
(1. O构建表达质粒PTEGF9，
(1.2)将质粒pTEGF9用CaCl2转化方法转入万.co7i BL21(DE3)感受态细胞并涂布含有卡那霉素的LB平板，培养，电泳分析发酵液中hEGF含量，筛选出高表达的菌株命名为B. coli BL21 (DE3)/pTEGF9，即大肠埃希氏菌 BTE-9。第二种方案中，作为优选方案，根据本发明所述的大肠埃希氏菌BTE-9高效分泌表达人表皮生长因子的方法，其中，所述的步骤(2)中发酵培养基配方为(w/v):多聚蛋白胨2%、酵母抽提物1. 6%、葡萄糖1%、硫酸铵O. 5%、无水磷酸氢二钾O. 41%、无水磷酸二氢钾
O.16%、氯化钠O. 12%、无水硫酸镁O. 19%、甘氨酸O. 2%。第二种方案中，作为优选方案，根据本发明所述的大肠埃希氏菌BTE-9高效分泌表达人表皮生长因子的方法， 其中，所述的发酵罐发酵培养条件为
种子制备取冻存管里菌以1/500 (v/v)比例接种于有含有30 μ g/ml卡那霉素的LB培养中，220 rpm，37°C，培养至菌体浓度0D600为2.0，
发酵控制种子1% (v/v)接种入发酵罐，发酵罐内培养基含30 μ g/ml的卡那霉素,维持pH为6. 5-7. O,当溶氧下降后又上升时(约8个小时)开始流加25%葡萄糖溶液，流加速度以恒定溶氧确定，溶氧维持在20-30%，同时恒流速加入O. 2%甘氨酸(甘氨酸质量\发酵液体积)直至发酵16-17个小时结束。本发明大肠埃希氏菌BTE-9高效分泌表达人表皮生长因子的方法包括扩增磷酸酯酶信号肽和hEGF基因串联的DNA片段，克隆入质粒pET30a，得到表达质粒pTEGF9，转化大肠杆菌BL21(DE3)，筛选得到高产菌株万.co7i BL21 (DE3)/pTEGF9 (即大肠埃希氏菌BTE-9)，优化摇瓶培养和发酵培养方法，并进行产物鉴定。与现有技术相比，本发明具有以下优点
本发明的特点是，首先，在发酵表达过程中不使用诱导剂，避免了使用诱导剂(如IPTG)带来的菌体生理状态改变和质粒丢失，而且降低了生产成本，避免了有毒类诱导剂对目标产物的污染，其次，表达量高，使用优化的培养基和培养方法使摇瓶中分泌表达rhEGF可达140 mg/L,发酵罐中达到190 mg/L,所表达的rhEGF与天然hEGF有相同的结构和细胞生物活性。本发明中的菌株在发酵培养过程中不经过专门诱导就可以高效分泌表达rhEGF，简化了发酵操作，提高了分泌表达效率，此种表达方式还可用来表达其它活性多肽。
图1是本发明表达载体pTEGF9结构图，图2是本发明摇瓶发酵液HPLC分析结果，
图3是本发明已纯化rhEGF的HPLC分析结果，
图4是本发明已纯化rhEGF的SDS-PAGE分析结果，
其中I为标准品hEGF加入DTT ；2为纯化的rhEGF加入DTT ；
3为标准品hEGF ；4为纯化的rhEGF ；5为Marker，
图5是本发明rhEGF N端分析图谱，
图6是本发明摇瓶培养E. coli BL21 (DE3)/pTEGF9中rhEGF的表达量和生物量变
化，
图7是本发明发酵罐发酵E. coli BL21 (DE3)/pTEGF9中生物量，rhEGF表达量，残糖含量随时间的变化，
图8是本发明已纯化rhEGF的细胞生物活性测定。
具体实施例方式下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。主要原料、试剂和设备说明质粒pET30a，万.co7i BL21(DE3)均购自N0VAGEN公司，质粒pE-5为上海普洛康裕药物研究院生物一室保存，高效液相色谱仪购自安捷伦公司。本发明的大肠埃希氏菌(Escherichia coli) BTE-9，2011年6月从上海市浦东新区南汇工业园园中路1399号上海普洛康裕药物研究院有限公司实验室培养获得，于2012年4月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学微生物研究所，保藏号为=CGMCC NO. 6014。实施例1表达质粒pTEGF9的构建及鉴定
常规分子实验操作方法参考《分子克隆实验指南》(科学出版社第三版)。以EGF-1(5，-AAACATATGAAACAAAGCACTATTGCACTG-3’，下划线部分为引入的酶切位点)和 EGF-2 (5’ -AAAGGATCCTTATTAACGCAGTTCCCACC-3’ )为引物，质粒pE_5为模板扩增带有磷酸酯酶信号肽的hEGF基因片段，所扩增基因片段利用BamHI和NdeI双酶切，酶切产物经纯化后与BamHI和NdeI双酶切的质粒pET30a相连接，并电击转化入疋co7i T0P10感受态细胞中，涂布于含有30 μ g/ml卡那霉素的LB 平板上，过夜培养，挑取菌落以EGF-2和EGF-3(5’ -TACCATCGACACCACCACGC-3’)为引物进行菌落PCR，用琼脂糖凝胶电泳验证，验证正确的质粒经过DNA测序，正确质粒命名为PTEGF9 (图1)。实施例2表达菌株的构建、高表达菌株的筛选及质粒稳定性检测
2.1表达菌株的构建、高表达菌株的筛选
将质粒PTEGF9用CaCl2转化方法转入万.coli BL21 (DE3)感受态细胞并涂布含有30μ g/ml卡那霉素的LB平板，37°C培养过夜，挑取阳性克隆100个分别接种到10 mL含有30μ g/ml卡那霉素的液体LB培养基中，37°C，220 rpm，培养36小时，取培养液O. 5 mL，离心取上清，放入真空旋转蒸发仪上进行浓缩，浓缩定容至50 μ I。使用Tricine-SDS-PAGE方法进行电泳(此胶共三层，从上到下依次为5%的积层胶，10%的夹层胶和15%的分离胶)电泳结束后用高灵敏考马斯亮蓝染色方法染色并脱色，扫描拍照并用QuantityOne进行灰度分析，筛选出高表达的菌株命名为万.coli BL21(DE3)/pTEGF9,即大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)BTE-9，于2012年4月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称 CGMCC)，保藏号为CGMCC NO. 6014。2. 2质粒传代稳定性检测
将高产菌种疋co7i BL21 (DE3)/pTEGF9以1/1000 (v/v)比例接种于含有30 μ g/ml卡那霉素的液体LB培养基中，37°C，220 rpm，培养过夜，重复上述操作10次，每次得到的菌液稀释IO5倍涂布于没有抗性的LB平板上，37°C过夜培养，分别挑取100个平板上的菌落，划线到含有30 μ g/ml卡那霉素的LB平板上，37°C过夜培养，并计数每块平板上长出的菌落
权利要求
1.一种大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BTE_9,于2012年4月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为=CGMCC NO. 6014。
2.如权利要求1所述的大肠埃希氏菌BTE-9，其特征在于包括质粒pTEGF9带有T71ac启动子序列、碱性磷酸酯酶信号肽基因、大肠杆菌偏好性密码子的hEGF基因、卡那霉素抗性基因，宿主菌为万.BL21 (DE3)[基因型:F-, ompT, hsdS (rBB-mB-), gal, dcm(DE3)]
3.一种由权利要求1所述的大肠埃希氏菌BTE-9高效分泌表达人表皮生长因子的方法，其特征在于，所述的方法包括 (O大肠埃希氏菌BTE-9菌株的构建及高表达菌株的筛选， (2)摇瓶发酵培养大肠埃希氏菌BTE-9表达人表皮生长因子， (3)产物纯化。
4.如权利要求2所述的大肠埃希氏菌BTE-9高效分泌表达人表皮生长因子的方法，其特征在于，所述的步骤(I)大肠埃希氏菌BTE-9菌株的构建及高表达菌株的筛选为 (1. O构建表达质粒PTEGF9， (1.2)将质粒pTEGF9用CaCl2转化方法转入E.coli BL21 (DE3)感受态细胞并涂布含有卡那霉素的LB平板，培养，电泳分离培养液，筛选出高表达的菌株命名为E. coli BL21(DE3) /pTEGF9,即大肠埃希氏菌BTE-9。
5.如权利要求2所述的大肠埃希氏菌BTE-9高效分泌表达人表皮生长因子的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中摇瓶培养基以100 mL计含如下成分多聚蛋白胨I g、酵母抽提物0.8 g、葡萄糖0.8 g、磷酸二氢钾0.08 g、磷酸氢二钾0.2 g、硫酸铵0.2 g、无水硫酸镁O. 05 g、甘氨酸O. lg、饱和酚红200 μ I。
6.一种由权利要求1所述的大肠埃希氏菌ΒΤΕ-9高效分泌表达人表皮生长因子的方法，其特征在于，所述的方法包括 (O大肠埃希氏菌ΒΤΕ-9菌株的构建及高表达菌株的筛选， (2)发酵罐发酵培养大肠埃希氏菌ΒΤΕ-9表达人表皮生长因子， (3)产物纯化。
7.如权利要求6所述的大肠埃希氏菌ΒΤΕ-9高效分泌表达人表皮生长因子的方法，其特征在于，所述的步骤(I)大肠埃希氏菌ΒΤΕ-9菌株的构建及高表达菌株的筛选为 (1. O构建表达质粒PTEGF9， (1.2)将质粒pTEGF9用CaCl2转化方法转入E.coli BL21 (DE3)感受态细胞并涂布含有卡那霉素的LB平板，培养，电泳分离培养液，筛选出高表达的菌株命名为E. coli BL21(DE3) /pTEGF9,即大肠埃希氏菌BTE-9。
8.如权利要求6所述的大肠埃希氏菌BTE-9高效分泌表达人表皮生长因子的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中发酵培养基配方为(w/v):多聚蛋白胨2%、酵母抽提物1. 6%、葡萄糖1%、硫酸铵O. 5%、无水磷酸氢二钾O. 41%、无水磷酸二氢钾O. 16%、氯化钠O. 12%、无水硫酸镁O. 19%、甘氨酸O. 2%。
9.如权利要求6所述的大肠埃希氏菌BTE-9高效分泌表达人表皮生长因子的方法，其特征在于，所述的发酵罐发酵培养条件为 种子制备取冻存管里菌以1/500 (v/v)比例接种于有含有30μ g/ml卡那霉素的LB培养中，220 rpm，37°C，培养至菌体浓度0D600为2. 0，发酵控制种子1% (v/v)接种入发酵罐,发酵罐内培养基含30 μ g/ml的卡那霉素，维持PH为6. 5-7. 0，当溶氧下降后又上升时开始流加25%葡萄糖溶液，流加速度以恒定溶氧确定，溶氧维持在20-30%，同时恒流速加入O. 2%甘氨酸直至发酵16-17个小时结束。
全文摘要
本发明涉及利用基因工程的方法构建表达菌株，公开了一种大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)BTE-9，于2012年4月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.6014。还提供了该菌株高效分泌表达人表皮生长因子的方法。本发明在发酵表达过程中不使用诱导剂，避免了使用诱导剂带来的菌体生理状态改变和质粒丢失，而且降低了生产成本，避免了有毒类诱导剂对目标产物的污染，且表达量高。
文档编号C12N15/70GK103060249SQ20121018960
公开日2013年4月24日 申请日期2012年6月6日 优先权日2012年6月6日
发明者杨圣勇, 朱冬发, 李仁宝, 张辉, 王莉, 韩文琦, 董国秀, 吕岳寅 申请人:浙江普洛康裕制药有限公司, 上海普洛康裕药物研究院有限公司