一种慢病毒浓缩方法

一种慢病毒浓缩方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，特别设及一种新的慢病毒浓缩方法。
【背景技术】
[0002] 慢病毒技术可W将外源基因或外源的ShRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达 到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、屯、肌细 胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。对于 一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高 目的基因或目的ShRNA的转导效率，且目的基因或目的ShRNA整合到宿主细胞基因组的几 率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的ShRNA的稳定表达。
[0003] 同样，在体内实验的研究中，慢病毒也已经也显示出良好的基因导入效果，预计在 未来几年将获得越来越广泛的应用。
[0004] 慢病毒制备的基本过程包括含目的基因或干扰序列的载体构建和纯化提取；与辅 助质粒共转染293T细胞，培养48-72小时后收集培养上清；慢病毒颗粒的纯化和浓缩；浓 缩液的分装和低溫保存。 阳0化]在慢病毒制备过程中，浓缩环节是最重要的环节之一，一方面浓缩技术与慢病毒 颗粒从初液到浓缩液的得率相关，并影响最终成品慢病毒的滴度指标（滴度是慢病毒最 关键的技术指标）；另一方面浓缩技术也影响到慢病毒颗粒在制备过程中病毒颗粒的完整 性，进而影响到病毒的侵染效率。
[0006] 目前常规的慢病毒浓缩技术包括超速离屯、、超滤、PEG浓缩和阴离子交换柱法。超 速离屯、法需要购买昂贵的高速离屯、机（十万至几十万元），超滤和阴离子交换柱法都需要 购买价格不菲的耗材，对于制备较多个数和较大体积的慢病毒液产生很大负担，而PEG法 在浓缩过程需要的时间比较长，也需要使用离屯、机（但速度较低），对杂质的去除没有效 果。

【发明内容】

[0007] 本发明的目的在于提供一种快速简便，试剂耗材价格低廉、而无需昂贵的设备就 能实现慢病毒颗粒的有效浓缩的方法。
[0008] 本发明的技术方案为：
[0009] 一种慢病毒浓缩方法，包括W下步骤：
[0010] (1)聚丙締酸盐小珠的准备：将聚丙締酸盐小珠直接放入无水乙醇中浸泡 20-2地，吸去乙醇后置50-60°C度至完全烘干；浸泡时间优选2地，烘干溫度优选50°C;
[0011] 似病毒原液浓缩：按照每克聚丙締酸盐小珠与病毒原液的质量体积比为 l:5-15g/mL向病毒原液中加入步骤（1)制备的聚丙締酸盐小珠；质量体积比优选l:l〇g/ mL；
[0012] (3)待聚丙締酸盐小珠吸附病毒原液中的水1-化，优选化，移去聚丙締酸盐，得到 病毒浓缩液。
[001引为进一步浓缩，还可W包括步骤（4):取步骤（3)病毒浓缩液用超滤管离屯、 20-30min2-3 次。
[0014] 聚丙締酸盐是交联的高分子化合物，呈空间网络结构，由化学交联和大分子链间 的相互缠绕的物理交联构成的。当聚合物遇到水时，立即离解为带正电荷的低分子离子和 带负电的高分子离子。低分子离子与水接触而运动，离开了高分子离子链，由于带负电荷的 高分子离子间相互电排斥力，使高分子网束由相互缠绕状态逐渐伸展（或溶胀）开来，从而 造成网络结构内外产生渗透压，水分子W渗透方式向网络结构扩散，形成溶胶。因此聚丙締 酸盐有很强大的吸水性。本发明创造性地使用聚丙締酸盐为材料进行慢病毒浓缩的新技 术，并且取得了良好的浓缩病毒颗粒的效果。
[0015] 相比于现有技术，本发明的有益效果如下：
[0016] 1.本发明在慢病毒制备的重要环节一浓缩环节创新地使用聚丙締酸盐为材料进 行浓缩，摆脱了对高昂的设备和耗材的依赖，浓缩后的慢病毒基本能达到或接近使用的要 求，可应用于不同种类的细胞侵染；
[0017] 2.本发明所用的材料价格低，操作流程简单，并可进行多样品的同时处理，不受设 备处理容量的限制；
[0018] 3.该方法可W与现有技术组合使用，将使浓缩效率进一步提高，应用前景广阔。
【具体实施方式】
[0019] 实施例：
[0020] 本实施例使用的聚丙締酸盐为聚丙締酸钢交联共聚物，具有W下理化特性：
[0021]
[0022] 1.细胞接种：通过膜酶消化收集293T细胞，用DMEM+10%胎牛血清的完全培养基 W2-3XIO6细胞数接种于每个IOOmm培养皿上（Corning公司）。将细胞置于含5 %CO2的 37°C溫箱中解育12-16小时，转染前2小时换成10血新鲜培养液。
[0023] 2.制备憐酸巧一DNA沉淀：WIOOmm培养皿用1血反应总体积为例。在灭菌水中 加入所得的慢病毒质粒和辅助质粒（总量25yg为佳），再加入62y1 2M化C12,使S者总 体积达到500y1，混匀。将等体积2X皿S盐溶液逐滴加入，同时轻弹管壁，使每滴加入后及 时混匀。静置12分钟后，立即将运ImL的憐酸巧一DM悬液逐滴加入上述单层细胞的细胞 培养基中，轻轻摇动平皿混匀。
[0024] 3.转染后5-6小时换液。换成DMEM+10%胎牛血清的完全培养基。再37°CC〇2培 养箱中溫育48小时后，收获慢病毒上清液。 阳0巧]4.慢病毒上清液的浓缩：
[00%] (1)聚丙締酸盐小珠的准备：将聚丙締酸盐小珠直接放入无水乙醇中浸泡24小 时，吸去乙醇后置50度烘箱中24小时，至完全烘干。
[0027] (2)根据要缩小体积的量计算需要加入的量，按照每克聚丙締酸盐小珠能吸附 IOmL水分计算用量，向病毒原液中加入聚丙締酸盐小珠。
[00測 做吸附2小时后，移去聚丙締酸盐小珠，将液体取出，进行滴度测定（见W下步骤 5)
[0029] (4)对于需要进一步浓缩的病毒样品，可W在步骤4(3)的基础上，结合超滤管的 应用，将病毒液进一步浓缩10倍左右，则能获得总计100倍左右的浓缩效果，具体如下：
[0030] 取Millipore的超滤管（100邸），加入用4(3)步骤浓缩的病毒液3mL，4000g离屯、 20-30分钟，取出看体积缩小至多少，一般离屯、2-3次能将体积浓缩至300ul左右。
[0031] 5.慢病毒液滴度测定：将肥K293细胞培养至对数生长期，病毒稀释用培养液为含 8yg/mLPOlybrene和2%胎牛血清的细胞培养基。第一天，细胞膜酶消化计数后，按照每孔 8000细胞接种96孔板，37°C培养过夜，感染时细胞长至30 - 50%的融合密度；第二天，当 天转染时，将保存于-80°C冰箱中的病毒液冰水浴融化，用含有8yg/mLPOlybrene和2% 胎牛血清的细胞培养液进行梯度稀释，各稀释液设置如下：
[0032] ①号稀释液25Ji1病毒液巧25Ji1病毒稀释用培养基，
[0033] ②号稀释液25y1 1号稀释液巧25y1病毒稀释用培养基，
[0034] ③号稀释液25Ji1 2号稀释液巧25Ji1病毒稀释用培养基，
[0035] ④号稀释液25y1 3号稀释液巧25y1病毒稀释用培养基，
[0036] ⑥号稀释液25Ji1 4号稀释液巧25Ji1病毒稀释用培养基，
[0037] ......
[0038] 小屯、吸去96孔板中的培养基，轻轻混匀各管慢病毒稀释液，各取100y1加入每孔 细胞中，每个稀释度两个重复，放入37°C的细胞培养箱中过夜培养；第=天，去除含慢病毒 的培养基，加入IOOyl的完全培养基；第五、六天，在巧光显微镜下观察各孔中巧光细胞数 量，病毒滴度为表达巧光的细胞数乘W相应稀释倍数。
[0039] 6.慢病毒感染目的细胞：病毒感染前一天选一种细胞（如化Ia细胞）种6孔板， 种板量：2-3.OXl〇5细胞/孔；侵染当天，病毒感染时所用培养基中预先加入polybrene(终 浓度8yg/血）；6孔板中换入新鲜配置培养基：lmL/孔，WMOI= 5,10, 20梯度加入慢病 毒液，混匀后置于细胞培养箱；病毒加入后4小时左右换入新鲜不含polybrene的培养基， 37°C，5%C〇2的培养箱中继续培养。48-96小时观察细胞生长情况，如进行目的基因或干扰 效果检测的，48小时收集细胞样品，进行qPCR检测。
[0040] 7.回收率测定：使用本发明的方法浓缩慢病毒液，能在2小时左右将病毒液浓缩 10倍左右，回收率计算=(回收后滴度*回收后体积）/(原液滴度*原液体积）*100%，实 际测得回收率在70-80%，与经典的高速离屯、方法相近。
[0041] 使用聚丙締酸盐小珠进行慢病毒液浓缩，方法简单，只需要向病毒液根据体积加 入适量聚丙締酸盐小珠，就能使病毒液浓缩10倍左右，达到l*l〇STU/mU运个滴度能符合大 多数侵染细胞所需。回收率在70-80%左右，与经典的高速离屯、法相近，而无需使用高速离 屯、机。如果需要滴度更高的慢病毒液，则可W将聚丙締酸盐小珠吸附法和超滤法相结合，能 使病毒液滴度达到5*l〇s或1*10 9TU/血左右，其中离屯、机只需要低速，短时间就能达到效 果，而无需高速、长时间离屯、。
【主权项】
1. 一种慢病毒浓缩方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 聚丙烯酸盐小珠的准备：将聚丙烯酸盐小珠放入无水乙醇中浸泡18-24h，吸去乙 醇后置50-60°C至完全烘干； (2) 病毒原液浓缩：按照每克聚丙稀酸盐小珠与病毒原液的质量体积比为l:5_15g/mL 向病毒原液中加入步骤（1)制备的聚丙烯酸盐小珠； (3) 待聚丙烯酸盐小珠吸附病毒原液中的水l_3h，移去聚丙烯酸盐，得到病毒浓缩液。2. 根据权利要求1所述的慢病毒浓缩方法，其特征在于，步骤（1)中聚丙烯酸盐在无水 乙醇中浸泡的时间为20-24h，烘干温度为50-55°C。3. 根据权利要求1所述的慢病毒浓缩方法，其特征在于，步骤⑵中聚丙烯酸盐小珠与 病毒原液的质量体积比为l:8-10g/mL。4. 根据权利要求1所述的慢病毒浓缩方法，其特征在于，步骤⑶中聚丙烯酸盐小珠吸 附病毒原液中的水的时间为1. 5-2. 5h。5. 根据权利要求1所述的慢病毒浓缩方法，其特征在于，还包括步骤（4):取步骤（3) 病毒浓缩液用超滤管离心20-30min，2-3次。
【专利摘要】本发明公开了一种慢病毒浓缩方法，包括以下步骤：(1)将聚丙烯酸盐小珠直接放入无水乙醇中浸泡20-24小时，吸去乙醇后置50-60℃度至完全烘干；(2)按照每克聚丙烯酸盐小珠与病毒原液的质量体积比为1:5-15g/mL向病毒原液中加入步骤(1)制备的聚丙烯酸盐小珠；(3)待聚丙烯酸盐小珠吸附病毒原液中的水1-3h，移去聚丙烯酸盐，得到病毒浓缩液。本发明在慢病毒制备浓缩环节使用聚丙烯酸盐为材料进行浓缩，摆脱了对高昂的设备和耗材的依赖，浓缩后的慢病毒基本能达到或接近使用的要求；其所用的材料价格低，操作流程简单，并可进行多样品的同时处理，与现有技术组合使用，将使浓缩效率进一步提高。
【IPC分类】C12N7/00
【公开号】CN105296437
【申请号】CN201510388253
【发明人】谢杰, 陈海旭, 叶军, 徐红国
【申请人】上海诺百生物科技有限公司
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年7月3日