分离自臭常山正丁醇提取物的化合物及其抗虫用图
【技术领域】
[0001] 本发明设及植物病害防治技术，具体设及一种分离自臭常山正下醇提取物的化合 物及其抗虫用途。
【背景技术】
[0002] 臭常山（Orixa japonica)为芸香科臭常山属植物，分布于河南、安徽、江苏、浙江、 江西、湖北、湖南、贵州、四川、云南等地。在民间常用于治疗风热感冒、追疾等。对于臭常山， 无论是医学方面药效药理的研究，还是对其本身化学成分和生物活性的研究，都少有报道。
[0003] 南方根结线虫（Meloidogyne incognita)属垫刃目（Tylenchida)，垫刃亚目 (Tylenchina)，异皮科（Heteroderidae)，根结亚科（Meloidogyninae)，根结线虫属 (Meloidogyne)。南方根结线虫是一种高度专化型的杂食性植物病原线虫，雌雄异体，主要 危害各种蔬菜的根部，表现为侧根和须根较正常增多，并在幼根的须根上形成球形或圆锥 形大小不等的白色根瘤，有的呈念珠状，被害株地上部分生长矮小、缓慢、叶色异常，结果 少，产量低，甚至造成植株提早死亡。
[0004] 松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus)属滑刃目（Aphelenchida)，滑刃亚目 (Aphelenchina)，滑刃总科（Aphelenchoidoidea)，滑刃科（A地elenchoididae)，伞滑刃属 (Bursaphelenchus)。松材线虫病又称松枯萎病，是一种毁灭性虫害。它是通过松墨天牛 (Monochamus alterna化S)等媒介昆虫传播于松树体内，从而引发松树病害。被松材线虫感 染后的松树，针叶黄褐色或红褐色，萎黨下垂，树脂分泌停止，树干可观察到天牛侵入孔或 产卵痕迹，病树整株干枯死亡，最终腐烂。
[0005] 目前，对南方根结线虫和松材线虫的防治主要采用化学防治的方法。常用杀根结 线虫剂多为有机憐或氨基甲酸醋类的单剂或复配制剂，如嚷挫憐、硫线憐、涕灭威、克百威 等。在松材线虫侵染前数星期，用丰索憐、乙伴憐、治线憐等内吸性杀虫和杀线剂施于松树 根部±壤中，或用丰索憐注射树干，预防松材线虫侵入和繁殖。采用内吸性杀线剂注射树 干，能有效地预防松材线虫的侵入。化学防治在南方根结线虫和松材线虫的防治过程中占 有重要地位，见效快、防效好，深受青睐。但目前使用的化学杀线剂存在毒性大、环境污染严 重、易产生抗药性等诸多问题。因此，随着农民环保意识的增强和线虫抗药性的增加，化学 杀线虫剂的应用前景黯淡。
[0006] 因此，需要开发一种毒性小、不易使线虫产生抗药性的环保型药物，提高蔬菜的产 量和品质，保护我国森林资源安全和造林绿化成果。
【发明内容】
[0007] 为满足上述领域的需求，本发明提供一种从臭常山根的正下醇提取物中分离的新 化合物，该化合物能够有效杀灭南方根结线虫和松材线虫。本发明请求保护的技术方案如 下：
[000引如式（I)所示的化合物：
[0009]
[0010] 式(I)所示化合物与无机酸或有机酸形成的盐。
[0011] 式(I)所示化合物或权利要求2所述的盐在防治线虫中的用途。
[0012] 式(I)所示化合物或权利要求2所述的盐在制备抗虫制品中的用途。
[0013] -种抗虫制品，其特征在于，其抗虫活性成份包含权利要求1所述的化合物或权利 要求2所述的盐。
[0014] 式（I)所示化合物的制备方法，其特征在于，包括W下步骤臭常山根为原料进 行分离提纯获得式(I)所示的化合物或其盐。
[0015] 优选地，所述分离提纯包括采用乙醇浸提、正下醇萃取、大孔树脂分离和硅胶柱层 析。
[0016] 优选地，所述乙醇浸提:将干燥的臭常山根依次用95%乙醇、75 %乙醇、50%乙醇 和蒸馈水分别浸泡3天；
[0017] 所述正下醇萃取:所得乙醇浸提液在50°C蒸发浓缩后，室溫下经过正下醇萃取将 水相弃去，留正下醇相在60-70°C水浴锅中进行减压蒸发浓缩，然后除去正下醇得正下醇萃 取物；
[001引所述大孔树脂分离：先用5%氨氧化钢浸泡大孔树脂4-化，然后用蒸馈水洗至中 性，再用5%盐酸浸泡4-化，然后用蒸馈水洗至中性;将预处理后的大孔树脂装入玻璃色谱 柱，然后将臭常山根的正下醇萃取物用蒸馈水溶解后，加入玻璃色谱柱中；最后用蒸馈水- 无水乙醇按极性从大到小进行梯度洗脱，采用等馈分收集法收集得到粗分离物；
[0019] 所述硅胶柱层析:用丙酬溶解粗分离物，加30-50g硅胶揽拌均匀，用电吹风将拌过 样品的硅胶吹干后加入硅胶柱中，W石油酸:乙酸乙醋为洗脱剂进行等梯度洗脱，按等馈分 收集法收集活性成分。
[0020] 臭常山根在防治线虫中的用途。
[0021] -种抗虫制品，其特征在于，其药效成分为臭常山根的正下醇提取物。
[0022] 本发明提供一种新化合物，其结构如图1所示，所述新化合物是采用乙醇浸提、正 下醇萃取、大孔树脂分离和硅胶柱层析法从臭常山根部分离而得。经鉴定，该化合物是一种 生物碱，为无色结晶，舰化祕钟反应显阳性，分子式为Cl姐17N03，分子量为295.34，其化学命 (2)-3-( 4-hydroxybenzy 1 idene)-4-(4-hydroxypheny 1)-1-methyl pyrrol idin-2- one。将所述化合物分别对南方根结线虫二龄幼虫和松材线虫幼虫进行室内毒力测定，结果 表明该化合物具有杀线虫活性。与杀线虫化合物2%阿维菌素相比，新化合物对南方根结线 虫二龄幼虫和松材线虫幼虫的LDso分别是阳性对照2 %阿维菌素的107倍和59倍，有望成为 新一代生物农药。
[0023] 本发明分离获得的新化合物，可使用二甲苯、甲苯、CIO芳控、乙醇、乙腊等作为溶 剂，加入吐溫、甘油等作为助溶剂，制成抗虫制品，用于杀灭线虫。由于本发明分离获得的新 化合物是从臭常山根部提取而得，在自然条件下易分解，因此不会引起生物富集现象，并且 对人畜安全，可W作为天然农药长期使用而不会产生环境污染的问题。在本发明的一些实 施例中，所述抗虫制品也可W包含化学上相容的其它的本领域已知的具有抗虫活性的化合 物，从而增强抗虫效果。
[0024] 在本发明的一些实施例中，将本发明的新化合物与无机酸或有机酸形成生理上可 接受的盐，使化合物结构更加稳定，有利于保存和制备抗虫制品，发挥抗虫活性。
[0025] 实验证明，臭常山根的正下醇提取物也具有杀线虫活性，可将其粗提物直接用于 杀灭线虫，或与适合的溶剂及辅助试剂一起制成抗虫制品。在本发明的一些实施例中，可W 将臭常山根的正下醇提取物与本领域公知的具有杀虫活性的其它化合物同时使用，发挥综 合的抗虫作用。
【附图说明】
[0026] 图1.式(I)化合物的结构式；
[0027] 图2.式(I)化合物的iH-NMR谱图；
[002引图3.式（I)化合物的"C-NIR谱图；
[0029] 图4.式(I)化合物的HMBC谱图；
[0030] 图5.式（I)化合物的服QC谱图；
[0031] 图6.式(I)化合物的HRMS谱图。
【具体实施方式】
[0032] 下面通过具体实施例对本发明进行详细说明，需要理解的是，下述实施方式仅作 为解释说明，而不构成对本发明保护范围的任何限制。
[0033] 生物材料：
[0034] 臭常山：采自贵州省安顺市西秀区。
[0035] 南方根结线虫:为中国农业大学昆虫系人工饲养。
[0036] 松材线虫:为中国农业大学昆虫系人工饲养。
[0037] 实验仪器：
[0038] Br址er ACF300和AMX500超导核磁共振仪，瑞:t化址er公司；
[0039] 玻璃色谱柱：直径与长度85X 550mm、40X400mm、35X400mm、30X400mm、25X 400mm、20 X 350mm，购于北京博美玻璃有限公司。
[0040] 材料与试剂：
[0041] 层析硅胶(200-300目）采自青岛海洋研究所；
[0042] 薄层层析硅胶板(GF254)购于青岛海洋化工有限公司；
[0043] 石油酸、乙酸乙醋、乙醇、丙酬等均购自国药集团化学试剂有限公司；
[0044] 95%酒精采购自北京广达恒益有限公司。
[0045] 本实施例未特别说明的生物化学试剂均为本领域常规试剂，可通过本领域常规方 法配制而得，或商购获得，规格为实验室纯级即可。
[0046] 实施例1、式(I)化合物的分离
[0047] 1、臭常山根的正下醇萃取物的制备
[004引将干燥的臭常山根剪碎后，依次用95%乙醇、75%乙醇、50%乙醇和蒸馈水分别浸 泡3天，在50°C水浴锅中旋转蒸发器浓缩后，得到的乙醇浸提物先在室溫下用正己烧萃取， 分层后，取水相，在室溫下用Ξ氯甲烧萃取，分层后取水相，在室溫下用乙酸乙醋萃取分层， 取水相（由于目标产物存在于极性较大的正下醇相中，将酒精浸提物先依次用极性小于正 下醇的正己烧、Ξ氯甲烧、乙酸乙醋萃取后，除去极性较小的非目标化合物，得到的水相再 用正下醇萃取，可W提高提取分离效率），室溫经过正下醇萃取，将水相弃去，留正下醇相在 60-70°C水浴锅中进行减压蒸发浓缩，然后除去正下醇，得到正下醇萃取物，即本发明中的 臭常山根正下醇萃取物。
[0049] 2、提取物的大孔树脂粗分离
[0050] (1)大孔树脂预处理
[0051] 取lOOOg新购入的AB-8型大孔树脂（郑州艾诺化工科技有限公司），先用2-化5% 氨氧化钢溶液浸泡4-化，除去漂浮在上层的颗粒，用蒸馈水洗至中性，再用2-化5%盐酸溶 液浸泡4-化，除去漂浮在上层的颗粒，用蒸馈水洗至中性备用。
[0052] (2)装柱
[0053] 将玻璃色谱柱(85 X 550mm)垂直固定在铁架台上，在玻璃色谱柱底部塞一小块脱 脂棉，W防树脂流失。将预处理后的大孔树脂在蒸馈水中摇匀，缓慢倒入玻璃色谱柱中，沉 淀后，打开色谱柱下面的阀口，待蒸馈水流干后，关掉阀口。
[0054] (3)加样
[0055] 将臭常山根的正下醇萃取物(30g)用蒸馈水溶解稀释后，沿玻璃色谱柱壁缓慢倒 入色谱柱中，下端阀口打开，用Ξ角瓶接收，将接收到的液体从上端倒回色谱柱中，使更多 的样品吸附在大孔树脂上。待接收到的液体接近淡黄色至无色时，表示上样完毕，将柱内的 液体放干，弃去。
[0056] (4)洗脱
[0057] 洗脱剂采用蒸馈水-无水乙醇，按极性