一种用于山茶根结线虫lamp快速检测的引物组合物及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于山茶根结线虫LAMP快速检测的引物组合物及其应用。一种用于山茶根结线虫LAMP快速检测的引物组合物，由以下引物组成：MC-F3：SEQ?ID?NO.2，MC-B3：SEQ?ID?NO.3，MC-BIP：SEQ?ID?NO.4，MC-FIP：SEQ?ID?NO.5，MC-LB：SEQ?ID?NO.6。利用该引物组合物进行山茶根结线虫的LAMP快速检测，特异性强、灵敏度高，因此，本发明所述的引物组合物可在检测和/或鉴定山茶根结线虫中应用。
【专利说明】—种用于山茶根结线虫LAMP快速检测的引物组合物及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物检测领域，涉及一种用于山茶根结线虫LAMP快速检测的引物组合物及其应用。
【背景技术】
[0002]根结线虫(Meloidogye spp.)是全世界范围内威胁农业生产的重要病原物之一，能够寄生3000多种植物，几乎涵盖了大部分重要的粮食及经济作物，每年因其危害给全球造成近千亿美元的经济损失[1]。目前国际上已报道的根结线虫超过100种[2]，我国有记载发生的近40种[3]。鉴于其重要的经济意义，我国于2007年将根结线虫(非中国种)列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》，在全国各个口岸实施严格检疫，以保护我国农业和生态安全。
[0003]山茶根结线虫(Meloidogyne camelliae)最早于1965年在日本的山茶根中发现
[4]，之后的研究证实该种线虫能够寄生柃木、滨柃、茶树、白三叶、小果核果茶、水蛇麻、酢浆草以及绛车轴草和红车轴草等多种植物[5_6]。一直以来山茶根结线虫目前仅在日本有发生，对该国多种山茶科植物具有较大的危害，然而自2012年至今，我国检疫人员已经连续多次在宁波口岸从来自日本的山茶、茶梅和罗汉松根和根围介质中截获山茶根结线虫[7]。此前该线虫在我国从未有发生和报道，属于中华人民共和国进境植物检疫性有害生物，其一旦传入我国，将对我国多种山茶科植物造成极大的威胁，因此，加强进出口口岸对山茶根结线虫的检测具有极其重要的意义。
[0004]目前，针对该病原线虫的检测鉴定尚只能依据形态学特征，由于实际操作过程中通常需要具有丰富经验的专业技术人员，且需要足够数量的线虫样本，鉴定过程费时费力，因此往往难以满足口岸高通量货物进出口的需求。虽然近年来随着分子生物学相关技术的发展，包括限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)、实时突光定量 PCR (Real - time quantitative Polymerase Chain Reaction, qRT - PCR)、特定序列扩增(Sequence Characterized Amplified Regions, SCAR)等多种生物技术已经被成功运用到有害生物包括植物线虫的检测鉴定中[8_1(1]，但目前国内外尚无任何针对山茶根结线虫的分子检测技术报道。
[0005]环介导等温扩增技术(Loop- mediated isothermal amplification, LAMP)是一种利用具有链式置换活性的DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)开发的一种恒温扩增方法
[11]，在恒温条件(60°C左右)30 -90分钟即可完成扩增反应。反应过程中不需要PCR仪、电泳仪及凝胶成像仪等专业设备，而是利用反应过程中产生焦磷酸镁出现浑浊沉淀，或者通过向其扩增产物中添加荧光染料，仅凭肉眼就能够判定扩增结果，具有操作简单，经济高效等特性，在生物的快速检测鉴定中具有广泛的应用前景。目前该技术已经在针对我国已发生根结线虫一南方根结线虫[12] (M.1ncognita)和象耳豆根结线虫[13] (M.enterolobii)快速检测中得到了应用，但在根结线虫非中国种且具有传入我国极大潜在风险的山茶根结线虫中尚无相关报道。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是针对国内外尚无相关病原的分子检测技术，提供一种用于山茶根结线虫LAMP快速检测的引物组合物。
[0007]本发明的另一目的是提供该弓丨物组合物的应用。
[0008]本发明的又一目的是提供一种山茶根结线虫LAMP快速检测方法。
[0009]本发明的目的可通过如下技术方案实现:
[0010]一种用于山茶根结线虫LAMP快速检测的引物组合物，由以下引物组成:MC_F3:SEQ ID N0.2，MC-B3:SEQ ID N0.3,MC-BIP:SEQ ID N0.4,MC-FIP:SEQ ID N0.5,MC-LB:SEQID N0.6。
[0011]本发明所述的引物组合物在检测和/或鉴定山茶根结线虫中的应用。
[0012]本发明所述的引物组合物在制备山茶根结线虫检测和/或鉴定试剂中的应用。
[0013]一种山茶根结线虫检测试剂，包含本发明所述的引物组合物。
[0014]一种山茶根结线虫LAMP快速检测方法，包括以下步骤:
[0015](1)提取待检样品DNA ；
[0016](2)以提取的DNA为模板，利用本发明所述的LAMP引物组合物进行LAMP扩增；
[0017](3) LAMP扩增反应结束按照以下任意一种方式观察结果:
[0018]1)向扩增产物中加入显色剂，轻晃混匀，即可观察，扩增产物具有绿色荧光，表明样本中含有山茶根结线虫；
[0019]2)取扩增产物在2%琼脂糖凝胶电泳中电泳，EB染色，在紫外灯下观测，扩增产物呈梯形条带，表明样本中含有山茶根结线虫；
[0020]3)将反应后的离心管3000rpm离心30sec，管底观察到白色沉淀，表明样本中含有山茶根结线虫。
[0021]其中，步骤⑵所述LAMP扩增的反应体系优选为25 μ 1，由
[0022]1)引物混合液:外引物MC -F3和MC-B3各0.2ymol/L，内引物MC -FIP和MC -BIP各 0.8 μ mol/L,环引物 MC - LB 为 0.4 μ mol/L ；
[0023]2)反应混合液:lmmol/L dNTP, 5mmol/L MgCl2, 20mmol/L Tris - HCl (ρΗ8.8)，IOmmoI/L KC1，10mmol/L(NH4)2S04，2mmol/L MgSO4,0.1% Triton x - 100，8U Bst DNA 聚合酶大片段；
[0024]3) 1 μ I DNA 模板；
[0025]4)灭菌双蒸馏水组成。其中各成分的浓度均表示在反应体系中的终浓度。
[0026]步骤⑵所述LAMP扩增的反应条件优选:61~65°C保温30~90min，80°C保温IOmin0
[0027]所述的显色剂优选SYBR green I与PCR级DMSO以1:9体积比的混合物。
[0028]有益效果:
[0029]一、检测效率高，设计开发了一种针对山茶根结线虫的快速分子检测技术，I小时左右可获得检测结果，而目前针对该线虫主要采用的形态学鉴定方法需要收集大量线虫，并进行固定、拍照和测计，至少需要数天才能完成，因此本发明与现有方法相比可节省大量时间。
[0030]二、鉴定准确率高，根据山茶根结线虫的28S6个不同区域设计出5条特异性引物，进行LAMP扩增，鉴定结果比形态学方法准确。
[0031]三、灵敏度高，对山茶根结线虫的检测极限可达到1/100000条幼虫水平，因此有I条线虫即可完成鉴定，而目前采用的形态学鉴定通常需要不同龄期共计至少数十条线虫进行测计。
[0032]四、对仪器设备要求低，不需要任何PCR仪、凝胶电泳和成像系统，只需要一个水浴锅或者保温瓶就可以完成检测。
[0033]五、操作简单，结果容易辨别，通过不同颜色，肉眼即可观察结果，不需要繁琐的电泳和紫外观察，一般技术人员即可完成检测。
[0034]六、对人和环境友好，检测过程不需要使用EB等有毒试剂，减少环境污染。
[0035]综上所述，本发明具有比现在通常采用的形态学检测山茶根结线虫的方法具有更高的检测效率、灵敏度和可操作性。该技术可应用于我国海关进境苗木口岸检疫过程中对山茶根结线虫快速分子检测，具有实际的应用价值。
【专利附图】
【附图说明】 [0036]图1为山茶根结线虫28S序列的LAMP引物设计示意图。
[0037]图2为山茶根结线虫LAMP方法检测
[0038]A图为加入荧光染料检测结果，1:阳性结果，具有绿色荧光；2:阴性对照，为红褐色；
[0039]B图检测结果为电泳图，M:DL2000DNA标准分子量(Takara) ；1:阳性结果，为LAMP扩增梯形条带；2:阴性对照，无扩增产物。
[0040]图3为山茶根结线虫LAMP检测方法特异性检测结果图
[0041]A为LAMP加荧光染料检测结果图，1:山茶根结线虫；2:南方根结线虫；3:爪哇根结线虫；4:花生根结线虫；5:北方根结线虫；6:象耳豆根结线虫；7:西班牙根结线虫；8:松材线虫；9:拟松材线虫；10:穿刺短体线虫；11:燕麦真滑刃线虫；12:阴性对照；
[0042]B为LAMP检测结果电泳图；
[0043]图中1- 12泳道的DNA样本如A所示。
[0044]图4为山茶根结线虫灵敏度检测结果
[0045]A 为 LAMP 加荧光染料检测结果图，1- 8 分别为:10_1、10_2、10_3、10_4、10_5、10_6、10 -7条线虫DNA和阴性对照；
[0046]B为LAMP检测结果电泳图，M:DL2000DNA标准分子量(Takara);图中I _8泳道的DNA样本如A所示。
[0047]图5颜色判定海关进境日本罗汉松根围介质中山茶根结线虫
[0048]A为LAMP加荧光染料检测结果图，1- 11为进境日本罗汉松根围介质中山茶根结线虫扩增结果，呈现绿色，表明罗汉松根围介质中携带山茶根结线虫；12为阴性对照，显红褐色，表明样本中不携带山茶根结线虫。
[0049]B为LAMP检测结果电泳图，图中I _ 12泳道的DNA样本如A所示。【具体实施方式】
[0050] 下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明。
[0051]所述试剂均为市售，主要试剂:Taq DNA聚合酶、DNA marker购自TaKaRa公司；弓丨物由上海英俊生物技术有限公司合成；pGEM-T EasyVector购于美国promega ；ProteinaseK(蛋白酶K)购自Roche公司；Bst DNA聚合酶大片段购自New England Biolabs公司；SYBRgreen I购自
[0052]Invitrogen 公司。
[0053]实施例1山茶根结线虫DNA的提取、rDNA28S扩增及序列分析
[0054]1.1山茶根结线虫DNA的提取
[0055]挑取单条山茶根结线虫或雌虫放入含有8μ LddH2O和I μ LlO X PCRBuffer (Mg2+free)的0.2mL离心管中，放入液氮中冷冻Imin后，置于95°C下2min,重复4~5次；向PCR管中加入I μ L10mg/ml蛋白酶K，然后将离心管在65°C下温育90min，95°C反应IOmin处理后上清液作为线虫DNA模板直接用于LAMP和PCR反应。
[0056]1.2山茶根结线虫rDNA28S扩增及序列分析
[0057]采用28S 区的通用引物 D2A(5’ - ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG - 3’，SEQ ID N0.7)和 D3B(5’ - TCGGAAGGAACCAGCTACTA - 3’，SEQ ID N0.8)扩增山茶根结线虫种群 rDNA28S区片段。PCR 扩增反应体系为 10XBuffer(Mg2+free)2y 1，10mmol/L dNTP2 μ 1，10mmol/LMgCl22 μ 1，引物 TW81 和 AB28(2.5ymol/L)各 2μ l，Taq 酶(5U/μ 1，Takara) 0.5 μ 1，模板DNA5y 1，灭菌ddH20补足至25 μ I。PCR扩增条件为:94°C预变性4min，94°C变性30sec,56。〇退火3086。，721:延伸lmin，40个循环；7°C再次延伸10min，4°C保存。PCR扩增后，取5 μ I扩增产物加I μ I加样缓冲液在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外灯下观察并拍照，回收、克隆和测序如SEQ ID N0.1，序列测定由上海英俊生物技术有限公司完成。
[0058]实施例2LAMP技术检测山茶根结线虫方法的建立
[0059]2.1LAMP 引物设计
[0060]根据山茶根结线虫28S区扩增后测序结果，设计并筛选下列LAMP引物(见图1)，引物交上海英俊生物技术有限公司合成。引物序列如下:
[0061]①MC - F3:5，- CGTCTCGTTGCTCAGTTGTT - 3，(SEQ ID N0.2)；
[0062]②MC - B3:5，- GTACGCGCGTGTACACATT - 3，(SEQ ID N0.3)；
[0063]③MC - BIP:
[0064]5，- CGGTGCGGTCTCCGTTTTGAAGAACGGCACTCCCACAG - 3，(SEQ ID N0.4)；
[0065]④MC - FIP:
[0066]5，- CCTGCACGCACTCCACATGTAATGGACTCCAGATTGGGACAA - 3，(SEQ ID N0.5)；
[0067]⑤MC - LB:5，- GGCCAACATTTTGTTGGTACCCG - 3，(SEQ ID N0.6)；
[0068]2.2LAMP反应体系配置:
[0069]引物混合液:外引物MC - F3和MC - B3各0.2 μ mol/L,内引物MC - FIP和MC - BIP各 0.8 μ mol/L,环引物 MC - LF 为 0.4 μ mol/L ；
[0070]2)反应混合液:lmmol/L dNTP, 5mmol/L MgCl2, 20mmol/L Tris - HCl (ρΗ8.8)，IOmmoI/L KC1，10mmol/L(NH4)2S04，2mmol/L MgSO4,0.1% Triton x - 100，8U Bst DNA 聚合酶大片段；1 μ IDNA模板，加灭菌双蒸馏水补全到25 μ I。[0071]2.3LAMP反应扩增条件:将以上混合液置于62°C恒温水浴中等温扩增60min，80°C保温lOmin，反应结束后加入2 μ I配制好的显色剂混匀后观察结果(图2Α)。取2 μ I产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外灯下观测并拍照，可看到有LAMP特征性梯形带(图 2B)。
[0072]实施例3山茶根结线虫LAMP特异性检测
[0073]收集南方根结线虫，爪哇根结线虫，花生根结线虫，北方根结线虫，象耳豆根结线虫，西班牙根结线虫，松材线虫，拟松材线虫，穿刺短体线虫,燕麦真滑刃线虫，分别提取其DNA作为模板与山茶根结线虫DNA模板一起进行LAMP检测，以检测山茶根结线虫LAMP检测方法的特异性。
[0074]上述引物混合液和反应缓冲混合液混合均匀后，加入I μ I模板DNA，按照2.3的反应条件进行，反应结束后加入2 μ I配制好的显色剂混匀后，观察颜色变化，第I管为山茶根结线虫DNA，可以观察到绿色荧光，其他管的线虫和阴性对照均为红褐色(如图3中A所示)。取2μ I产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外灯下观测并拍照(如图3中B所示)，可看到第I泳道(山茶根结线虫)有LAMP的特征性梯形带，其他泳道均未发现有扩增产物，结果表明上述LAMP引物和反应体系在检测山茶根结线虫时具有极高的特异性。
[0075]实施例4山茶根结线虫LAMP灵敏度检测
[0076]将单条山茶根结线虫DNA模板按10倍梯度稀释成1.0X10_1~1.0X10 —7个浓度，各取I μ IDNA做模板，将上述的引物混合液和反应混合液混合均匀后，按2.3反应条件进行，反应结束后加入I μ I配制好的显色剂混匀后，观察颜色变化(如图4Α所示)，I~5管均可以看到绿色荧光。取2μ I产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外灯下观测并照相(如图4中B所示)，可以看出I~5泳道均有LAMP的特征性梯形带，灵敏度能达到1/100000头线虫。以上结果说明:上述LAMP检测体系能够检测到1/100000头山茶根结线虫，具有极高的灵敏度。
[0077]实施例5从从海关进境日本罗汉松根围介质中检测山茶根结线虫
[0078]I)进境植物根围土样中线虫的分离
[0079]从植物苗木根围用取样铲挖取近根围的介质0.5kg以上，采用浅盘法分离样本中的线虫，先铺一层滤纸在20目筛网上，然后在滤纸上加入适量的根围介质或土样，将筛网置于稍大的实底浅盘中，轻轻注入适量的水使其浸没土样，室温放置24~48h后，用400目筛网将浅盘中的线虫悬浮液收集于小皿中。
[0080]2)线虫DNA的提取
[0081]将线虫悬浮液移入1.5ml离心管，在6000r.HiirT1转速下离心3分钟，弃上清；加Λ 16 μ LddH2O和2 μ LlO XPCR Buffer (Mg2+free)到离心管中，将线虫悬浮液转移至0.2mL离心管中，放入液氮中冷冻Imin后，置于95°C下2min，重复4~5次；向PCR管中加入2 μ L10mg/ml蛋白酶K，然后将离心管在65°C下温育90min，95°C反应10min处理后上清液作为线虫DNA模板直接用于LAMP检测。
[0082]3)山茶根结线虫LAMP检测
[0083]取I μ LDNA模板，加入实施例2所述的检测溶液，总体积25 μ L，反应程序为620C 60min ;扩增结束后 加入显色剂(SYBR green I与PCR级DMSO以I:9体积比的混合)，反应体系呈现绿色，以此判断进境苗木根围介质中含有山茶根结线虫(图5中A所示)取2μ I产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外灯下观测并拍照(如图5中B所示)。
[0084]参考文献
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【权利要求】
1.一种用于山茶根结线虫LAMP快速检测的引物组合物，其特征在于:由以下引物组成:
MC-F3:SEQ ID N0.2，MC_B3:SEQ ID N0.3,MC-BIP:SEQ ID N0.4,MC-FIP:SEQ ID N0.5及 MC-LB:SEQ ID N0.6。
2.权利要求1所述的引物组合物在检测和/或鉴定山茶根结线虫中的应用。
3.权利要求1所述的引物组合物在制备山茶根结线虫检测和/或鉴定试剂中的应用。
4.一种山茶根结线虫检测试剂，其特征在于包含权利要求1所述的引物组合物。
5.一种山茶根结线虫LAMP快速检测方法，其特征在于包括以下步骤: (1)提取待检样品DNA； (2)以提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的LAMP引物组合物进行LAMP扩增； (3)LAMP扩增反应结束按照以下任意一种方式观察结果: 1)向扩增产物中加入显色剂，轻晃混匀，即可观察，扩增产物具有绿色荧光，表明样本中含有山茶根结线虫； 2)取扩增产物在2%琼脂糖凝胶电泳中电泳，EB染色，在紫外灯下观测，扩增产物呈梯形条带，表明样本中含有山茶根结线虫； 3)将反应后的离心管3000rpm离心30sec，管底观察到白色沉淀，表明样本中含有山茶根结线虫。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于步骤(2)所述LAMP扩增的反应体系为25 μ I,由1)引物混合液:外引物MC-F3和MC-B3各0.2 μ mol/L,内引物MC-FIP和MC-BIP各0.8ymol/L,环引物 MC-LB 为 0.4 μ mol/L ;
2)反应混合液:lmmol/LdNTP, Smmol /T, MgCl2, 20mmol/L Tris-HCl (pH8.8), 10mmol/LKCl, lOmmol/L (NH4) 2S04, 2mmol/L MgSO4,0.1% Triton x_100，8U Bst DNA 聚合酶大片段；
3)I μ I DNA 模板； 4)灭菌双蒸馏水组成。
7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于步骤(2)所述LAMP扩增的反应条件为:61 ~65°C保温 30 ~90min，80°C保温 lOmin。
8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于所述的显色剂为SYBRgreen I与PCR级DMSO以1:9体积比的混合物。
【文档编号】C12N15/11GK103924001SQ201410183373
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月30日 优先权日:2014年4月30日
【发明者】王暄, 李红梅, 顾建锋, 魏洪岩, 徐丽娜, 李师墨, 王宏宝 申请人:南京农业大学