一种虫生真菌抗菌肽的制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种虫生真菌抗菌肽制品及其制备方法和应用，本发明的虫生真菌抗菌肽制品选用虫生真菌蝉花虫草为原料，优化的发酵培养液发酵培养后，经纱布过滤除菌丝后离心收集上清；上清旋转蒸发浓缩后乙醇沉淀去多糖，去除多糖的上清经硫酸铵盐析收集沉淀。沉淀溶于灭菌水后经SephadexG-15柱层析、DEAE-SepharoseFF阴离子交换层析和SephadexG-50柱层析纯化后得到虫生真菌抗菌肽制品。该抗菌肽制品主要是一些分子量小于5.8kDa的小分子肽类。产品为淡黄色粉末状，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等具有抑菌活性。本发明具有简便快速，制备的抗菌肽纯度高、活性强的特点。制备的抗菌肽制品可广泛应用于医药原料、食品、果蔬防腐保鲜以及饲料添加剂和护肤品等领域。CGMCC NO.89892014.04.03
【专利说明】一种虫生真菌抗菌肽的制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种虫生真菌抗菌肽制品及其制备方法和应用。本发明涉及生物活性 物质分离纯化的【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 青霉素等抗生素的发现给病原菌感染性疾病的治疗带来了革命性飞跃。与此同时 人们也意识到病原微生物将最终会产生抗性。但令人惊讶的是病原菌抗性产生的速度和抗 性的广泛性。近年来，在临床治疗中结构新颖的抗生素发现匾乏，抗药菌群迅猛发展，使某 些感染性疾病成为临床治疗的难题。抗生素、化学防腐剂作为病原菌抑制剂添加到食品、饲 料和化妆品中由来已久。但随着抗生素和化学防腐剂的广泛使用和人们对食品质量和环境 质量的要求不断提高，它们的副作用也就日益表现出来，面临着被淘汰的局面。据美国卫生 基金会和国家癌症研究所新公布的一份报告表明在全世界每年罹患癌症的500万人中，有 50%左右与食品污染有关，而其中有30%左右受害于食品中的抗生素或化学防腐剂。为了应 对以上种种问题，人们在不断研究和开发新型天然抗菌药物和抗菌防腐添加剂。近年来出 现的抗菌肽就是一类具有巨大发展潜力的新型抗菌药物、食品防腐保鲜添加剂和饲料添加 剂。
[0003] 抗菌肽是一类小分子阳离子肽类生物活性物质，广泛存在微生物、植物、动物及人 体内。到目前为止，已从生物界分离得到800多种抗菌肽。虽然抗菌肽具有广泛的抗性(抗 细菌、真菌、病毒、原虫等活性)，但是对正常的哺乳动物细胞无毒性。抗菌肽并不诱发抗性 突变的产生，多数抗菌肽的水溶性较好，对热稳定，对较大离子强度、较低或较高的pH都有 较强的耐受性。因而抗菌肽可以作为医用和食品方面抗菌性的抗生素的替代药物或添加 齐U。抗菌肽的开发与应用研究已成为国内外研究的热点。
[0004] 基于抗菌肽的重要作用，许多学者开展新型抗菌肽的寻找及制备研究。寻找和制 备抗菌肽有三种途径：化学合成，生物工程(重组技术)和从生物中筛选天然的抗菌肽类。化 学合成常受到合成起始点的基础结构的限制。生物工程也存在如不正确转录而导致折叠不 准确的蛋白质等问题。从生物中筛选抗菌肽具有来源丰富、物质天然等优点，因而倍受抗菌 肽研究工作者的青睐。
[0005] 微生物在人类的生产和生活中具有广阔的应用范围，如治疗药物、精细化工、农用 药物、发酵及食品工程等。近年来微生物来源的生物抗菌物质已经逐步得到开发和利用， 这些抗菌物主要来源于细菌、真菌及放线菌。真菌是由不同进化途径的类群组成，现已发 现69000种。真菌被用作药物，在我国已有悠久的历史，它不仅是我国天然药物资源和中草 药的一个极为重要的组成部份，而且已成为当今探索和发掘新药的重要领域。目前国内外 学者已经发现了许多具有新颖结构和抗菌活性的真菌抗菌活性物质，主要包括萜类及其皂 苷、生物碱类、芳香类、留体类、酚类和酚酸类以及肽类等。
[0006] 这些抗菌物质多为从植物内生真菌中分离纯化出来的，而从虫生真菌中分离报道 的则还没有。虫生真菌是指那些在正常生理条件下就能直接侵入寄主体内，增殖和快速引 起死亡以及一些不引起昆虫致命疾病，但可降低寄主活力并使其衰弱的真菌类群。虫生真 菌种类多，数量大，代谢类型复杂，可以产生多种生理功能特异的生物活性物质，这种代谢 产物的多样性为人类开发新的药品及其它领域的利用提供了重要的新资源途径。
【发明内容】
[0007] 针对现有技术中存在的问题与不足，本发明的目的在于提供一种虫生真菌抗菌肽 制品及其制备方法和应用。本发明具有制备的抗菌肽纯度高、活性高的特点。
[0008] 本发明的目的通过以下技术方案予以实现： 本发明提供了一种虫生真菌抗菌肽制品的制备方法：本发明选用虫生真菌蝉花虫草为 原材料，优化的发酵培养液发酵培养后，经纱布过滤除菌丝后离心收集上清；上清旋转蒸发 浓缩后乙醇沉淀去多糖，去除多糖的上清经硫酸铵盐析收集沉淀。沉淀溶于灭菌水后经柱 层析纯化后得到虫生真菌抗菌肽制品。
[0009] 在一些优选的方式中，本发明使用的虫生真菌为保藏于中国普通微生物菌种保藏 管理中心，保藏号为 CGMCC NO. 8989 的蝉花虫草（QoAiocor办ceps ^0^///6^3) 022007-9 号菌株。蝉花虫草又被称作为蝉拟青霉，是一种虫生真菌。
[0010] 在另一些优选的方式中，一种从保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏 号为CGMCC NO. 8989的蝉花虫草（QMiocor办SoAoBfera) 022007-9菌株提取抗菌 肽的方法，包括：（1)菌种活化及种子制备：挑取保藏菌株的成熟孢子在PSA斜面上培养， 25±1°C活化7?IOcL用灭菌蒸馏水加入斜面中，将孢子冲洗下来，用力震摇3?5min，制 成孢子悬浮液(种子)，血球计数法计算孢子浓度待用； (2)发酵培养：将孢子浓度为6X IO7的孢子悬浮液1毫升接种到筛选出的250毫升的 发酵培养液中，摇床转速120rpm/min，25土 1°C条件下培养7d ;其中，所述的发酵培养液的 为：蛋白胨 5g/ L，蔗糖 20g/ L，KH2PO4 lg/ L，MgSOJH2O 0.5g/ L，溶剂为蒸馏水。
[0011] (3)发酵液的处理：经过步骤（2)发酵的发酵液经双层纱布过滤除菌丝后，在4°C 下，12 000 rpm/ min离心30 min除去发酵液中较大颗粒物质；按10 : 1体积比加入无 水乙醇，64°C下旋转蒸发浓缩至50倍；按1 : 3体积比加入无水乙醇，充分搅拌后，在4°C 冰箱内静置过夜沉淀多糖，后在4°C下，12 000 rpm / min离心30min;收集上清，64°C下旋 转蒸发至干后用灭菌蒸馏水重溶；其中纱布的孔径为100目。
[0012] (4)硫酸铵盐析：将步骤（3)用灭菌蒸馏水重溶后的样品在4°C条件下缓慢加入固 体硫酸铵，边加边搅拌使硫酸铵的饱和度达到60%，搅拌半个小时，静置过夜，后在4°C下， 12 000 rpm / min离心30min;最后收集沉淀；沉淀溶于灭菌蒸馏水中，经0.45 iiM膜过滤 后，保留滤过液； (5)将经过步骤（4)溶于灭菌蒸馏水的沉淀进行S印hadex G-15柱层析、 DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析和Sephadex G-50柱层析分离纯化得到所述的虫生真 囷抗囷肤制品。
[0013] 一些优选的方式中，所述的S印hadex G-15柱层析方法是：将上述溶于灭菌蒸 馏水的（ImL)沉淀上样于Sephadex G-15柱（2. 6 X 10 cm)，以纯水作为流动相洗脱，流速 4mL / min，检测波长为280_，收集第II个峰组分获得的样品II)，冷干后低温下冻存。
[0014] 在一些优选的方式中，所述的DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析是：将经过 Sephadex G-15柱层析后活性峰样品（II) ImL上样于DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱 (2.6\10〇11)，流速3 1111/111111，检测波长 280"。分别以0.05、0.1、0.3、0.5和1111〇1/1 NaCL缓冲液（pH 6. 5)进行洗脱，收集第1峰组分获得得样品1，冷干后低温冻存。
[0015] 在一些优选的方式中，所述的Sephadex G-50柱层析是将ImL生物上述样品1上 样于 S印hadex G-50 柱（1.6 X 30 cm)，以 0.05 mol / L NaCL 缓冲液（pH 6. 5)作为流动相 洗脱，流速〇.4mL / min，检测波长为280_，收集所示标记为Gl组分。冷干后即为所述的虫 生真菌抗菌肽制品，低温冻存。
[0016] 本发明提供的上述制备方法制备的虫生真菌抗菌肽制品，是由分子量较小的肽类 组成的，主要是一些分子量小于5. 8 kDa的小分子肽类，外在形态表现为淡黄色粉末状。 [0017] 本发明还提供了一种虫生真菌抗菌肽制品作为原料的应用，采用上述方法制备的 抗菌肽制品能用作医药原料，食品、果蔬防腐保鲜剂，饲料添加剂和护肤品。
[0018] 发明人对本发明抗菌肽制品进行了以下的检测或测定： 本发明采用常规的高效液相色谱（HPLC)和N-三（羟甲基）甲基甘氨酸聚丙烯酰胺 凝胶电泳（Tricine-SDS - PAGE)对制备的抗菌肽进行组成及纯度检测；利用Lambert等 (1989)的平板打孔穴抑菌法对制备的抗菌肽进行抗菌活性测定； 本制备工艺生产的虫生真菌抗菌肽制品具有如下特征：该抗菌肽是从虫生真菌蝉花 虫草中制备得到的一种由多种肽类组成的混合物，主要是一些分子量小于5. SkDa的小分 子肽类。产品为淡黄色粉末状，对金黄色葡萄球菌aareys)和大肠杆菌 co/i)等都具有抑菌活性，而且表现出很好的抗菌性。
[0019] 生物保藏说明 该真菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号码为CGMCC NO. 8989,地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，拉丁学名： 办ce/751 soAo/i/kra，中文名称为：蝶花虫草，保藏日期为：2014年4月03日。
[0020] 有益效果 本发明具有原料来源丰富，价格低廉，简便快速，制备的抗菌肽纯度高、活性高，抗菌效 果好于常用的天然肽类防腐剂（如NiSin)和化学防腐保鲜剂(如脱氢醋酸钠)。本发明产 品与化学合成抗菌剂相比具有无毒，无残留，不受合成起始点的基础结构的限制；选择可以 食用的虫生真菌蝉花虫草作为原材料，具有较高的食用安全性；本发明制备方法可大规模 工厂化生产，生产周期短，生产成本较低，且不受外在环境的影响。制备的抗菌肽制品可广 泛应用于医药原料、食品、果蔬防腐保鲜以及饲料添加剂和护肤品等领域。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图1是虫生真菌抗菌肽的Sephadex G-15柱层析图。
[0022] 图2是虫生真菌抗菌肽的DEAE-S印harose FF阴离子交换层析图。
[0023] 图3是虫生真菌抗菌肽的Sephadex G-50柱层析图。
[0024] 图4是虫生真菌抗菌肽制品组成及纯度Tricine-SDS - PAGE检测，其中M :蛋白 质分子量标准；1 :浓缩发酵液；2 :盐析后沉淀；3 :阴离子交换层析后活性组分（图2中"1" 组分）；4 :S印hadex G-50柱层析后活性组分（图3中"G1")。
[0025] 图5是虫生真菌抗菌肽制品组成及纯度HPLC分析。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合附图和具体实施例来进一步详细说明本发明，但本发明的实施方式不限 于此。
[0027] 选用虫生真菌蝉花虫草作为原材料，经发酵培养后制备虫生真菌抗菌肽的方法包 括以下实施例1、2、3、4和5所述过程。
[0028] 实施例1不同发酵培养液虫生真菌蝉花虫草产生活性肽的影响 (1) 虫生真菌菌种：蝉花虫草（022007-9菌株； (2) 菌种活化及种子制备：挑取保藏菌株的成熟孢子在PSA斜面上培养，25土 1°C活化 7?10d。用灭菌蒸馈水加入斜面中，将孢子冲洗下来，用力震摇3?5min，制成孢子悬浮液 (种子)，血球计数法计算孢子浓度待用； (3) 发酵培养：将6X IO7孢子悬浮液体1毫升分别接种到以下三种不同的250mL的发 酵培养液中，摇床转速120印111/111111，25±11：条件下培养7(1，各3个重复，摇床转速120印111/ min，25 土 1°C条件下培养7d ;各3个重复；选用的发酵培养液：①马铃薯200g，蔗糖20g，蒸 馏水IL ; ② 蛋白胨 5g，蔗糖 20g，KH2PO4 lg，MgSO4 ? 7H20 0? 5g，蒸馏水 IL ; ③ 蛋白胨 5g，葡萄糖 20g，KH2PO4 lg，MgSO4 ? 7H20 0? 5g，蒸馈水 1L。
[0029] 摇床结束后分别取滤液和菌丝体，测定菌丝体干重及滤液对细菌的抗菌活性。不 同的发酵培养液对发酵液抗菌活性的影响见表1。从表中数据我们可以看出，在①和②发 酵培养液之间，无论是从抑菌圈直径，还是从单位重量的菌丝体产生的抑菌圈直径（即抗 菌效价)，②发酵培养液产生的抗菌肽的效果要优于①发酵培养液，在抗菌效价上提高了 39. 62%。在②和③发酵培养液之间（即氮源固定，碳源变化)，从表可以看出不同的碳源既可 以影响菌体的生长，又可以影响抗菌效价。从抗菌效价上，②培养液的效果明显优于③培养 液，抗菌效价提高58. 53%。
[0030] 综合以上分析，我们确定实验室条件下蝉花虫草022007-9菌株产生抗菌肽的较 佳发酵培养液为②发酵培养液，即蛋白胨5g (0.5%)，蔗糖20g (2%)，KH2PO4 Ig (0.1%)， MgSO4 ? 7H20 0? 5g (0? 05%)，蒸馏水 1L。
【权利要求】
1. 一种从虫生真菌制备抗菌肽制品的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：（1)、 菌种活化及种子制备：挑取保藏菌株的成熟孢子在PSA斜面上培养，25± 1°C活化7?10d ; 用灭菌蒸馏水加入斜面中，将孢子冲洗下来，用力震摇3?5min，制成孢子悬浮液，血球计 数法计算孢子浓度待用；其中，所述的菌株为保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心， 保藏号为 CGMCC NO. 8989 的蝉花虫草（φΑ/ocor办 so/w/i/era) 022007-9 号菌株； (2)、发酵培养：将孢子浓度为6 X 107的孢子悬浮液1毫升接种到250毫升的发酵培养液中， 摇床转速120rpm/min，25土 1°C条件下培养7d;其中，所述的发酵培养液的组成为：蛋白胨 5g/ L，蔗糖20g/ L，KH2P04 lg/ L，MgS04*7H20 0.5g/ L，溶剂为蒸馏水；（3)、发酵液的处 理：经过步骤（2)发酵的发酵液经双层纱布过滤除菌丝后，在4°C下，12 000 rpm / min离 心30 min除去发酵液中较大颗粒物质；按10 : 1体积比加入无水乙醇，64°C下旋转蒸发浓 缩至50倍；按1 : 3体积比加入无水乙醇，充分搅拌后，在4°C冰箱内静置过夜沉淀多糖， 后在4°C下，12 000 rpm/min离心30min;收集上清，64°C下旋转蒸发至干后用灭菌蒸馈 水重溶；其中纱布的孔径为100目；（4)、硫酸铵盐析：将步骤（3)用灭菌蒸馏水重溶后的 样品在4°C条件下缓慢加入固体硫酸铵，边加边搅拌使硫酸铵的饱和度达到60%，搅拌半个 小时，静置过夜，后在4°C下，12 000 rpm / min离心30min;最后收集沉淀；沉淀溶于灭菌 蒸馏水中，经0. 45 μ Μ膜过滤后，保留滤过液。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中，该方法还包括：步骤（5)，将经过步骤（4)溶于灭 菌蒸馈水的沉淀分别依次进行Sephadex G-15柱层析、DEAE-Sepharose FF阴离子交换层 析和Sephadex G-50柱层析分离纯化得到所述的虫生真菌抗菌肽制品。
3. 根据权利要求2所述的方法，其中，所述的Sephadex G-15柱层析方法为：将经过 步骤（5)的硫酸铵盐析后沉淀溶于灭菌蒸馈水的lmL样品上样于2. 6X 10 cm的Sephadex G-15柱，以纯水作为流动相洗脱，流速4mL / min，检测波长为280?，收集第II个活性峰组 分并获得得样品II。
4. 根据权利要求2所述的方法，其中，所述的DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析的 步骤包括：将经过Sephadex G-15柱层析后活性峰组分II样品lmL上样于2. 6X 10 cm的 DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱，流速3 mL / min,检测波长280" ;分别以0. 05、0. 1、 0. 3、0. 5和1 mol / L NaCL，pH 6. 5的缓冲液进行洗脱，收集第1峰活性组分获得得样品 1〇
5. 根据权利要求2所述的方法，其中，所述的Sephadex G-50柱层析是将经过 DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析后活性样品1的lmL样品上样于1.6X30 cm的 5印1^(^16-50柱，以0.05 111〇1/1^似(^，？!16.5的缓冲液作为流动相洗脱，流速 0. 4mL / min,检测波长为280_，收集所示标记为G1组分。
6. 根据权利要求1-5之一获得的抗菌肽制品在医药原料，食品、果蔬防腐保鲜剂，饲料 添加剂和护肤品的用途。
【文档编号】A23B7/154GK104277099SQ201410183317
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2014年5月3日 优先权日:2014年5月3日
【发明者】党向利, 柴一秋, 厉晓腊, 刘又高, 金轶伟, 陈官菊, 潘益虎 申请人:浙江省亚热带作物研究所