专利名称：一种捕食线虫真菌菌株及制备方法
技术领域：
本发明涉及微生物技术领域，具体地说是一种捕食线虫真菌菌株及制备方法。
背景技术：
植物寄生线虫是农作物的重要病原物之一，可导致作物减产10～30％，有的甚至绝收。其中根结线虫Meloidogyne、异皮线虫Heterodera和茎线虫Ditylenchus是制约生产的3个主要线虫类群。对植物寄生线虫的防治历来以轮作、栽培措施、使用抗病品种、施用化学药剂为主。但线虫的胞囊或卵在土壤中存活时间长，给轮作、栽培措施防治带来一定困难。抗病品种常导致在一个地区连续种植单一抗性品种，由于品种选择压力的作用，使线虫的群体发生变化，最终导致品种抗性丧失。在目前的实际生产中，控制植物寄生线虫危害的主要手段是使用化学杀线剂，如涕灭威、呋喃丹、各种土壤熏蒸剂等，它们大多为剧毒农药，这些产品的残余物可保持在地下水和土壤中，对环境造成严重污染；另一方面由于许多农作物产品是作为人们直接消费的食物，其残留的药物将直接威胁着人类的健康；另外，由于这些产品对人有毒，在许多发达国家，如美国、荷兰、德国等很多化学杀线虫剂都已禁用。利用线虫的天敌来防治线虫是一种安全而有效的生物防治方法，为世界各国的植保工作者所青睐。线虫的天敌主要有真菌、细菌、病毒、捕食性线虫、螨类、涡虫、昆虫和原生动物等，其中真菌就占了75％，是自然界中重要的线虫控制因子。虽然目前有部分线虫生防真菌制剂出现，但制备工艺大多比较复杂，同时，由于土壤环境中如土壤抑菌作用等的影响，使得生防菌在土壤中的存活定殖很困难，尤其是不能产生抗逆菌体结构的生防菌。
动物寄生线虫是影响畜牧业发展的重要寄生虫之一。其中血矛线虫(Haemonchus)、食道口线虫(Oesophagostomum)、仰口线虫(Bunostomum)、奥斯特线虫(Ostertagia)，夏伯特线虫(Chabertia)和羊网尾线虫(Dictyocaulus)是主要的寄生线虫。其危害主要是引起成年家畜生产率下降、营养障碍和循环失调，以及幼年家畜的发育迟缓等。如何防治动物线虫病害已成为提高畜牧业生产的关键因素之一。目前国内外用来防治动物线虫的方法还主要立足于化学驱蠕虫药的使用上，即通过化学药物来控制线虫。而牧场是寄生线虫的重要虫源，线虫随动物进食摄入体内，一般药剂无长期杀虫作用；但长期使用可使线虫种产生抗药性；另外，药物在动物体内的残留可对人的健康造成直接或潜在的危害。因而人们开始从其它方面来寻找控制线虫的途径，而生物控制就是其中之一。其中利用捕食线虫真菌控制动物寄生线虫是一种主要的生物控制方法。虽然有的捕食线虫真菌对线虫有较高的捕食率，但由于不能抵御动物消化道的消化环境，因而不能方便地通过饲料添加、动物饲喂的方法来对环境中的寄生线虫进行控制，使其使用受到限制。
1998年，Tepljakova T V；Zelenkov V N对植物、动物寄生线虫捕食真菌生产工艺申请了专利(专利号RU2106092)。制剂首先通过节丛孢(Arthrobotrys oligospora)BKMF-3062D液体培养，然后大量提取菌丝，并按1∶2比例添加高岭土或沸石作为载体，最后过筛、干燥，制成颗粒剂使用。该专利菌株和制成的颗粒剂没有被描述能用于作为简单的饲料添加。
另外，与其它微生物活体制剂一样，杀线虫微生物制剂同样存在制剂保存期短的问题，一般在室温下存放6个月以上，其活菌数往往减少80％以上。
因此，本发明的目的是提供一种能同时用于防治植物寄生线虫和控制反刍动物肠道寄生线虫的捕食线虫真菌及其制备方法。
因此，本发明的目的之一就是使用一种来自自然的捕食线虫真菌防治植物寄生线虫，其对人及环境均无害。
本发明涉及一种可防治根结线虫属Meloidogyne、异皮线虫属Heterodera和茎线虫属Ditylenchus destructor线虫的捕食线虫真菌及其制备方法。
因此，本发明的另一目的就是使用一种来自自然的捕食线虫真菌，通过饲料添加的方法使反刍动物摄取并通过肠道排泄到环境中来控制动物寄生线虫对反刍动物的感染，其对动物、环境及人均无害。作为控制目标的线虫主要包括血矛线虫(Haemonchus)、食道口线虫(Oesophagostomum)、仰口线虫(Bunostomum)、奥斯特线虫(Ostertagid)，夏伯特线虫(Chabertia)和羊网尾线虫(Dictyocaulus)。
因此，本发明的另一目的就是提供一种能在保存1年以后，使制剂中有效微生物个体含量超过50％以上的捕食线虫真菌及其制备方法。
发明内容
有害线虫的生物防治，就是利用拮抗微生物来防止或减少有害线虫对植物和动物的为害。本发明的目的是针对目前还没有非常经济有效的用于防治有害线虫的微生物制剂，而提供一种从土壤中分离筛选培养出的特定的捕食线虫真菌，用于防治植物寄生线虫和反刍动物肠道寄生线虫，本发明还提供了该捕食线虫真菌的制备方法。
为有效地分离到捕食线虫真菌株，本发明通过用线虫作诱饵并挑取捕食线虫真菌捕食器官的方法，分离得到捕食线虫真菌BJNF-1隔指孢(Dactylella sp.)，该菌种已在中国专利局指定的微生物保藏单位，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏登记号为CGMCC No.1051。
BJNF-1隔指孢(Dactylella sp.)具有下述性质培养特征在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上，25℃，3天可形成大量三维捕食菌网，并产生分生孢子和厚垣孢子，气生菌丝发达，絮状，菌落浅褐色，6天菌落直径75mm，10天产生大量厚垣孢子。
在玉米粉琼脂培养基(CMA)上，25℃，菌落白色，菌丝匍匐，无色，菌落菌丝极为致密，菌落靠边一圈产生分生孢子和大量厚垣孢子，6天菌落直径70mm，10天产生大量厚垣孢子。
在酵母培养基上，25℃，6天菌落直径70mm，菌落正面苍白色，背面黄褐色，气生菌丝极发达，绒毡状，外缘菌丝较为稀疏，呈草帽状，能产生大量分生孢子。
在营养琼脂培养基(NA)上，25℃，6天菌落直径50mm，菌落正面菌丝不发达，稀疏，白色，背面浅褐色，产生可溶性褐色素，有少量分生孢子产生。
镜检形态新生菌丝无隔，老菌丝有隔，营养菌丝宽2.5～7.0μm。
分生孢子梗单生，直立，分隔，极少分枝，梗长250～300μm，基部宽6.5～7.5μm，顶部宽4.0～5.5μm，梗顶端着生1～数个分生孢子，孢子产生方式为全壁芽殖式，孢子梗顶端不膨大。
分生孢子拟倒棒状，近基部急变窄，似瓶颈，基部平截，无分隔或1个分隔；有分隔孢子分隔一般在中部偏下，部分孢子在分隔处缢束；部分无隔分生孢子在中部稍凹陷；大多分生孢子顶部钝圆，极少数钝尖，分生孢子大小35.0～45.0×9.0～11.0μm。
厚垣孢子在人工培养基上形成大量厚垣孢子，厚垣孢子间生或顶生，可在基内菌丝上形成，也可在三维粘性菌网上产生，厚垣孢子球形或拟球形，黄褐色，成熟厚垣孢子具表面疣突，大小为32.0～35.0×27.0～32.0μm捕食器官为不很发达三维粘性菌网，可在无线虫存在时在不同的人工培养基上大量产生，三维菌网具有很强的捕食线虫能力，在菌网初形成为菌丝状时即可捕捉线虫，在菌网上可产生厚垣孢子。
上述捕食线虫真菌按以下方法分离培养用线虫做诱饵加到接有土壤样品的琼脂培养基上，25～28℃暗培养5～8天后，将产生的捕食菌网挑至马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，培养基内含青霉素、链霉素和金霉素分别为20μg/ml、40μg/ml、30μg/ml，培养得该捕食线虫真菌。
上述捕食线虫真菌的制备方法，其特征在于该制备方法按以下步骤进行(1).试管培养采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基，将该菌接种在试管培养基上，25～30℃培养3～5天。
(2).扩大培养采用液体马铃薯葡萄糖培养基，将上述试管中培养菌接种在灌装液体培养基的锥形瓶中，于摇床上25～30℃振荡暗培养5～6天作为固体培养用种子。
(3).固体培养采用麦秸杆马铃薯葡萄糖固体培养基将干麦秸秆切成2mm长秸秆段，将麦秸秆段吸水并使饱和后沥干水；将马铃薯用适量水煮熟并使其成糊状；使干麦秸秆、马铃薯、葡萄糖，三者质量比为25∶10∶1，混合、拌均匀；121℃高压蒸汽灭菌30～60分钟，冷却至室温。按质量比固体培养基∶液体种子为50∶1的比例，将扩大培养种子接种到固体培养基上，混匀，28℃暗培养5～7天得到捕食线虫真菌固体培养物。
上述所得捕食线虫真菌固体培养物经过常温(25℃)自然干燥或35℃人工恒温干燥后的厚垣孢子含量达106个每克干重；捕食线虫真菌固体培养物经过常温(25℃)自然干燥保存3年后，其厚垣孢子存活率为15％。捕食线虫真菌固体培养物经一定工艺流程制成捕食线虫真菌制剂，用于防治植物寄生线虫和防止或减少反刍动物肠道寄生线虫对反刍动物的感染。
采用本发明的捕食线虫真菌对土壤中的植物寄生线虫根结线虫属Meloidogyne、异皮线虫属Heterodera和茎线虫属Ditylenchus destructor线虫进行防治，一方面可以利用该菌分解土壤中植物残体的纤维素、几丁质等，增加土壤中的营养成分含量，促进土壤中有机质转化；又可以改善土壤肥力，减少化肥、农药造成的环境污染；该菌能在土壤中长期存活，从而可对土壤中的线虫实行持续控制并降低防治成本。
采用本发明的捕食线虫真菌对反刍动物肠道寄生线虫，主要包括血矛线虫(Haemonchus)、食道口线虫(Oesophagostomum)、仰口线虫(Bunostomum)、奥斯特线虫(Ostertagia)，夏伯特线虫(Chabertia)和羊网尾线虫(Dictyocaulus)进行防治，通过在饲料中添加捕食线虫真菌制剂，通过动物的消化道排泄到环境中对线虫起作用；一方面使用方法简便；另外通过该菌对霉菌的抑制，可使饲料存储更加安全，减少霉菌对饲料的污染。
本发明的微生物来自耕作土壤，对植物和人畜无害，易生产、耐储存，易于产业化商品化开发，为农业可持续发展创造条件。
具体实施例方式实施例1将BJNF-1接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上，25℃暗培养3天，可形成大量三维捕食菌网，并开始产生厚垣孢子和少量的分生孢子，气生菌丝发达，絮状，菌落浅褐色，6天菌落直径可达75mm，10天后产生大量厚垣孢子，菌落变成褐色或深褐色。
实施例2将干麦秸秆切成2mm长秸秆段，将麦秸秆段吸水并使饱和后沥干水；将马铃薯用适量水煮熟并使其成糊状；使干麦秸秆、马铃薯、葡萄糖，三者质量比为25∶10∶1，混合、拌均匀；121℃高压蒸汽灭菌60分钟，冷却至室温。制成麦秸杆马铃薯葡萄糖固体培养基。
实施例3将BJNF-1接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基斜面上，25℃培养5天。将试管斜面上的培养菌体全部刮下，接种在灌装液体马铃薯葡萄糖培养基的500ml锥形瓶中，培养基装量100ml/瓶，置于摇床上25℃振荡暗培养6天作为固体扩大培养用种子。按质量比固体培养基∶液体种子为50∶1的比例，将扩大培养种子接种到麦秸杆马铃薯葡萄糖固体培养基上，充分混匀，28℃暗培养7天得到BJNF-1固体培养物。
实施例4BJNF-1固体培养物在常温(25℃)下自然风干，用振动筛分离厚垣孢子，用无菌水对厚垣孢子进行梯度稀释，用计数皿(线虫计数皿)进行厚垣孢子计数，厚垣孢子含量达106个每克干重。
实施例5BJNF-1固体培养物经过常温(25℃)下自然风干后，室温干燥保存六个月、一年、两年、三年后，分别取一定量的菌体培养物，加入定量无菌水，用振荡器将厚垣孢子洗下，梯度稀释后吸取厚垣孢子悬液，涂布于PDA平板上，25℃暗培养3天后，在体视镜下统计厚垣孢子总数和已经萌发的厚垣孢子数，计算厚垣孢子存活率。，室温干燥保存六个月后厚垣孢子存活率为98％、一年后厚垣孢子存活率为85％、两年后厚垣孢子存活率为60％、三年后其厚垣孢子存活率为15％。
权利要求
1.一种微生物，其特征在于它是一种用于植物寄生线虫和反刍动物肠道寄生线虫生物防治的捕食线虫真菌BJNF-1隔指孢(Dactylella sp.)，其保藏登记号为CGMCC No.1051。
2.按权利要求1所述的微生物的培养方法，其特征在于上述捕食线虫真菌按以下方法分离培养用线虫作诱饵加到接有土壤样品的琼脂培养基上，25～28℃暗培养5～8天后，将捕食菌网挑至马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，培养基内含青霉素、链霉素和金霉素分别为20μg/ml、40μg/ml、30μg/ml，培养得该捕食线虫真菌。
3.按权利要求1或2所述的微生物的制备方法，其特征在于该制备方法按以下步骤进行(1).试管培养采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基，将该菌接种在试管培养基上，25～30℃培养3～5天。(2).扩大培养采用液体马铃薯葡萄糖培养基，将上述试管中的培养菌接种在灌装液体培养基的锥形瓶中，于摇床上25～30℃振荡暗培养5～6天作为固体培养用种子。(3).固体培养采用麦秸杆马铃薯葡萄糖固体培养基，按质量比固体培养基∶液体种子为50∶1的比例，将扩大培养种子接种到固体培养基上，混匀，28℃暗培养5～7天得到固体培养物。
4.按权利要求3所述的麦秸杆马铃薯葡萄糖固体培养基，其特征在于将干麦秸秆切成2mm长秸秆段，将麦秸秆段吸水并使饱和后沥干水；将马铃薯用适量水煮熟并使其成糊状；使干麦秸秆、马铃薯、葡萄糖，三者质量比为25∶10∶1，混合、拌均匀；121℃高压蒸汽灭菌30分钟，冷却至室温。
5.按权利要求3所述的固体培养物，其特征在于经过常温自然干燥后的固体培养物厚垣孢子含量达106个每克干重。经过常温自然干燥后的固体培养物经过常温自然状态干燥保存3年后，其厚垣孢子存活率为15％。
6.按权利要求1所述的植物寄生线虫，其特征在于主要包括根结线虫属Meloidogyne、异皮线虫属Heterodera和茎线虫属Ditylenchus destructor线虫。
7.按权利要求1所述的反刍动物肠道寄生线虫，其特征在于主要包括血矛线虫(Haemonchus)、食道口线虫(Oesophagostomum)、仰口线虫(Bunostomum)、奥斯特线虫(Ostertagia)，夏伯特线虫(Chabertia)和羊网尾线虫(Dictyocaulus)。
8.按权利要求1所述的微生物的应用，其特征在于将捕食线虫真菌用于防治植物寄生线虫和反刍动物肠道寄生线虫。
全文摘要
一种捕食线虫真菌菌株及制备方法，本发明提供了一种用于植物寄生线虫和反刍动物肠道寄生线虫生物防治的捕食线虫真菌隔指孢(Dactylella sp.)，其保藏登记号为CGMCC No.1051。利用该捕食线虫真菌在一定条件下进行培养，并用其制备捕食线虫真菌制剂。用于防治植物寄生线虫和控制反刍动物肠道寄生线虫。利用该菌分解土壤中植物残体纤维素、几丁质等，增加土壤营养成分，减少化肥、农药造成的污染。如果在饲料中添加该制剂，通过该菌对霉菌的抑制，可减少霉菌对存储饲料的污染。本发明的微生物来自耕作土壤，对植物和人畜无害，易生产、耐储存，易于产业化商品化开发，为农业可持续发展创造条件。
文档编号C12N1/14GK1775942SQ20041009081
公开日2006年5月24日 申请日期2004年11月15日 优先权日2004年11月15日
发明者缪作清, 刘杏忠, 李世东, 郭荣君, 张拥华, 孙漫红 申请人:中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所