一种利用氨基酸诱导捕食线虫真菌产生捕食器官的方法
【专利摘要】本发明涉及一种利用氨基酸诱导捕食线虫真菌产生捕食器官的方法，属于应用微生物学领域。本发明方法包括氨基酸溶液配制、捕食线虫真菌培养和孢子收集、氨基酸溶液浸泡孢子和捕食器官诱导步骤。其中：a.氨基酸溶液的配制中所用氨基酸为缬氨酸、亮氨酸或谷氨酸；b.捕食器官的诱导步骤中采用捕食线虫真菌的分生孢子，并通过氨基酸溶液进行浸泡的方式进行捕食器官的诱导。本发明的优点在于：通过培养和收集捕食线虫真菌的孢子，利用缬氨酸、亮氨酸或谷氨酸溶液进行侵泡，能够诱导捕食线虫真菌产生大量的捕食器官。本发明方法操作简单，重复性好，能够获得大量的捕食器官，为进一步研究捕食线虫真菌捕食器官形成的分子机制提供了良好的实验材料。
【专利说明】一种利用氨基酸诱导捕食线虫真菌产生捕食器官的方法
【技术领域】:
[0001]本发明涉及一种利用氨基酸诱导捕食线虫真菌产生捕食器官的方法，属于应用微生物学领域。
【背景技术】:
[0002]植物寄生线虫是植物的重要病害之一，全球每年由于植物寄生线虫所引起的农作物经济损失高达1570亿美元(Abad et al.，2008)。在我国，线虫危害烟草、花卉、蔬菜、棉花、大豆、花生、小麦、水稻、林木和中药材等几乎所有的经济作物，成为农业生产中重要的限制因子之一。目前对植物线虫病害的防治仍然以化学防治为主，但由于化学农药对生态环境的影响以及寄生线虫抗药性的增加，使其应用逐步受到限制，因此采用线虫天敌进行生物防治日益受到研究人员的关注(刘杏忠等，2004 ;杨晓野等，2004 ；Moosavi andZare, 2012)。
[0003]捕食线虫真菌(Nematode-trapping fungi)是线虫的重要天敌之一，对于自然界中线虫种群数量的控制具有重要的调节作用。捕食线虫真菌根据形态学特征分为节丛抱属(Arthrobotrys spp.)、单顶抱属(Monacrosporium spp.)和隔指抱属(Dactylella spp.)(张克勤等，2006)。这一类特殊类群真菌的营养菌丝能够特化形成粘性菌网、粘球和收缩环等捕食器官，完成对植物寄生线虫的捕捉和侵染过程(张克勤等，2006 ；Yang et al.，2012)。因此，捕食线虫真菌是开发高效线虫生防制剂的重要资源(Nordbring-Hertz, 2004 ；Moosavi and Zare, 2012)。捕食器官是真菌捕捉和侵染线虫的重要武器，捕食器官形成的数量与真菌的捕食效率密切相关。目前，部分捕食线虫真菌已经被开发成为生防制剂用于植物寄生线虫的生物防治(刘杏忠等，2004)，但是由于土壤抑菌作用等抑制了真菌孢子的萌发和捕食器官的形成，现有的线虫生防制剂存在防效不高和防效不稳的现象，严重的限制了线虫生防制剂的推广和应用。因此，阐明捕食器官形成的分子机制对于高效生防制剂的开发具有十分重要的意义。
[0004]捕食器官的形成是捕食线虫真菌侵染线虫的必要条件之一，在实验室培养条件下，大多数捕食线虫真菌的捕食器官能通过线虫诱导产生，同时也能通过线虫提取液、线虫激素和小肽等诱导产生(Yang et al.，2011 ；Hsueh et al.，2013)。尽管前期有人报道氨基酸能够诱导捕食线虫真菌寡孢节丛孢(Arthrobotrys oligospora)产生捕食器官(Frimanet al.，1985 ;王瑞等，2008)，但他们主要是通过在培养基中添加氨基酸进行诱导，每个平板中捕食器官形成的数量不到350个，而本发明的方法是利用合适浓度的氨基酸溶液浸泡捕食线虫真菌的孢子，并把孢子涂布于水琼脂平板，每个平板产生的捕食器官数量最多能够达到1600个以上。
[0005]经文献检索，未发现与本
【发明内容】
相同文献的公开报道。
【发明内容】
:
[0006] 本发明的目的是克服现有技术之不足，而提供一种利用氨基酸诱导捕食线虫真菌产生捕食器官的方法，迅速获得大量的捕食器官，为进一步研究捕食器官形成的分子机制提供了良好的实验材料，同时也为高效线虫生防制剂的开发奠定基础。
[0007]本发明涉及的氨基酸(缬氨酸、亮氨酸和谷氨酸)为实验室常规实验用品，能从国内外市场购买得到。本发明涉及的捕食线虫真菌，如寡孢节丛孢(Arthrobotrysoligospora)和环捕节丛孢(Arthrobotrys brochopaga)为常规实验用真菌,能从国内外的微生物保藏机构购买得到。
[0008]本发明在常规方法基础上改进而成。本发明实现的步骤如下:
[0009]1.氨基酸溶液的配制
[0010]I)实验用品:灭菌去离子水、灭菌三角瓶、烧杯、0.22 μ m的滤膜、无菌医用注射器、及磁力搅拌器。
[0011]2)配制方法:准确称 取0.5g氨基酸(缬氨酸、亮氨酸或谷氨酸)，放入烧杯中；用量筒准确量取IOOmL灭菌去离子水，倒入上述烧杯中，磁力搅拌使氨基酸充分溶解；用0.22 μ m的无菌滤膜对上述氨基酸溶液进行过滤除菌，滤液装入事先灭菌的三角瓶中，于4°C冰箱中保存备用；用时稀释得到不同终浓度(0.005，0.05和0.lg/L)的氨基酸溶液。
[0012]2.诱导培养基的配制
[0013]水琼脂培养基:用于氨基酸诱导捕食线虫真菌产生捕食器官。每1000mL去离子水，加入20g琼脂，121°C灭菌20分钟。
[0014]3.捕食线虫真菌的培养(以捕食线虫真菌的模式菌株寡孢节丛孢A.0ligospora为例)
[0015]I)培养基:PDA培养基和CMA培养基的组成和配制方法如下:
[0016]PDA培养基:去皮马铃薯200g，切块、煮沸30分钟，6层纱布过滤收集上清液，加入葡萄糖20g，加水补充体积到1000mL，121°C灭菌20分钟。
[0017]CMA培养基:称取20g玉米粉，加入1000mL去离子水，煮沸(100°C ) 20分钟，用6层纱布过滤收集液体，加入20g琼脂，121°C灭菌20分钟。
[0018]2)寡孢节丛孢的活化和孢子培养:保存的寡孢节丛孢菌种在PDA培养基上进行活化。按上述方法配制CMA培养基，然后分装到250mL三角瓶中(40mL/瓶)，用纱布外加报纸封口，121°C灭菌20分钟。灭菌的培养基室温放置2天，让残留在瓶壁和培养基表面的水分尽量散失。无菌条件下，用打孔器取相同大小的寡孢节丛孢菌块接种于上述CMA固体培养基上，28°C恒温培养箱内培养14天，以得到大量的孢子。
[0019]4.捕食线虫真菌孢子的收集(以寡孢节丛孢A.0ligospora为例)
[0020]I)实验用品:灭菌去离子水、灭菌玻璃珠、及灭菌漏斗(4层擦镜纸)。
[0021]2)操作步骤:为了不影响后续的诱导实验，在收集过程中要避免孢子萌发，所以整个过程要在冰上操作。
[0022]①往培养寡孢节丛孢孢子的三角瓶中加入灭菌去离子水(8mL/瓶)，然后加入6-8个灭菌玻璃珠(直径0.3-0.4cm)，振荡2-3min ；
[0023]②用移液器将三角瓶中的液体转移至装有无菌擦镜纸的漏斗内过滤；
[0024]③向上述三角瓶中再次加入8mL灭菌去离子水，用相同方法重洗一次孢子，液体转移至同一漏斗内过滤；
[0025]④将滤液转移至另一装有无菌擦镜纸的漏斗内再次过滤；[0026]⑤将第④步获得的滤液用移液器转移到Eppendorf管中，12000rpm/min,离心2min ；
[0027]⑥孢子悬液的浓缩:每250mL三角瓶中培养的孢子，得到的孢子悬液最终浓缩至lmL，然后用血球计数板观察计数，计算孢子的浓度。
[0028]5.捕食线虫真菌捕食器官的诱导(以寡孢节丛孢A.0ligospora为例)
[0029]I)水琼脂平板:为了便于后续观察捕食器官的形成，水琼脂板不宜倒的太厚，每个平板(直径为9cm)的培养基体积为15-16mL。
[0030]2)将寡孢节丛孢孢子悬液的浓度调到大约10，000个/mL，取ImL孢子悬液于Eppendorf 管中，12000rpm/min,离心 2min ；
[0031]3)小心吸去上清，实验组往沉淀中加入360 μ L配好的氨基酸溶液，同时以生理盐水和无菌去离子水作为对照组，分别取等量加入孢子沉淀中，然后用移液器反复吹打，使孢子均匀悬浮；
[0032]4)将上述装有孢子悬液的Eppendorf管冰浴20min ；
[0033]5)冰浴后的孢子悬液用移液器吹打均匀，然后加到事先倒好的水琼脂平板上，120 μ L/皿，每个样品3个平行，之后用灭菌的涂布棒将平板上的孢子悬液涂布均匀，最后将平板于28°C恒温培养箱内培养6天，实验组有大量的捕食器官(三维菌网)产生，观察拍照并统计捕食器官的数量。
[0034]与以往的报道相比，本发明有以下几个特点:
[0035]I)特定氨基酸能够有效诱导捕食线虫真菌产生大量的捕食器官(最多可达到1600个/平皿，图1)；
[0036]2)传统方法大多采用真菌菌丝体进行诱导，而本发明采用捕食线虫真菌的分生孢子进行诱导；
[0037]3)特定氨基酸诱导捕食线虫真菌产生捕食器官的方法具有简单易行、重复性好和可控性强的特点。
[0038]4)氨基酸是单一化合物，诱导真菌产生捕食器官的同时不会像线虫或线虫提取物一样激活其他的生物学途径，为进一步研究捕食线虫真菌捕食器官形成的分子机制提供了良好的实验材料。
【专利附图】
【附图说明】:
[0039]图1为缬氨酸(Val)诱导捕食线虫真菌寡孢节丛孢产生捕食器官。
[0040]图2为缬氨酸(Val)诱导捕食线虫真菌环捕节丛孢产生捕食器官。
[0041]图3为亮氨酸(Leu)诱导捕食线虫真菌寡孢节丛孢产生捕食器官。
[0042]图4为亮氨酸(Leu)诱导捕食线虫真菌环捕节丛孢产生捕食器官。
[0043]图5为谷氨酸(Glu)诱导捕食线虫真菌寡孢节丛孢产生捕食器官。
[0044]图6为谷氨酸(Glu)诱导捕食线虫真菌环捕节丛孢产生捕食器官。
【具体实施方式】:
[0045]以下是本发明的实施例，但本发明的内容并不局限于此。本发明的实施例所用方法同
【发明内容】
部分所描述的方法。[0046]实施例一:缬氨酸(Val)诱导捕食线虫真菌寡孢节丛孢产生捕食器官
[0047]按照
【发明内容】
部分所描述的方法配制CMA培养基，然后分装到250mL三角瓶中(40mL/瓶)，用纱布外加报纸封口，121°C灭菌20分钟。灭菌的培养基室温放置2天，让残留在瓶壁和培养基表面的水分尽量散失。无菌条件下，用打孔器取相同大小的寡孢节丛孢菌块接种于上述CMA固体培养基上，28°C恒温培养箱内培养14天，以得到大量的孢子。
[0048]按照
【发明内容】
部分所描述孢子的收集方法，收集寡孢节丛孢的孢子，将孢子悬液的浓度调到大约10，000个/mL，然后按所描述的方法用不同浓度的缬氨酸溶液(0.005，0.05和0.lg/L)重新悬浮孢子，同时以生理盐水和无菌去离子水作为对照，冰浴后的孢子悬液混匀后加入到事先倒好的水琼脂平板上，120 μ L/皿，用灭菌的涂布棒将平板上的孢子悬液涂布均匀，最后将平皿静置于28°C恒温培养箱内培养6天，实验组有大量的捕食器官(三维菌网)产生(图1)。
[0049]实施例二:缬氨酸(Val)诱导捕食线虫真菌环捕节丛孢产生捕食器官
[0050]按照
【发明内容】
部分所描述的方法配制CMA培养基，然后分装到250mL三角瓶中(40mL/瓶)，用纱布外加报纸封口，121°C灭菌20分钟。灭菌的培养基室温放置2天，让残留在瓶壁和培养基表面的水分尽量散失。无菌条件下，用打孔器取相同大小的环捕节丛孢菌块接种于上述CMA固体培养基上，28°C恒温培养箱内培养14天，以得到大量的孢子。
[0051]按照
【发明内容】
部分所描述孢子的收集方法，收集环捕节丛孢的孢子，将孢子悬液的浓度调到大约10，000个/mL，然后按所描述的方法用不同浓度的缬氨酸溶液(0.005，0.05和0.lg/L)重新悬浮孢子，同时以生理盐水和无菌去离子水作为对照，冰浴后的孢子悬液混匀后加入到事先倒好的水琼脂平板上，120 μ L/皿，用灭菌的涂布棒将平板上的孢子悬液涂布均匀，最后将平皿静置于28°C恒温培养箱内培养6天，实验组有大量的捕食器官(收缩环)产生(图2)。
[0052]实施例三:亮氨酸(Leu)诱导捕食线虫真菌寡孢节丛孢产生捕食器官
[0053]按照
【发明内容】
部分所描述的方法配制CMA培养基，然后分装到250mL三角瓶中(40mL/瓶)，用纱布外加报纸封口，121°C灭菌20分钟。灭菌的培养基室温放置2天，让残留在瓶壁和培养基表面的水分尽量散失。无菌条件下，用打孔器取相同大小的寡孢节丛孢菌块接种于上述CMA固体培养基上，28°C恒温培养箱内培养14天，以得到大量的孢子。
[0054]按照
【发明内容】
部分所所描述孢子的收集方法，收集寡孢节丛孢的孢子，将孢子悬液的浓度调到大约10，000个/mL，然后按所描述的方法用不同浓度的亮氨酸溶液(0.005，0.05和0.lg/L)重新悬浮孢子，同时以生理盐水和无菌去离子水作为对照，冰浴后的孢子悬液混匀后加入到事先倒好的水琼脂平板上，120 μ L/皿，用灭菌的涂布棒将平板上的孢子悬液涂布均匀，最后将平皿静置于28°C恒温培养箱内培养6天，实验组有大量的捕食器官(三维菌网)产生(图3)。
[0055]实施例四:亮氨酸(Leu)诱导捕食线虫真菌环捕节丛孢产生捕食器官
[0056] 按照
【发明内容】
部分所描述的方法配制CMA培养基，然后分装到250mL三角瓶中(40mL/瓶)，用纱布外加报纸封口，121°C灭菌20分钟。灭菌的培养基室温放置2天，让残留在瓶壁和培养基表面的水分尽量散失。无菌条件下，用打孔器取相同大小的环捕节丛孢菌块接种于上述CMA固体培养基上，28°C恒温培养箱内培养14天，以得到大量的孢子。
[0057]按照
【发明内容】
部分所描述孢子的收集方法，收集环捕节丛孢的孢子，将孢子悬液的浓度调到大约10，OOO个/mL，然后按所描述的方法用不同浓度的亮氨酸溶液(0.005，0.05和0.lg/L)重新悬浮孢子，同时以生理盐水和无菌去离子水作为对照，冰浴后的孢子悬液混匀后加入到事先倒好的水琼脂平板上，120 μ L/皿，用灭菌的涂布棒将平板上的孢子悬液涂布均匀，最后将平皿静置于28°C恒温培养箱内培养6天，实验组有大量的捕食器官(收缩环)产生(图4)。
[0058]实施例五:谷氨酸(Glu)诱导捕食线虫真菌寡孢节丛孢产生捕食器官
[0059]按照
【发明内容】
部分所描述的方法配制CMA培养基，然后分装到250mL三角瓶中(40mL/瓶)，用纱布外加报纸封口，121°C灭菌20分钟。灭菌的培养基室温放置2天，让残留在瓶壁和培养基表面的水分尽量散失。无菌条件下，用打孔器取相同大小的寡孢节丛孢菌块接种于上述CMA固体培养基上，28°C恒温培养箱内培养14天，以得到大量的孢子。
[0060]按照
【发明内容】
部分所所描述孢子的收集方法，收集寡孢节丛孢的孢子，将孢子悬液的浓度调到大约10，000个/mL，然后按所描述的方法用不同浓度的谷氨酸溶液(0.005，
0.05和0.lg/L)重新悬浮孢子，同时以生理盐水和无菌去离子水作为对照，冰浴后的孢子悬液混匀后加入到事先倒好的水琼脂平板上，120 μ L/皿，用灭菌的涂布棒将平板上的孢子悬液涂布均匀，最后将平皿静置于28°C恒温培养箱内培养6天，实验组有大量的捕食器官(三维菌网)产生(图5)。
[0061]实施例六:谷氨酸(Glu)诱导捕食线虫真菌环捕节丛孢产生捕食器官
[0062]按照
【发明内容】
部分所描述的方法配制CMA培养基，然后分装到250mL三角瓶中(40mL/瓶)，用纱布外加报纸封口，121°C灭菌20分钟。灭菌的培养基室温放置2天，让残留在瓶壁和培养基表面的水分尽量散失。无菌条件下，用打孔器取相同大小的环捕节丛孢菌块接种于上述CMA固体培养基上，28°C恒温培养箱内培养14天，以得到大量的孢子。
[0063]按照
【发明内容】
部分所描述孢子的收集方法，收集环捕节丛孢的孢子，将孢子悬液的浓度调到大约10，000个/mL，然后按所描述的方法用不同浓度的谷氨酸溶液(0.005，
0.05和0.lg/L)重新悬浮孢子，同时以生理盐水和无菌去离子水作为对照，冰浴后的孢子悬液混匀后加入到事先倒好的水琼脂平板上，120 μ L/皿，用灭菌的涂布棒将平板上的孢子悬液涂布均匀，最后将平皿静置于28°C恒温培养箱内培养6天，实验组有大量的捕食器官(收缩环)产生(图6)。
【权利要求】
1.一种利用氨基酸诱导捕食线虫真菌产生捕食器官的方法，包括氨基酸溶液配制、捕食线虫真菌培养和孢子收集、氨基酸溶液浸泡孢子和捕食器官诱导步骤；其特征在于:a.氨基酸溶液的配制中所用氨基酸为缬氨酸、亮氨酸或谷氨酸；b.捕食器官的诱导步骤中采用捕食线虫真菌的分生孢子，并通过氨基酸溶液进行浸泡的方式进行捕食器官的诱导。
【文档编号】A01P5/00GK104004668SQ201410271485
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年6月18日 优先权日:2014年6月18日
【发明者】杨金奎, 苏浩, 赵勇, 张克勤 申请人:云南大学