专利名称：：一种制备视网膜神经节样前体细胞的方法
技术领域：
：本发明涉及细胞分化，具体涉及一种制备视网膜神经节样前体细胞的方法。
背景技术：
：哺乳动物的视网膜神经节细胞损伤后难以再生，临床上，多种眼科疾病，包括青光眼、缺血性视神经病变等均可引起视网膜神经节细胞损伤，最终导致不可逆性眼盲。干细胞替代治疗的研究为治疗此类疾病带来了新的希望。视网膜祌经前体/祖细胞(RPCs)属于发育不成熟的视网膜细胞，体外实验和动物实验表明，将其移植到受体视网膜后，其能够在视网膜内整合并分化为成熟的视网膜神经细胞，使受体动物的视功能得以明显恢复。研究发现，对某一特定类型的视网膜神经细胞(如视杆细胞)缺失，其相应的前体细胞有更好的替代治疗效果。尽管视网膜神经前体细胞展现出良好的治疗潜能，但由于自体或异体来源的视网膜神经前体细胞非常有限，使得相应的临床研究和应用难以展丌。目前，已有研究将小鼠和人的胚胎干细胞诱导分化为视网膜神经前体细胞，使获得大量的视网膜神经前体细胞成为可能，然而，异体来源的胚胎干细胞存在免疫排斥反应、成瘤性及伦理学限制等问题，限制了其临床应用。骨髓间充质干细胞(BMSCs)取材方便，容易扩增，具有多向分化潜能，诱导分化后可进行自体移植，从而可避免免疫排斥反应和伦理学问题。将骨髓间充质千细胞诱导分化为视网膜神经节样前体细胞，能为青光眼、缺rfn.性视神经病变等视网膜祌经节细胞相关疾病提供种子细胞，为下一步的细胞移植治疗打下基础。诱导骨髓间充质干细胞分化的方法很多，包括生长因子诱导、化学物质诱导、转基因诱导及共培养诱导等。本发明采用了与孕龄13—14天的小鼠视网膜神经前体细胞共培养的诱导方法，之所以选择孕13—14天，是因为这个时期，小鼠视网膜神经节细胞发育快，视网膜微环境有利于视网胰神经节细胞的产生。此诱导方案目前未见报道。
发明内容本发明的目的是提供一种制备视网膜神经节样前体细胞的方法。解决上述技术问题的技术方案如下一种制备视网膜神经节样前体细胞的方法，主要包括以下步骤1.用含体积百分比为8%—12%的胎牛血清和0.8-1.2%GlutaMAX的DMEM/F12生长液，培养野生型小鼠及EGFP转基因小鼠的骨髓间充质干细胞；2.取孕龄13—14天的小鼠，分离出神经视网膜组织，TrypLEExpress消化后，用无血清神经生长液进行视网膜神经前体细胞的原代培养；3.用Tmnswell分层共培养体系，将步骤(1)中培养的第3-5代的骨髓间充质干细胞与步骤(2)所述新鲜取材的视网膜神经前体细胞进行非接触分层共培养，骨髓间充质干细胞与视网膜神经前体细胞的细胞个数比例为1:15—25,培养液采用无血清的神经牛长液；培养3-21天后，取骨髓间充质干细胞，检测其基因表达，得到视网膜神经节样前体细胞；和/或4.将步骤(1)屮培养的小鼠骨髓间充质干细胞，与步骤(2)所述新鲜取材的视网膜神经前体细胞进行混合，细胞个数混合比例为1:15—25，离心去上清后，用无血清神经生长液进行混合共培养，培养6-7d后，用免疫荧光对骨髓间充质干细胞进行蛋白表达检测，得到视网膜神经节样前体细胞。优选地，步骤(2)中，小鼠的孕龄为13.5天；步骤(3)和步骤(4)中，骨髓间充质干细胞与视网膜神经前体细胞共培养的细胞个数比例为1:20。神经细胞生长液的组成包括以画EM/F12为基础培养基，再加入终浓度为20ng/ml的EGF，终浓度为20ng/ral的bFGF，体积百分比为1%的N2Supplement,体积白'分比为2%的B27Supplement及体积百分比为1%的GlutaMAX。为诱导骨髓间充质干细胞分化为视网膜神经节样前体细胞，本发明采取了将骨髓间充质干细胞与新鲜取材的孕龄13—14天(特别是13.5天)的小鼠视网膜神经前体细胞进行共培养的诱导方法。该方法简单、易行，诱导效率高，不需转入外源基因，具有安全、实用的优点。图1为传代培养的野生型小鼠骨髓间充质干细胞(A)和EGFP转基因小鼠的骨髓间充质干细胞(B);图2为原代培养的孕13.5天小鼠视网膜神经前体细胞(A)及其基因表达情况(B);图3为野生型骨髓间充质干细胞与视网膜神经前体细胞(孕龄13.5天)分层共培养示意图；图4为与视网膜神经前体细胞分层共培养前后，骨髓间充质干细胞的形态及基因表达情况；其中图4B是与视M膜神经前体细胞分层共培养3天后，骨髓间充质干细胞的形态变化，图4A和4C分别是分层共培养前(A)后(C)，骨髓间充质干细胞的基因表达情况；图5为EGFP转基因小鼠的骨髓间充质干细胞与视网膜神经前体细胞(孕龄13.5大)混合共培养示意图；图6为与视网膜神经前体细胞混合共培养后，骨髓间充质干细胞(来自EGFP转基因小鼠)表达Pax6(A)和Brn3b(B)的情况。具体实施例方式实施例1所用实验动物(1)野生型C57BL/6小鼠SPF级，由中山大学实验动物中心提供。(2)C57BL/6-EGFP转基因小鼠品系C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)C14-Y01-FM1310sb，SPF级，由南京大学模式动物研究所提供。(3)昆明小鼠SPF级，由中山大学实验动物中心提供。骨髓间充质干细胞生长液和神经细胞生长液骨髓间充质干细胞生长液用于培养骨髓间充质干细胞，其组成成分包括DMEM/F12(Gibco)，体积百分比为10%的胎牛血清，体积百分比为1%的GlutaMAX〔Gibco)。神经细胞生长液用于视网膜神经前体细胞的培养；骨髓间充质干细胞和视网膜神经前体细胞的分层及混合共培养。神经细胞生长液的组成包括以DMEM/F12为基础培养液，添加了表皮生长因子(EGF)终浓度为20ng/ml(Invitrogen)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)终浓度20ng/ml(RDsystem),体积百分比为1%的N2Supplement(Gibco)，体积百分比为2%的B27Su卯lement(Gibc。)及体积百分比为1%的GlutaMAX(Gibco)。(一)骨髓间充质干细胞的取材培养(1)取4-6周的野生型C57/BL6或EGFP转基因雄性小鼠，颈椎脱臼处死，放入75%乙醇中消毒3-5min;(2)在解剖盘中剪取双侧胫骨和股骨；(3)用PBS洗三遍，换用小型止血钳和眼科剪，分离去掉骨头上的肌肉和肌腱，PBS再洗一次；(4)用手术剪从股骨或胫骨中间剪断，用lml注射器吸取骨髓间充质干细胞生长液，从骨断端冲洗骨髓腔1-2遍；(5)分别用5ml和lmi注射器反复吹打洗下的液体；(6)将洗液移入到25cra2培养瓶中，加入骨髓间充质干细胞生长液，置于37'C培养箱中培养。(7)以后每3d换一次液，待细胞长至70-80%融合时进行传代。传代培养的野生型(图1A)及EGFP转基因小鼠(图1B)的骨髓间充质干细胞均呈梭形，形态均一。本发明用第3-5代的细胞进行下述研究。(二)视网膜神经前体细胞的取材培养及鉴定取6周以上性成熟昆明母鼠，与昆明种公鼠合笼，第二天上午检栓，将阴栓阳性的母鼠分出单独词养，并将当天上午计为孕0.5天(E0.5)，依此类推，获取孕13.5d(Ei3.5d)的昆明孕鼠。视网膜神经前体细胞取材步骤①取E13.5d的孕鼠，颈椎脱臼处死后置于75%乙醇中浸泡5min，无菌条件下取出胎鼠；②在解剖显微镜下取出胎鼠眼球，从角膜缘处剪开，将角膜、晶体、虹膜等分离后，灰白色的视网膜神经层自动脱出并与色素层分开；③用移液器吸取视网膜神经组织，置于含1%FBS的PBS中；④将视网膜神经组织离心，去除PBS，加2-3mlTryp丄e37'C消化10min;⑤加入预冷的DMEM/F12生长液3ml中和Tryple，并反复吹打视网膜组织，使之成为单细胞离心1000rpmX5min，去上清；⑦加入含bFGF、EGF的神经细胞生长液，计数并调整细胞密度至2X105cells/ml，置于37'C饱和湿度的培养箱中培养，每3d添加一次bFGF和EGF。培养的视网膜神经前体细胞呈球形生长(图2A)。收集视网膜神经前体细胞，提取总RNA后，用RT-PCR检测其基因表达，结果显示(图2B)，视网膜神经前体细胞表达神经细胞相关基因Nestin，Tau，NFL，TubulinIII，NSE和GFAP，也表达视网膜发育相关基因Pax6，Rx，Brn3b，Math5和Isll，说明所培养的细胞为视网膜神经前体细胞c实验所用引物序列如下(以下所提及的RT-PCR检测其基闲表达所用引物与此相同):<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>CTTACCMCTGCACGAGCTGGA-Rx137CTTAGCCCGTCGGTTCTGGAGAAGCTGTCCAAGTACGAGACACTG-Math557GTGAGCGCGATGATGTAGCTGCGATGCGGAGAGCTTGTCTTC-Brn3b132GATGGTGGTGGTGGCTCTTACTCTTGGACATTACTCCCTCTTACA-Isletl174CTGATTACACTCCGCACATTTCMTGTCAAGATGGCCTTGGA-Nfl99TTATGCTACCCACGCTGGTGAAGGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-GAPDH143ATGGTGGTGMGACGCCAGTA(三)分层共培养及诱导效果检测分层共培养0)胰酶消化第3-5代的野生型小鼠BMSCs，中和后吹打为单细胞悬液；(2)将lXl(TBMSCs种于六孔板底部；(3)加入2.5ml含10%FBS的BMSCs生长液，培养24hs;(4)共培养当天，将六孔板中的BMSCs生长液去除，用PBS洗两次，加入无血清，含bFGF，EGF的神经生长液2.5ml;(5)新鲜取材的E13.5RPCs，吹打成单细胞悬液后，按照2.5X105cells/孔加入Transwellinsert膜上(膜孔径lum)，补充神经生长液至1.5ml;(6)将Transwellinsert置于含BMSCs的六孔板中，37'C分层共培养，每3d半量换液，并添加bFGF和EGF。骨髓间充质干细胞(BMSCs)种于培养板的底部，而视网膜神经前体细胞(RPCs)种于Transwellinsert上层，由于BMSCs和RPCs之间相隔了一层Transwell膜，两种细胞不能相互接触，但可以通过分泌的细胞因子相互影响(图3)。共培养前，骨髓间充质干细胞呈梭形，形态规则(图1);分层共培养3d后，细胞胞体变圆，发出较多神经样突起(图4B)。共培养3-21d后，取六孔板底部的BMSCs并用trizol裂解，提取总RNA，用DNAseI消化去除基因组DNA污染。用RT-PCR检测视网膜发育相关基因的表达。图4是RT-PCR的结果，共培养前野生型BMSCs和转基因小鼠来源的BMSCs-EGFP均不表达视网膜发育基因Pax6，Rx，Math5，Brn3b和Isletl，只表达早期神经元基因Nestin，TubulinIII，NSE和Tau(图4A);分层共培养3d后，BMSCs开始表达视网膜神经节细胞发育的相关基因，如Pax6，Math5和Brn3b，共培养超过3d后，这些基因的表达又显著下降(图4C)。这说明，与孕13.5d的RPCs进行非接触分层共培养，能诱导骨髓间充质干细胞向视网膜神经节样细胞分化，但诱导效果短暂。(四)混合共培养及诱导效果检测混合共培养(1)取E13.5昆明小鼠RPCs，加入神经生长液吹打成单细胞悬液，计数；(2)消化BMSCs-EGFP,用神经生长液重悬，计数细胞密度(3)将BMSCs-EGFP和RPCs悬液按照细胞的个数比l:20的比例混合，吹打均匀；(4)将混合细胞种于预先铺有琼脂糖凝胶的六孔板中，用神经生长液悬浮培养2d;(5)第3d收集悬浮的混合细胞球，将20-30个细胞球种于预先铺有多聚赖氨酸的24mmX24ram盖波片(六孔板内)上，贴壁2hs后，加入2-3ml神经生长液，连续培养6-7d;(6)4%多聚甲醛固定细胞，进行免疫荧光检测。混合共培养时不同细胞相互接触，彼此间的影响更加直接(图5)。图5中，绿色代表EGFP标记的骨髓间充质干细胞，红色代表视网膜神经前体细胞，两种细胞混合后相互接触。免疫荧光检测步骤(1)细胞爬片后，去除生长液，PBS洗2次X3rnin;(2)4%PFA室温下固定20min;(3)PBS洗3次X3min;(4)加入封闭液(含1%BSA+0.25%TritonX-100+2%胎牛血清)，室温下孵育50min;(5)甩干玻片上的封闭液，加稀释的一抗50ii1，4度过夜至少16hs;(6)PBS洗3次X5nun;(7)加入稀释的荧光二抗50u丄，37'C避光孵育60min;(8)PBS洗3次X5min;(9)加入50u1Hoechst33342(1:1000稀释)，室温下避光孵育5min:卿PBS洗2次X5min;(II)封片剂封片，荧光显微镜下以合适波长观察并拍照。阴性对照用PBS代替一抗。图6是免疫荧光实验结果，与E13.5RPCs混合共培养6-7d后，BMSCs-EGFP可以检测到Pax6(A)和Brn3b(B)的表达。图屮带绿色荧光的是BMSCs-EGFP，红色荧光分别是Pax6(A)和Brn3b(B)，蓝色荧光的是Hoechst33342标记的细胞核，其中A3为Al和A2的叠加；B4为Bl，B2和B3的叠加。结果显示，混合共培养可以诱导骨髓间充质干细胞表达Pax6和Brn3b蛋白，且在共培养7d后仍然可以检测到。说明混合共培养的诱导效果较分层共培养更加显著和持久。以上说明，与E13.5RPCs进行分层或混合共培养，均能诱导骨髓间充质干细胞表达视网膜神经节前体细胞的相关基因或蛋白，使之分化为视网膜祌经节样前体细胞。分层共培养和混合共培养诱导的优缺点比较分层共培养时两种细胞互不接触，其诱导效果较弱，持续时间短暂，但两种细胞容易分开，便于后续的研究和应用；混合共培养时两种细胞相互接触，诱导效果强而持久，但两种细胞难以分离，使得后续的研究和应用变得复杂。序列表〈110〉中山大学中山眼科中心〈120〉一种制备视网膜神经节样前体细胞的方法〈160〉24〈170〉Patentlnversion3.1〈210〉1〈211〉24212〉DNA〈213>人工序列〈400〉1gggccagcactcttagctttgata24<210〉2〈211〉21〈212〉DNA〈213>人工序列<400>2tgagccttcagggtgatccag21〈210〉3〈211〉21<212〉DNA〈213〉人工序列<400〉3accagcttacggccaacagtg21〈210〉4〈211〉20<212>DNA〈213〉人工序列〈400〉4tgtctatacgcagccaggttgttc24〈210〉5〈211>20〈212>薩〈213〉人工序列〈400〉5cctctaatccactggcacat20〈210〉6〈211〉22〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>6gagaagtctgaaggctcataas22〈210〉<211〉20〈212〉醒〈213>人工序列<400>7aggtcaatcagatcggctcg20〈210〉8〈211〉20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉8tcagggcagcaag朋3gagg20〈210〉9〈211〉18〈212〉腿<213〉人工序列<400>9cgcctttggacacctatt18<210>10〈211〉18〈212〉腿〈213〉人工序列<400>10ctttccgcacgacatcta18〈210〉11<211〉22〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉11cagcttcaccatggcaaacaac22<210〉12〈211〉24〈212〉腿<213>人工序列〈400〉12aggtatcataactccgcccattca24〈210〉13〈211〉22〈212〉腿〈213>人工序列〈400〉13cttaccaactgcacgagctgga22<210〉14<211>20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉14cttagcccgtcggttctgga20〈210〉15〈211〉25〈212〉DNA〈213>人工序列〈400〉15gaagctgtccaagtacgagacactg25<210〉16<211〉21〈212〉隐〈213〉人工序列〈400>16gtgagcgcgatgatgtagctg21〈210〉17〈211〉21<212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉17cgatgcggagagcttgtcttc〈210〉18〈211〉24〈212〉DNA<213〉人工序列〈400>18gatggtggtggtggctcttactct〈210〉19<211>21〈212〉醒〈213〉人工序列〈400〉19tggacattactccctcttaca〈210〉20〈211〉20212421<212>DNA〈213〉人工序列〈400>20ctgattacactccgcacatt20〈210>21<211〉22〈212>DNA<213>人工序列〈400>21tcaatgtcaagatggccttgga22〈210>22<211>22<212>DNA〈213〉人工序列<400>22ttatgctacccacgctggtgaa22〈210〉23〈211〉22<212〉DNA<213〉人工序列〈400〉23ggcacagtcaaggctgagaatg22〈210>24<211〉21〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>24atggtggtgaagacgccagta2权利要求1.一种制备视网膜神经节样前体细胞的方法，其特征是，主要包括以下步骤(1)用含体积百分比为8％-12％的胎牛血清和0.8-1.2％的GlutaMAX的DMEM/F12生长液，培养小鼠的骨髓间充质干细胞；(2)取孕龄13-14天的小鼠，分离出神经视网膜组织，TrypLEExpress消化后，用无血清神经生长液进行视网膜神经前体细胞原代培养；(3)用Transwell分层共培养体系，将步骤(1)中培养的第3-5代的骨髓间充质干细胞与步骤(2)新鲜取材的视网膜神经前体细胞进行非接触分层共培养，骨髓间充质干细胞与视网膜神经前体细胞的细胞个数比例为1∶15-25，培养液采用无血清的神经生长液；培养3-21天后，取骨髓间充质干细胞，检测其基因表达，得到视网膜神经节样前体细胞；和/或(4)将步骤(1)中培养的小鼠骨髓间充质干细胞，与步骤(2)新鲜取材的视网膜神经前体细胞进行混合，细胞个数比例为1∶15-25，离心去上清后，用无血清神经生长液进行混合共培养，培养6-7d后，用免疫荧光对骨髓间充质干细胞进行蛋白表达检测，得到视网膜神经节样前体细胞。2.根据权利要求1所述的制备视网膜神经节样前体细胞的方法，其特征是，步骤(3)和步骤(4)中，所述视网膜神经前体细胞来自孕龄13.5天的小鼠。3.根据权利要求1所述的制备视网膜神经节样前体细胞的方法，其特征是，步骤(3)和步骤(4)中，共培养时所述骨髓间充质干细胞与视网膜神经前体细胞的细胞个数比例为1:20。4.根据权利要求l一3任一项所述的制备视网膜神经节样前体细胞的方法'其特征是，所述神经细胞生长液的组成包括以DMEM/F12为基础培养基，再加入终浓度为20ng/ml的EGF，终浓度为20ng/ml的bFGF，体积百分比为1%的N2S叩plement，体积百分比为2%的B27Supplement及体积百分比为1%的GlutaMAX。全文摘要本发明公开了一种制备视网膜神经节样前体细胞的方法，该方法采取了骨髓间充质干细胞与孕龄13-14天的小鼠视网膜神经前体细胞进行Transwell分层共培养体系共培养和/或混合共培养，从而诱导制备视网膜神经节样前体细胞。该方法简单、易行，诱导效率高，不需转入外源基因，具有安全、实用的优点。文档编号C12N5/06GK101407787SQ20081021928公开日2009年4月15日申请日期2008年11月21日优先权日2008年11月21日发明者孙雪荣,坚葛申请人:中山大学中山眼科中心