多管藻中溴酚类化合物及其制备方法和应用的制作方法

专利名称：：多管藻中溴酚类化合物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及食品添加剂，具体地说是海洋红藻多管藻中溴酚类化合物及其制备方法和应用。
背景技术：
：自由基诱导引起的氧化反应能导致食品特别是含油食品酸败变质。不仅如此，氧化反应还能导致食品退色、褐变等，从而严重影响食品的质量，降低食品的营养价值。另一方面，自由基引发的许多氧化产物和中间产物是公认的致癌物，会严重损害有机体的生物膜、蛋白质、酶及细胞功能，直接或间接引起许多疾病如癌症、动脉粥样硬化、糖尿病、神经退行性疾病以及机体老化等的发生。目前常用的防止食用油脂和含油食品氧化变质的主要途径之一是加入抗氧化剂，以防止或者延缓包括自由基氧化在内所引起的氧化反应的发生。其中叔丁基羟基甲苯(BHT)、叔丁基羟基茴香醚(BHA)是较常用的化学合成抗氧化剂、自由基清除剂。但是随着生活水平的提高，人类对合成抗氧化剂、自由基清除剂的安全问题越来越关注，特别是研究发现BHT、BHA存在一定的毒性(如能引起肝脏扩大并有可能致癌)，天然抗氧化剂、自由基清除剂的研究受到越来越广泛的重视。
发明内容本发明的目的是提供海洋红藻多管藻中溴酚类化合物及其制备方法和应用。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为多管藻中的溴酚类化合物，结构式如(I)或(II)所示，(I)(II)其中R,为:H、Br、0H、0CH3或0CH2CH3,112为H、Br、0H、0CH3或0CH线，R3为H、Br、0H、0CH3或OCH2CH3。制备方法包括如下步骤1)将海洋红藻多管藻冲洗干净、阴干、粉碎到60-80目，然后用有机溶液浸取2-5次，合并提取液进行浓缩，得到粗提物；2)取步骤1)中所得粗提物的2-3倍体积的水加入步骤1)的粗提物中，并依次用所述加入水体积2-3倍的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取各2-4次，萃取物各自浓缩得相应的提取物，备用；3)取步骤2)中的乙酸乙酯提取物进行硅胶层析，用有机溶剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，洗脱液经薄层层析检测；所述有机溶剂为100:0-0:100梯度的氯仿-甲醇或乙酸乙酯-甲醇；4)将步骤3)中以氯仿-甲醇或乙酸乙酯-甲醇体积比35-40:1梯度洗脱下的组分进行硅胶和葡聚糖凝胶柱层析，收集洗脱液浓缩后得目标化合物(I);或将步骤3)中以氯仿-甲醇或乙酸乙酯-甲醇体积比25-30:1梯度洗脱下的组分进行硅胶和葡聚糖凝胶柱层析，收集洗脱液浓缩后得目标化合物(II)。步骤l)中的有机溶液提取液可为浓度在50-100%的乙醇或甲醇。步骤4)中硅胶层析所用的洗脱液可为40:60到0:100梯度的石油醚-丙酮石油醚-丙酮或石油醚-乙酸乙酯；葡聚糖凝胶柱层析所用的洗脱液可为甲醇或氯仿—甲醇。化合物的应用，所述化合物作为延缓、防止自由基诱导引起的食用油脂氧化变质或含油食品添加剂。本发明具有以下优点-.本发明涉及的化合物为新的溴酚类化合物，属于小分子天然有机化合物，容易制备获得；本发明涉及的溴酚类化合物具有显著的DPPH自由(cx，a-dipheny卜p—picrylhydrazyl,即，二苯代苦味酰自由基)活性，可作为食品添加剂延缓或防止食用油脂和含油食品因自由基诱导引起的氧化变质。本发明涉及的海洋红藻多管藻,戸》细faurceoh"Grev.)属于红藻门、松节藻科、多管藻属海藻，在中国主要分布于黄海海域。本发明通过对多管蒸经提取、分离获得的溴酚类天然化合物(I)、(II),经实验证明，这些化合物具有显著的DPPH自由基清除活性，在相同的浓度条件下其作用强度明显高于化学合成品BHT,可广泛应用于食用油脂或含油食品中，替代化学合成抗氧化剂、自由基清除剂，防止或延缓由自由基引起的氧化反应的发生，从而延长保质期，提高产品质量。具体实施方式-.下面结合实施实例对本发明做进一步阐述。实施例1溴酚类化合物的制备方法采集新鲜的多管藻经海水清洗，除去表面附着的沙砾及杂藻，阴凉处凉干备用。取凉干后的样品6.lKg,粉碎到60-80目后用8.5升95%的乙醇在室温下提取三次，每次三天，合并乙醇提取液，在温度40。C左右减压浓缩、回收乙醇，获得乙醇粗提物。粗提物中加入所得粗提物体积2倍的蒸馏水使之混悬于水中，依次用上述混悬粗提物的蒸馏水的2倍体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取各三次，分别浓缩后获得相应的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇提取物。将乙酸乙酯提取物(60克)进行硅胶柱层析，用氯仿—甲酵以100:0、90:1、85:1，70:1、50:1、40:1、30:1、20:1、10:1、5:1、3:1、1:1至i」0:100的梯度进行洗脱，分别收集洗脱液，再用薄层层析(TLC)检测(用三氯化铁作为显色剂)，根据Rf值来判断、合并相同或类似部分，获得36个组分。将第18组分，其Rf-O.3-0.4(200毫克)，即以氯仿-甲醇40:1梯度洗脱下的组分再进行葡聚糖凝胶SephadexLH-20柱层析，用l:l的氯仿-甲醇洗脱，洗脱液经减压浓缩获得纯化合物A(3.0毫克)，经波谱分析，化合物A的结构确定为7-溴-9，10-二氢菲-2,3,5，6-四醇，英文名为7-b画o-9，10-dihydrophenanthrene-2，3，5，6-tetrao1，即式(I)中R,、R2、113同时为H时所代表的化合物；将第20组分(2克)，即以氯仿-甲醇30:1梯度洗脱下的组分再进行硅胶柱层析和葡聚糖凝胶S印hadexLH-20柱层析分离，硅胶柱层析时用梯度在40:60到0:100的石油醚-丙酮进行洗脱，葡聚糖凝胶SephadexLH-20柱层析用100%浓度的甲醇洗脱，洗脱液经减压浓缩获得纯化合物B(2.Q亳克)，经波谱分析，化合物B的结构确定为4，6-二溴-9，10-二氢菲-2，3，5，7-四醇，英文名为4，6-dibromo-9，10-dihydrophenanthrene-2，3，5,7-tetrao1，即式(II)中R,、R2、R3同时为H时所代表的化合物。化合物A、B的结构式如下所示。化合物A、B具有以下理化和波谱特性化合物A:黄色粉末状固体，熔点147-149。C;核磁共振氢谱CHNMR,acetone-d6，500MHz)5(acetone_cf6，500MHz)6.71(1H，s，H—1)，8.01(1H，s，H-4)，6.88(1H，s，H-8)，2.63(2H,m,H-9)，2.58(2H，m，H-10);核磁共振碳谱("C画R，acetone-d6,125MHz)5131.3(s,C-la)，115.4(d，C-l)，144.9(s，C-2)，143.6(s,C-3)，116.9(d，C-4)，125.2(s，化合物A化合物B5C-4a)，122.5(s，C-5a)，144.7(s，C-5)，141.9(s，C—6)，107.8(s，C-7),122.4(d，C-8),133.0(s，C-8a),30.6(t，C-9),30.0(t，C-10);低分辨质谱EIMS/nA(%)324/322[M]+(90,100)，244(16)，242(37)，226(29)，225(15)，140(10),139(25)，115(11)，113(15)，98(30)，89(8)，84(16)，70(13)，69(10);高分辨质谱HRESIMS迈/z322.9915[M+H]+(calcdforC"H1279Br04，322.9919)。化合物B:黄色粉末状固体，熔点132-134°C;核磁共振氢谱(，HNMR,acetone-A，500MHz)5(acetone-rf6，500MHz)6.79(1H,s，H-l),6.95(1H，s，H-8),2.42，(2H，d，/=15.9,H-9),2.61(2H,m,H-10);核磁共振碳谱("CNMR,acetone-《125MHz)5113.4(d，C-l),144.3(s,C-2)，141,7(s，C-2)，110.8(s,C-4)，125.4(s,C-4a)，121.8(s，C_5a)142.8(s，C一5)，107,3(s，C-6),142.0(s，C一7)，121.8(d，C-8)，131.3(s,C-la)，133.0(s,C-8a),30.O(t,C-9),31.0(t,C-10);低分辨质谱EIMS/n/z(%)404/402/400[M]+(23/45/21)，324(40)，323(49)，322(48)，321(47)，305(96),303(100)，242(36)，214(15)，213(18),139(17);高分辨质谱HRESIMS/n/z424.8825[M+Na]+(calcdforC14H1079Br81BrNaO4，424.8823)。实施例2与实施例l不同之处在于将干燥粉碎的多管藻用浓度80%的乙醇提取4次，每次三天，合并提取液，室温下减压浓缩获得粗提物，同时乙醇回收。将粗提物悬浮于粗提物体积3倍的水中，依次用上述混悬粗提物的蒸馏水的2倍体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取三次，分别浓缩后获得相应的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇提取物。将乙酸乙酯提取物进行硅胶柱(220克，200-300目)层析，用梯度为100:O到O:100的梯度的乙酸乙酯-甲醇进行梯度洗脱，分别收集洗脱液，以薄层层析(TLC)检测(用三氯化铁作为显色剂)，根据Rf值来判断、合并相同或类似部分；将以乙酸乙酯-甲醇在40:1到30:l梯度洗脱下的洗脱液，其中Rf=0.25-0.4,再进行硅胶柱层析分离和葡聚糖凝胶SephadexLH-20柱层析，硅胶层析采用梯度在20:80到0:100的石油醚-乙酸乙酯进行洗脱；葡聚糖凝胶柱层析所用的洗脱剂为梯度为50:50的氯仿-甲酵进行洗脱，洗脱液减压浓缩后获得纯化合物，结构式如(I)或(II)所示，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>其中R,为:H、Br、0H、(03或OCH线,112为H、Br、0H、0CHs或OCH2CH3,l为H、Br、0H、0CH3或OCH2CH3。例如纯化合物C和化合物D,经波谱分析，化合物C的结构确定为4,7-二溴-9，10-二氢菲-2，3，5,6，8-戊醇，英文名为4，7-dibromo-9，10-dihydrophe謹threne-2，3，5,6,8-pentao1，即式(I)中R,为H、R2为Br、R3为OH时所代表的化合物；化合物B的结构确定为1，4，6-三溴-9,IO-二氢菲-2，3，5，7，8-戊醇，英文名为1，4，6-tribromo-9，10-dihydrophe羅threne-2，3，5，7，8-pentao1，即式(II)中R!为Br、R2为OH时所代表的化合物。化合物C、D的结构式如下所示。化合物C化合物D同时以上通式化合物均可由化合物A和B进一步衍生而成。实施例3DPPH自由基清除活性实验DPPH是一种稳定的自由基，在有机溶剂中呈紫色，在517nm附近有强吸收，加入抗氧化剂后，一部分自由基被清除，使吸收减弱，可借此来评价其抗氧化活性、自由基清除活性的强弱。这种方法操作简便，重现性好。实验方法在2mL实施例1中所得样品中加入2mLDPPH(甲醇溶液，0.16mmol/L)混合均匀后，室温暗处放置50min后，于517nm处测定其吸光度Asample。在2mL实施例1中所得样品中加入2mL甲醇溶液于517nm处测定其吸Asampleblank。2mLDPPH中加入2mL甲醇氯仿混合溶剂于517nm处测定其吸A,tral。2mL甲醇中加入2mL甲醇氯仿混合溶剂于517nm处测定其吸光'lanko自由基清除率的计算清除率％=100—(A—-A<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>将实施例l得到的样品在O.l//g/mL、0.25〃g/mL、1.0//g/mL、2.5//g/mL、5.0//g/mL、10.0//g/mL、25.0//g/mL不同浓度下分别测试，每个浓度平行测定三次，取平均值即为样品清除率，并计算ICs。值。所有测试均以BHT为标准品作为阳性对照。实验结果参见表1,数据表明上述获得的溴酚类化合物具有显著的度度A光光度DPPH清除活性，在低浓度到高浓度下溴酚类化合物的活性强度都明显高于阳性对照BHT。另外，实验表明，BHT的ICs。为83.3〃M，而溴酚类化合物A、B的I"分别为6.78和6.13//M,仅为阳性对照BHT的十二分之一或十三分之一，表明化合物A、B的的自由基清除活性显著高于阳性对照BHT。表l自由基清除活性(清除率，％)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实施例4溴酚类化合物在食用油脂抗氧化中的应用取食用油脂1千克，按照0.02%的重量比加入上述实施例1-2中得到的溴酚类化合物A或B，混合均匀，制得抗自由基氧化的食用油脂。与不含溴酚类化合物的食用油脂相比，含溴酚类化合物的食用油脂其保存期是前者的2-3倍以上。本发明所涉及的溴酚类化合物可应用于任何食用油脂中，以防止或延缓自由基引起的氧化变质，延长保质期。权利要求1.多管藻中的溴酚类化合物，其特征在于结构式如(I)或(II)所示，id="icf0001"file="A2007100137300002C1.gif"wi="77"he="46"top="45"left="63"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>其中R1为H、Br、OH、OCH3或OCH2CH3，R2为H、Br、OH、OCH3或OCH2CH3，R3为H、Br、OH、OCH3或OCH2CH3。2.—种权利要求1所述的海藻溴酚类化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤1)将海洋红藻多管藻冲洗干净、阴干、粉碎到60-80目，然后用有机溶液浸取2-5次，合并提取液进行浓缩，得到粗提物；2)取步骤1)中所得粗提物的2-3倍体积的水加入步骤1)的粗提物中，并依次用所述加入水体积2-3倍的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取各2-4次，萃取物各自浓缩得相应的提取物，备用；3)取步骤2)中的乙酸乙酯提取物进行硅胶层析，用有机溶剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，洗脱液经薄层层析检测；所述有机溶剂为100:0-0:100梯度的氯仿-甲醇或乙酸乙酯-甲醇；4)将步骤3)中以氯仿-甲醇或乙酸乙酯-甲醇体积比35-40:1梯度洗脱下的组分进行硅胶和葡聚糖凝胶柱层析，收集洗脱液浓缩后得目标化合物(I);或将步骤3)中以氯仿-甲醇或乙酸乙酯-甲醇体积比25-30:1梯度洗脱下的组分进行硅胶和葡聚糖凝胶柱层析，收集洗脱液浓缩后得目标化合物(II)。3.按权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤l)中的有机溶液提取液可为浓度在50-100%的乙醇或甲醇。4.按权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤4)中硅胶层析所用的洗脱液可为石油醚-丙酮或石油醚-乙酸乙酯；葡聚糖凝胶柱层析所用的洗脱液可为甲醇或氯仿-甲醇。5.—种权利要i1所述的海藻溴酚类化合物的应用，其特征在于所述化合物作为延缓、防止自由基诱导引起的食用油脂氧化变质或含油食品添加剂。全文摘要本发明涉及食品添加剂领域，具体地说是多管藻中溴酚类化合物及其制备方法和用途。具体是从海洋红藻多管藻中经提取、分离获得的具有清除自由基活性的溴酚类化合物，结构式(I)或(II)所示，其中R₁为H、Br、OH、OCH₃或OCH₂CH₃，R₂为H、Br、OH、OCH₃或OCH₂CH₃，R₃为H、Br、OH、OCH₃或OCH₂CH₃。具体方法为将多管藻经海水冲洗干净、除去表面附着的沙砾及杂藻，阴干、粉碎后浸取、溶剂分配和反复的层析分离，得到单体化合物。本发明所得溴酚类化合物具有显著的清除DPPH自由基活性，可作为食品添加剂延缓或防止食用油脂或含油食品因自由基诱导引起的氧化变质。其中R₁为H、Br、OH、OCH₃或OCH₂CH₃，R₂为H、Br、OH、OCH₃或OCH₂CH₃，R₃为H、Br、OH、OCH₃或OCH₂CH₃。文档编号C07C39/42GK101177383SQ200710013730公开日2008年5月14日申请日期2007年2月17日优先权日2007年2月17日发明者可李,李晓明,王斌贵申请人:中国科学院海洋研究所