专利名称：一种从猪血红细胞中提取超氧化物歧化酶sod的方法
技术领域：
本发明涉及一种超氧化物歧化酶的提取方法，特别涉及一种从猪血红细胞中提取超氧化物歧化酶SOD的方法。
背景技术：
超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,以下简称SOD)是一种能够清除机体内过量自由基的金属酶，已被发现广泛存在于人和动物体内的多种组织中。SOD具有抗衰老、 防止色素沉积、消炎和保护机体免疫功能的作用。目前已经被广泛应用于食品、保健品、化妆品和农业等方面。现有的从血细胞中提取SOD的方法在前期的取血、抗凝、生理盐水洗涤和低温溶血等步骤上大同小异。后期的杂蛋白变性大多采用氯仿和乙醇法去除血红蛋白，然后清液用丙酮沉淀，沉淀物上色谱柱(S^hadex G-100或DE-32或金属螯合层析法)，其缺点在于 (1)用氯仿和乙醇去除血红蛋白成本较高，同时氯仿还是有毒试剂，试剂残留的安全性没有保证；(2)在用氯仿乙醇法去除血红蛋白的过程中，由于SOD与血红蛋白的共沉作用，造成 SOD得率降低；C3)由于色谱柱体积的限制，纯化处理量小，设备成本投入高，不利于大规模化生产。发明目的本发明的目的在于提供一种规模化生产SOD的方法，该法工艺简单，提取的SOD纯度和安全性高、同时可以减少成本投入。
发明内容
如上构思，本发明的技术方案是一种从猪血红细胞中提取铜锌超氧化物歧化酶 SOD的方法，其特征在于依照下列步骤完成①收集新鲜健康的猪血；②将猪血进行抗凝处理；③将抗凝后的猪血进行高速离心处理得到血球液；④将血球液进行溶血破碎；血球液先经过胶体磨破碎两次，然后加入2倍体积的蒸馏水或者高纯水在0°c -4°C溶胀过夜，得到溶血液；⑤将上述溶血液通过两次热变除杂过程得到SOD粗酶液；具体方法是溶血液中先加入食品级钠盐使饱和度为4% _12%，然后分别加入铜盐和锌盐，使其浓度达到 0. 5mm0l/L-3mm0l/L，在50°C _70°C恒温设备中保温10min-30min，冷却，然后用三足式分离机分离20min-30min，取上清液，再用管式固液分离机分离，去除沉淀，收集上清液；上清液中加入铜盐和锌盐，使其浓度达到lmm0l/L-6mm0l/L，在60°C _70°C下恒温设备中保温 10min-30min，冷却，然后用三足式分离机分离20-30min，取上清液，再用管式固液分离机分离，去除沉淀，收集上清液；⑥将上述步骤⑤得到的上清液进行超滤浓缩得到浓缩液；
⑦将浓缩液进行梯度洗脱；具体方法是对浓缩液进行多级的磷酸盐缓冲液梯度洗脱，磷酸盐缓冲液的初级浓度为lmmol/L-3mm0l/L，最终浓度为50mmOl/L-70mmOl/L，每两级的浓度梯度倍数为2-5倍，上清液每级浓度梯度处理前先降温至1°C _5°C，然后加入 1-2倍的冷丙酮，迅速在2000r/min-4000r/min下冷冻离心3_10min，取沉淀，上清液用作丙酮回收；沉淀用3-15倍的磷酸盐缓冲液溶解，迅速在4000r/min-6000r/min下冷冻离心 5-15min，取上清，弃沉淀；⑧将上述步骤⑦得到的上清液装入透析袋中在0°C -4°C下流动透析24h_3^!进行透析除盐；⑨冷冻干燥将透析好的上清液冷冻干燥，即制得SOD产品。上述抗凝剂为食品级柠檬酸钠，添加量4. 0-6. Og/kg猪血。上述热变除杂过程中加入的钠盐可以是氯化钠、溴化钠、硝酸钠、硫酸钠中的一种或者几种的混合物；加入的铜盐可以是氯化铜、硫酸铜或者硝酸铜中的一种或者几种混合物；加入的锌盐可以是氯化锌、硫酸锌或者硝酸锌中的一种或者几种混合物。上述上清液超滤浓缩的具体方法是将上清液经截留分子量为6000的中空纤维膜超滤机，不断加入4°C左右高纯水，除去小分子杂蛋白和金属离子后再经浓缩得到浓缩液。上述浓缩液进行2-7级的磷酸盐缓冲液梯度洗脱。上述磷酸盐缓冲液所用的盐为磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾中的两种或者多种混合物，其PH在6. 5-8. 0之间。上述透析除盐所用的透析液前期用蒸馏水，后期可以用高纯水或者 PEG-600(V20000。发明具有如下的优点和积极效果1、本发明为了防止血液凝固和血细胞破裂进行了抗凝处理。2、本发明在细胞溶血的过程中采用了均质破碎技术，同时结合细胞低温溶胀技术，不仅最大程度上的破碎了细胞，释放了细胞内溶物，而且整个过程在低温下进行，最大程度上保留了 SOD活性。3、本发明没有采用常规的氯仿乙醇法去除血红蛋白，而是采用两次热变除杂法使血红蛋白变性的的方法，此方法中添加了铜盐和锌盐，不仅对SOD有很好的保护作用，而且提高了杂蛋白变性的几率，同时在热变的过程中添加了钠盐，钠盐在热变过程中起到盐解的作用，适当的离子强度可以最大程度的降低热变过程中的共沉作用，同时又不会因为过高的离子浓度而降低SOD活性，从而提高了 SOD产率和活性。并且，在热变除杂分离的过程中采用了两种分离机联用的方法，不仅去除了微小的变性蛋白，而且提高了生产效率，缩短了生产周期。4、本发明在后期的纯化步骤中采用了梯度洗脱的方法，而传统工艺往往需要采用层析柱法，因此本发明可以避免层析柱法过高的设备投入和层析柱产率较低的问题，这样不仅有利于工业化生产，而且提高了 SOD产率，可以创造更高的利润。同时，梯度洗脱法在后期纯化的过程中所产生的丙酮废液可以通过简单的蒸馏法回收，因此节约了成本，更加利于大规模的生产。因此，本发明所采用的梯度洗脱法操作简单，在规模化生产中更容易掌握。
具体实施例方式一种从猪血红细胞中提取铜锌超氧化物歧化酶SOD的方法，依照下列步骤完成1、收集新鲜健康的猪血；新鲜健康的猪血是指加工的动物血液全部来自定点大型屠宰场，所有的猪只必须经过国家动物检疫部门检验无疫病。2、将猪血进行抗凝处理采用的抗凝剂为食品级柠檬酸钠，添加量4. 0-6. Og/kg 猪血。3、将抗凝后的猪血通过管式离心机的高速离心得到体积为50L的血球液。管式离心机的转速为 14000r/min-16000r/min。4、将血球进行溶血破碎；血球先经过胶体磨破碎两次，然后加入2倍体积的蒸馏水或者高纯水在0°c -4°c溶胀过夜；5、在溶血液中先加入氯化钠，使其饱和度为6%，然后分别加入铜盐和锌盐，使其浓度达到lmmol/L，在65°C恒温设备中保温15min，冷却，然后用三足式分离机分离30min， 取上清，再用管式固液分离机分离，去除沉淀，收集上清液；上清液中加入铜盐和锌盐，使其浓度达到2mmol/L，在70°C恒温设备中保温15min，冷却，然后用三足式分离机分离30min， 取上清，再用管式固液分离机分离，去除沉淀，收集上清液。6、将上清液经截留分子量为6000的中空纤维膜超滤机，不断加入4°C左右高纯水，除去小分子杂蛋白和金属离子后，浓缩得到浓缩液。7、对浓缩液进行4级磷酸盐缓冲液梯度洗脱，磷酸盐缓冲液的初级浓度为 1. 5mmol/L,最终浓度为40. 5mmol/L,缓冲液pH = 7. 0。每两级的浓度梯度倍数为3倍，上清液每级浓度梯度处理前先降温至1°C，然后加入2倍体积的冷丙酮，迅速在4000r/min下离心5min，取沉淀，上清液用作丙酮回收。沉淀用6倍的磷酸盐缓冲液溶解，迅速在5000r/ min下离心lOmin，取上清，弃沉淀。8、将上清液装入透析袋中，在0°C _4°C下流动透析Mh，透析液前期用蒸馏水，后期用PEG-6000进行浓缩。9、将透析好的上清液冷冻干燥，即制得的SOD产品。
权利要求
1.一种从猪血红细胞中提取铜锌超氧化物歧化酶SOD的方法，其特征在于依照下列步骤完成①收集新鲜健康的猪血；②将猪血进行抗凝处理；③将抗凝后的猪血进行高速离心处理得到血球液；④将血球液进行溶血破碎；血球液先经过胶体磨破碎两次，然后加入2倍体积的蒸馏水或者高纯水在0°C -4°C溶胀过夜，得到溶血液；⑤将上述溶血液通过两次热变除杂过程得到SOD粗酶液；具体方法是溶血液中先加入食品级钠盐使饱和度为4% -12%，然后分别加入铜盐和锌盐，使其浓度达到0. 5mmol/ L-3mmol/L，在50°C _70°C恒温设备中保温10min-30min，冷却，然后用三足式分离机分离20min-30min，取上清液，再用管式固液分离机分离，去除沉淀，收集上清液；上清液中加入铜盐和锌盐，使其浓度达到lmm0l/L-6mm0l/L，在60°C _70°C下恒温设备中保温 10min-30min，冷却，然后用三足式分离机分离20-30min，取上清液，再用管式固液分离机分离，去除沉淀，收集上清液；⑥将上述步骤⑤得到的上清液进行超滤浓缩得到浓缩液；⑦将浓缩液进行梯度洗脱；具体方法是对浓缩液进行多级的磷酸盐缓冲液梯度洗脱，磷酸盐缓冲液的初级浓度为lmmol/L-3mm0l/L，最终浓度为50mmOl/L-70mmOl/L，每两级的浓度梯度倍数为2-5倍，上清液每级浓度梯度处理前先降温至1°C _5°C，然后加入1-2 倍的冷丙酮，迅速在2000r/min-4000r/min下冷冻离心3_10min，取沉淀，上清液用作丙酮回收；沉淀用3-15倍的磷酸盐缓冲液溶解，迅速在4000r/min-6000r/min下冷冻离心 5-15min，取上清，弃沉淀；⑧将上述步骤⑦得到的上清液装入透析袋中在0°C-4°C下流动透析24h-3^!进行透析除盐；⑨冷冻干燥将透析好的上清液冷冻干燥，即制得SOD产品。
2.根据权利要求1所述的一种从猪血红细胞中提取铜锌超氧化物歧化酶SOD的方法， 其特征在于上述抗凝剂为食品级柠檬酸钠，添加量4. 0-6. Og/kg猪血。
3.根据权利要求1所述的一种从猪血红细胞中提取铜锌超氧化物歧化酶SOD的方法， 其特征在于上述热变除杂过程中加入的钠盐可以是氯化钠、溴化钠、硝酸钠、硫酸钠中的一种或者几种的混合物；加入的铜盐可以是氯化铜、硫酸铜或者硝酸铜中的一种或者几种混合物；加入的锌盐可以是氯化锌、硫酸锌或者硝酸锌中的一种或者几种混合物。
4.根据权利要求1所述的一种从猪血红细胞中提取铜锌超氧化物歧化酶SOD的方法， 其特征在于上述上清液超滤浓缩的具体方法是将上清液经截留分子量为6000的中空纤维膜超滤机，不断加入4°C左右高纯水，除去小分子杂蛋白和金属离子后再经浓缩得到浓缩液。
5.根据权利要求1所述的一种从猪血红细胞中提取铜锌超氧化物歧化酶SOD的方法， 其特征在于上述浓缩液进行2-7级的磷酸盐缓冲液梯度洗脱。
6.根据权利要求1所述的一种从猪血红细胞中提取铜锌超氧化物歧化酶SOD的方法， 其特征在于上述磷酸盐缓冲液所用的盐为磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾中的两种或者多种混合物，其PH在6. 5-8. 0之间。
7.根据权利要求1所述的一种从猪血红细胞中提取铜锌超氧化物歧化酶SOD的方法，其特征在于上述透析除盐所用的透析液前期用蒸馏水，后期可以用高纯水或者 PEG-600(V20000。
全文摘要
一种从猪血红细胞中提取超氧化物歧化酶SOD的方法，该方法采用抗凝处理，防止血液凝固和血细胞破裂。采用胶体磨破碎和低温溶胀使血细胞内溶物最大程度的释放得到溶血液。溶血液经过两次热变除杂去血红蛋白和大量杂蛋白得到SOD粗酶液，SOD粗酶液再经过超滤浓缩、梯度洗脱、透析除盐和冷冻干燥得到SOD产品。本发明不仅操作简单，容易掌握，而且可有效提高产品质量，降低生产成本，缩短生产周期，提高生产效率，适用于工业化生产。
文档编号C12N9/08GK102181411SQ20111008166
公开日2011年9月14日 申请日期2011年4月1日 优先权日2011年4月1日
发明者夏继华, 宋古全, 张立娟, 沈峰, 王长维 申请人:黑龙江宝迪肉类食品有限公司