专利名称：监测土壤重金属和多环芳烃复合污染的方法
技术领域：
本发明涉及一种环保技术领域的土壤污染监测方法，具体是一种监测土壤重 金属和多环芳烃复合污染的方法。
背景技术：
土壤复合污染是当前进行环境保护科学研究前沿的一个热点，但同时也是研 究难点。由于复合污染的复杂性和实验手段的局限性，对污染物复合污染缺少能 进行定量表征的实验方法。近年来已相继开展了利用蚯蚓作为载体对可能造成土 壤环境污染的化学物质进行测试，并根据这些化学物质对蚯顿的毒害程度来评价 其可能对环境的危害程度。随着生物技术在细胞水平、亚细胞水平和分子水平的 发展，对污染物毒性的检测手段也随之得到了提高，流式细胞仪(FCM)是一种 在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，与传统 的荧光镜检査相比，具有高通量、速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代 最先进的细胞定量分析技术。
利用Annexin-V和PI双染色法，用流式细胞仪准确检测出蚯蚓体腔细胞成 活率及质膜的早期变化。根据Annexin-V和PI荧光燃料与PS及DNA的结合特性， 在流式细胞仪检测的散点图中可以区分出4种类型细胞A象限内的细胞为死亡 晚期细胞，Annexin-V为阴性而PI为阳性(AV—Pr); B象限内的细胞为坏死细 胞，Annexin-V和PI均为阳性(AV+—PI+)，虽然这类小质膜渗透性受到损伤， 但是质膜的完整性还是在一定程度上得到维持；C象限内的细胞为活细胞， Annexin-V和PI均为阴性(AV一PI—)，质膜的结构和功能均未发生变化；D象限 内的细胞为活细胞，但处于凋亡早期状态，Annexin-V为阳性而PI为阴性(AV+ 一PD这类处于凋亡早期的细胞虽然结构仍然保持着一定的完整性，但是质膜 结构受到了一定程度的损伤，是一定量的PS开始由质膜的内侧转移到外侧，质
膜的通透性增大，早期凋亡率可以作为污染物毒性评价的敏感指标，用于对污染
物毒性的早期预警。
经对现有技术的文献检索发现，PLYTYCZ Barbara等在《European journal
of soil biology》(欧洲土壤生物)(2007， 43: 116-120)上发表的"Flow
cytometric measurement of neutral red accumulation in earthworm
coelomocytes : Novel assay for studies on heavy metal exposure" (细
胞流式技术检测蚯躬l体腔细胞中性红积累检测重金属暴露的新方法)，该文中 提出细胞流式技术是一种快速检测无脊椎动物体腔细胞中溶酶体中性红积累情 况的方法，并依据中性红积累的量来评价环境污染状况。具体方法为重金属 Cu对不同种无脊椎动物的体腔细胞进行体外胁迫，用中性红对体腔细胞染色， 利用细胞流式技术检测无脊椎动物体腔细胞中溶酶体中性红积累情况，结果表明 无脊椎动物体腔细胞中溶酶体中性红积累的多少可作为Cu污染的生物标志物。 其不足在于该方法局限于体外细胞染毒，以中性红积累作为检测指标，实验周 期长，灵敏度较差，不能真实反映指示生物受到污染物胁迫下体腔细胞的损伤情 况，因而不适用于对土壤污染的监测和预警。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种以蚯蚓体腔细胞作为标志物 的土壤重金属和多环芳烃复合污染预警方法，使其以蚯蚓体腔细胞作为生物标志 物对土壤重金属和多环芳烃复合污染进行监测和预警，能对土壤污染检测起到很 好的警示作用。
本发明是通过以下技术方案实现的，包括以下步骤-
第一步，将指示生物染毒，按照OECD 207推荐标准方法(1984年，经济合 作与发展组织，化学品测试导则207《蚯虫引急性毒性试验》)将安德爱胜蚓 (Eisenia andrei)在土壤中染毒。
第二步，提取蚯蚓体腔细胞，用纤维针结合超声波刺激法提取蚯蚓的体腔细 胞，歩骤为①蚯蚓清肠；②将纤维针细管插入蚯蚓体腔；③用超声波仪震荡刺 激蚯蚓④细胞记数和镜检。
纤维针选用长lcm，内径为0.5mm中空的纤维针细管，所选用的超声波仪频 率为28KHz 、功率为300W，震荡刺激蚯蚓的时间为2s。第三步，收集蚯蚓体腔细胞，作为待测细胞，将提取的细胞收集到10mL的 离心管中，800Xg离心5 min，弃去上清液，用缓冲液(Annexin V-PI检测试 剂盒，美国BD公司)稀释，调整待测样品细胞数为(2 3) X105mL—、
第四步，待测细胞洗涤，加入2 yL胰蛋白酶消化5 min，然后用缓冲液 (Annexin V-PI检测试剂盒，美国BD公司)洗涤2次，800Xg离心5min。再 用缓冲液(Annexin V-PI检测试剂盒，美国BD公司)重新悬浮细胞，使细胞的 浓度为2X105 mL—、
第五步，待测细胞染色，取195n L细胞悬液，加入5 y L Ann-FITC (Annexin V-PI检测试剂盒，美国BD公司)，室温下孵化10 min。然后加入10 u L PI染 液，室温下避光孵育10 15 min。
第六步，测定细胞的成活率和早期凋亡率，用FACSCalibur型流式细胞仪检 测(Becton Dichinson， San Jose， SA， USA)，流式细胞仪氩离子激发光波长为 488 nm，光源为200 mW。用Cellquest 9. 3版(Becton Dichinson， San Jose' SA， USA)检测每个细胞的前向角散光(ESC)和侧向光角散光(SSA)。用波长为520 nm的通带滤器检测FITC荧光(FL1)，另一波长大于610 nm的滤器检测PI(FL3)。
第七步，根据细胞的成活率和早期凋亡率大小判断土壤重金属和多环芳烃复 合污染程度，蚯顿体腔细胞的成活率越低、早期凋亡率越大，说明该染毒组重金 属和多环芳烃复合污染程度越严重。
与现有技术相比，本发明的优点是首次用两种荧光色素的双染法，用细胞 流式技术分析蚯蚓体腔细胞的成活率和早期凋亡率大小判断土壤重金属和多环 芳烃复合污染程度，该方法灵敏高效、操作简便、重复性好，尤其适用于对老工 业基地中土壤重金属和多环芳烃复合污染情况的检测，对土壤中重金属和多环芳 烃复合污染有很好的预警作用。
具体实施例方式
下面结合本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提 下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不 限于下述的实施例。
实施例1 用纤维针结合超声波刺激法提取单一 Cd污染染毒的蚯蚓体腔细胞将平均 体重为300rag具有环带的健壮成体蚯蚓。清肠24小时，用浓度为0. Olmol L—1、 pH7. 2的PBS缓冲液反复冲洗干净蚯蚓，加3mL含有2. 5raM乙二醇-双-(2-氨基 乙基)四乙酸(EGTA) PBS于10mL离心管，用长lcm，内径为0. 5mra中空的纤维 针细管插入蚯蚓体腔后放入离心管。迅速用频率为28KHz 、功率为300W的超声 波仪震荡刺激蚯蚓2秒，可看到纤维针细管内液体迅速变黄色，将细胞移入50mL 离心管然后加入12mL的Hank' s液清洗三次。
将待测细胞收集到10 mL的离心管中，800Xg离心5 min，弃去上清液， 用缓冲液(Annexin V-PI检测试剂盒，美国BD公司)稀释，调整待测样品细胞 数为(2 3) X105 mL—'。
加入2 u L胰蛋白酶消化5 min，然后用缓冲液洗涤2次，800Xg离心5 min。 再用缓冲液重新悬浮细胞，使细胞的浓度为2X105 mL—、
取195y L细胞悬液，加入5 ix L Ann-FITC (Annexin V-PI检测试剂盒，美 国BD公司)，在室温下孵化10 min。然后加入10 y L PI染液，室温下避光孵 育10 15 min。
利用FACSCalibur型流式细胞仪检测(Becton Dichinson, San Jose, SA， USA)，流式细胞仪氩离子激发光波长为488 nm，光源为200 mW。用Cellquest 9. 3 版(Becton Dichinson, San Jose， SA， USA)检测每个细胞的前向角散光(ESC) 和侧向光角散光(SSA)。用一波长为520 nm的通带滤器检测FITC荧光(FL1)， 另一波长大于610 nm的滤器检测PI (FL3)。
得出单一 Cd污染下蚯蚓体腔细胞成活率和凋亡率分别为45. 11%、 12. 54%。 该结果表明土壤中重金属Cd的污染胁迫造成了蚯蚓体腔细胞的损伤，蚯蚓 体腔细胞成活率和凋亡率可定量表征土壤中重金属Cd的污染程度。
实施例2
用纤维针结合超声波刺激法提取单一 Phe污染染毒的蚯蚓体腔细胞将平均 体重为300mg具有环带的健壮成体蚯蚓。清肠24小时，用浓度为0. Olmol L—'、 pH7. 2的PBS缓冲液反复冲洗干净蚯蚓，加3mL含有2. 5mM乙二醇-双-(2-氨基 乙基)四乙酸(EGTA) PBS于10mL离心管，用长lcm，内径为0. 5腿中空的纤维 针细管插入蚯蚓体腔后放入离心管。迅速用频率为28KHz 、功率为300W的超声 波仪震荡刺激蚯蚓2秒，可看到纤维针细管内液体迅速变黄色，将细胞移入50mL 离心管然后加入12mL的Hank， s液清洗三次。
将待测细胞收集到10 mL的离心管中，800Xg离心5 min,弃去上清液， 用缓冲液(Annexin V-PI检测试剂盒，美国BD公司)稀释，调整待测样品细胞 数为(2 3) X105 mL一1。
加入2 y L胰蛋白酶消化5 min，然后用缓冲液洗涤2次，800Xg离心5 min。 再用缓冲液重新悬浮细胞，使细胞的浓度为2X105 mL—、
取195uL细胞悬液，加入5 nLAnn-FITC (Annexin V-PI检测试剂盒，美 国BD公司)，在室温下孵化10 min。然后加入10 u L PI染液，室温下避光孵 育10 15 min。
利用FACSCalibur型流式细胞仪检测(Becton Dichinson， San Jose， SA， USA)，流式细胞仪氩离子激发光波长为488 nm，光源为200 mW。用Cellquest 9. 3 版(Becton Dichinson, San Jose, SA， USA)检测每个细胞的前向角散光(ESC) 和侧向光角散光(SSA)。用一波长为520 nm的通带滤器检测FITC荧光(FLl)， 另一波长大于610 nm的滤器检测PI (FL3)。
得出单一 Phe污染下蚯蚓体腔细胞成活率和凋亡率分别为56. 33%、 10. 36%。 该结果表明土壤中重金属Phe的污染胁迫造成了蚯蚓体腔细胞的损伤，蚯蚓体腔 细胞成活率和凋亡率可定量表征土壤中重金属Phe的污染程度。
实施例3
用纤维针结合超声波刺激法提取Cd—Phe复合污染染毒的蚯蚓体腔细胞将 平均体重为300mg具有环带的健壮成体蚯蚓。清肠24小时，用浓度为O.Olmol L-'、 pH7.2的PBS缓冲液反复冲洗干净蚯蚓，加3mL含有2.5mM乙二醇-双-(2-氨基乙基)四乙酸 (EGTA) PBS于10raL离心管，用长lcm,内径为0. 5誦中空的 纤维针细管插入蚯蚓体腔后放入离心管。迅速用频率为28KHz 、功率为300W的 超声波仪震荡刺激蚯蚓2秒，可看到纤维针细管内液体迅速变黄色，将细胞移 入50mL离心管然后加入12mL的Hank' s液清洗三次。
将待测细胞收集到10 raL的离心管中，800Xg离心5 min，弃去上清液，
用缓冲液(Annexin V-PI检测试剂盒，美国BD公司)稀释，调整待测样品细胞 数为(2 3) X105 mL—、
加入2 y L胰蛋白酶消化5 min，然后用缓冲液洗涤2次，800Xg离心5 min。 再用缓冲液重新悬浮细胞，使细胞的浓度为2X105 mL—'。
取195uL细胞悬液，加入5 uLAnn-FITC (Annexin V-PI检测试剂盒，美 国BD公司)，在室温下孵化10 min。然后加入10 u L PI染液，室温下避光孵 育10 15 min。
利用FACSCalibur型流式细胞仪检测(Becton Dichinson, San Jose， SA， USA)，流式细胞仪氩离子激发光波长为488 nm，光源为200 mW。用Cellquest 9. 3 版(Becton Dichinson, San Jose, SA， USA)检测每个细胞的前向角散光(ESC) 和侧向光角散光(SSA)。用一波长为520 nm的通带滤器检测FITC荧光(FLl)， 另一波长大于610 nm的滤器检测PI (FL3)。
得出Cd—Phe复合污染下蚯顿体腔细胞成活率和凋亡率分别为35.59%、 15. 25%。该结果表明土壤中重金属Cd—Phe复合污染的污染胁迫造成了蚯蚓体腔 细胞的损伤，Cd—Phe复合污染的毒性大于单一的Cd或Phe污染。蚯蚓体腔细 胞成活率和凋亡率可定量表征土壤中重金属Cd—Phe复合污染的污染程度。
权利要求
1.一种监测土壤重金属和多环芳烃复合污染的方法，其特征在于包括以下步骤第一步，将指示生物蚯蚓染毒；第二步，提取第一步得到的蚯蚓体腔细胞；第三步，收集蚯蚓体腔细胞，作为待测细胞；第四步，对收集的待测细胞洗涤；第五步，将洗涤后的待测细胞染色；第六步，测定细胞的成活率和早期凋亡率；第七步，根据细胞的成活率和早期凋亡率大小判断土壤重金属和多环芳烃复合污染程度。
2. 根据权利要求1所述的监测土壤重金属和多环芳烃复合污染的方法，其特 征是，所述蚯蚓为安德爱胜蚓。
3. 根据权利要求1所述的监测土壤重金属和多环芳烃复合污染的方法，其特 征是，所述提取蚯蚓体腔细胞，是用纤维针结合超声波刺激法提取蚯蚓的体腔细 胞，步骤为①蚯蚓清肠；②将纤维针细管插入蚯蚓体腔；③用超声波仪震荡剌 激蚯蚓④细胞记数和镜检。
4. 根据权利要求3所述的监测土壤重金属和多环芳烃复合污染的方法，其特 征是，所述纤维针选用长lcm，内径为0.5mm中空的纤维针细管，所选用的超声 波仪频率为28KHz 、功率为300W,震荡刺激蚯蚓的时间为2s。
5. 根据权利要求1所述的监测土壤重金属和多环芳烃复合污染的方法，其特 征是，所述收集蚯蚓体腔细胞，是指将提取的细胞收集到10 mL的离心管中， 800Xg离心5min，弃去上清液，用缓冲液稀释，调整待测样品细胞数为2X 105 mL_1 3X105 raL—'。
6. 根据权利要求1所述的监测土壤重金属和多环芳烃复合污染的方法，其 特征是，所述待测细胞洗涤，是指加入2 yL胰蛋白酶消化5 min，然后用缓 冲液洗涤2次，800Xg离心5min，再用缓冲液重新悬浮细胞，使细胞的浓度为 2X105 mL—、
7. 根据权利要求1所述的监测土壤重金属和多环芳烃复合污染的方法，其特 征是，所述待测细胞染色，是指取195μL细胞悬液，加入5 iiLAnn-FITC， 室温下孵化IO min，然后加入IO μL PI染液，室温下避光孵育10 15 min。
8. 根据权利要求1所述的监测土壤重金属和多环芳烃复合污染的方法，其特 征是，所述测定细胞的成活率和早期凋亡率，是指用FACSCalibur型流式细胞 仪检测，流式细胞仪氩离子激发光波长为488 nm，光源为200 mW，用Cellquest 9.3版检测每个细胞的前向角散光和侧向光角散光，用波长为520 nm的通带滤 器检测FITC荧光，另一波长大于610 nm的滤器检测PI。
9. 根据权利要求1所述的监测土壤重金属和多环芳烃复合污染的方法，其特 征是，所述根据蚯蚓体腔细胞的成活率和早期凋亡率大小判断土壤重金属和多环 芳经复合污染程度，其中蚯蚓体腔细胞的成活率越低、早期凋亡率越大，说明该 染毒组重金属和多环芳烃复合污染程度越严重。
全文摘要
本发明涉及一种环保技术领域的监测土壤重金属和多环芳烃复合污染的方法。步骤为第一步，指示生物染毒。第二步，蚯蚓体腔细胞提取。第三步，待测细胞收集。第四步，待测细胞洗涤。第五步，待测细胞染色。第六步，测定细胞的成活率和早期凋亡率。第七步，根据细胞的成活率和早期凋亡率大小判断土壤重金属和多环芳烃复合污染程度。本发明通过分析蚯蚓体腔细胞的成活率和早期凋亡率大小判断土壤重金属和多环芳烃复合污染程度，该方法灵敏高效、操作简便、重复性好，尤其适用于对老工业基地中土壤重金属和多环芳烃复合污染情况的检测，对土壤中重金属和多环芳烃复合污染有很好的预警作用。
文档编号C12Q1/02GK101344512SQ20081004248
公开日2009年1月14日 申请日期2008年9月4日 优先权日2008年9月4日
发明者江 朱, 陆贻通 申请人:上海交通大学