专利名称：一株耐盐的苜蓿中华根瘤菌nsm18及其专用基因簇的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一株耐盐的苜蓿中华根瘤菌NSM18及其专用
基因簇。
背景技术：
干旱和土壤盐渍化是农业所面临的一个主要问题，特别在干旱或半干旱气候条件下尤为突出。据估计，全世界大约有40 %的可耕地都存在盐过量的现象，受盐渍化影响的集 约农业的农田面积可达到4. 0 9. 5亿公顷。更为严重的是，因受厄尔尼诺气候的影响，全 球气温升高，海平面上升，加之工业污染和农业灌溉、施肥不当等人为因素的影响，次生盐 碱化土壤的面积还在以每年3%的速度扩展。利用生物工程技术提高农作物、农用微生物的 抗逆性是改良利用盐渍化土壤经济有效的方法之一，而与耐盐有关基因的资源是实施生物 工程改良利用盐渍化土壤的物质基础。目前，我国一方面由于缺乏与耐盐有关的基因的开 发和利用，特别是缺乏有效的耐高盐基因，另一方面因受知识产权等因素的影响，某些国外 与耐盐相关基因的转化利用受到限制，这些严重制约了我国生物工程改良利用盐渍化土壤 的进程。因此，挖掘耐盐生物种质资源的潜力，拓宽遗传基础，对存在于中度嗜盐菌中的与 耐盐有关基因或调节因子进行克隆分离，并以基因工程的手段转移到其它微生物中，对于 打破物种限制，实现种间、种外外源基因的转移或累加，对构建耐盐的工业生产用菌、开发 利用盐碱地和增加粮食产量等方面具有广阔的应用前景。根瘤菌是一类重要的土壤微生物，可与相应的豆科的植物共生固氮。发展和开发 其共生固氮系统是解决农业可持续发展的一个办法。共生固氮系统能合成最廉价的蛋白 质，对人类与动植物的营养具有相当重要的作用。然而，盐胁迫导致生物固氮的迅速下降， 以致造成蛋白质产量的显著降低。同时，独立生活的根瘤菌在土壤中也受到相同的盐胁迫 的影响，繁殖能力大大地降低，而且其在植物根部的定殖也大受影响，造成结瘤能力的下 降。因此，从具有高度耐盐能力的中度嗜盐菌中克隆与耐盐有关基因，并转化根瘤菌，构建 耐盐高效的共生系统必将有益于农业的持续性发展。本发明人以往尝试过其它与耐盐相关基因，比如甘氨酸甜菜碱合成和转运基因。 虽然该基因可以不同程度地增强转基因微生物对多种逆境胁迫的抗性，但是受制于其关键 前体物(胆碱)的供给，这些基因所获得的转基因产品通常积累的甘氨酸甜菜碱的量很低 (约0. 05-5 μ mol ^g-1FD)，限制了其在耐盐基因工程中的应用。相比较而言，本发明中所使 用的四氢嘧啶基因是从头合成基因，不需要特殊底物的存在，也不需要特殊的转运系统，对 底物要求不高，而且，已有在植物中表达四氢嘧啶合成基因能提高高渗冲击的耐受能力的 报道。但是，在微生物不同种属间的转移和表达还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一个基因簇(命名为ectABC)，是从一株能在4mol/LNaCl 条件下生长的革兰氏阳性放线菌喜盐涅斯捷连科氏菌(Nesterenkonia halobia)DSM20541中克隆出的四氢嘧啶合成基因。本发明提供的基因簇，为如下1)_4)中任一种1)其核苷酸序列是序列表中序列1的自5'末端第1809-5236位脱氧核糖核苷 酸；2)其核苷酸序列是序列表中的序列1 ；3)在严格条件下与1)或2)的基因杂交且与四氢嘧啶合成相关的DNA分子；4)与1)或2)的基因具有90%以上的同源性且与四氢嘧啶合成相关的DNA分子。序列表中序列1有5496个碱基，其中自5，端第2047-2575位为ectA的编码区， 自5，端第2746-4030位为ectB的编码区，自5，端第4238-4625位为ectC的编码区。所述的严格条件是指，将杂交膜置于预杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液， pH7. 2,7% SDS)中，65°C预杂交30min ；弃预杂交液，加入杂交液(0. 25mol/L磷酸钠缓 冲液，pH7.2,7% SDS,同位素标记的核苷酸片段)，65°C杂交12hr ；弃杂交液，加入洗膜 液I (20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7. 2,5% SDS)，65°C洗膜2次，每次30min ；加入洗膜液 II (20mmol/L 磷酸钠缓冲液，pH7. 2,1% SDS)，65°C洗膜 30min。含有上述基因簇的重组载体也属于本发明的保护范围之内。使用上述基因簇构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种 增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素 (Ubiquitin)基因启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此 外，使用本发明的基因构建表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子， 这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅 读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的， 可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。上述重组载体是将上述的基因簇插入pLAFR3的多克隆位点构成的重组表达载 体。含有上述基因簇的转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围之内。上述重组菌是将上述的重组载体导入根瘤菌中构成的重组根瘤菌。上述根瘤菌是苜蓿中华根瘤菌；该苜蓿中华根瘤菌是苜蓿中华根瘤菌1021。本发明的另一目的在于提供一种培育耐逆的转基因重组菌的方法。本发明提供的培育耐逆的转基因重组菌的方法，是将上述基因簇导入目的菌中构 成的重组菌。上述的基因簇是将上述的重组载体导入根瘤菌中构成的重组根瘤菌。上述根瘤菌可以是苜蓿中华根瘤菌；上述苜蓿中华根瘤菌可以是苜蓿中华根瘤菌 1021。上述的重组菌具体可以是苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)NSM18，已 于2009年11月03日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC， 地址为中国北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCC No . 3383。上述耐逆是耐盐和/或耐高温。扩增上述基因簇的全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围之内。上述的基因簇、上述的重组载体、或上述的重组菌在合成四氢嘧啶中的应用也属于本发明的保护范围之内。本发明的优点在于，打破物种界限，将来自中度嗜盐菌中的四氢嘧啶合成基因转 移至根瘤菌中，这是一个大胆的尝试。实验证明本发明提供的基因簇不但可以提高大肠杆菌的耐盐能力，而且通过 HPLC-UV分析，检测到四氢嘧啶的合成。在上述工作的基础上，本发明获得一株耐盐的根瘤菌工程菌株NSM18。耐盐性实验 表明，该工程菌株能耐受高达1.4mol/L NaClU. 5mol/L KC1以及0. 6mol/L LiCl的盐浓度 条件，而且，工程菌能在42°C下生长，而对照则不能生长，表现出抗高温能力。并且，本发明的工程菌株NSM18在拥有上述的优点基础上仍保持其优良的结瘤固 氮能力。由此可见，本专利中的工程菌株NSM18不但高度耐盐、耐高温，并且能高效固氮， 具有良好的应用前景。
图1为ectABC基因的克隆策略图。图2为重组质粒pGEM-Nect的构建示意图。图3为ectABC对大肠杆菌XLl_Blue的渗透保护作用。图4为大肠杆菌KNabc/pGEM-Nect和KNabc/pGEM_3f (+)在不同NaCl浓度下的生 长。图5为HPLC-UV检测四氢嘧啶在大肠杆菌KNabc/pGEM-Nect中的积累，A是四氢 嘧啶标样的色谱峰，B是大肠杆菌KNabc/pGEM-Nect相容性溶质提取物的色谱峰，C是大肠 杆菌KNabc/pGEM-3Zf(+)相容性溶质提取物的色谱峰。图6为重组质粒pLAFR-NECT的构建示意图。图7为苜蓿中华根瘤菌工程菌株NSM18和苜蓿中华根瘤菌(Sm/pLAFR3)在不同 NaCl浓度下的生长。图8为苜蓿中华根瘤菌NSM18和苜蓿中华根瘤菌(Sm/pLAFR3)在不同KC1浓度下 的生长。图9为苜蓿中华根瘤菌NSM18和苜蓿中华根瘤菌(Sm/pLAFR3)在不同LiCl浓度 下的生长。图10为苜蓿中华根瘤菌NSM18和苜蓿中华根瘤菌(Sm/pLAFR3)在不同温度下的 生长，A 是 28°C，B 是 37°C，C 是 42°C。图11为HPLC检测四氢嘧啶在苜蓿中华根瘤菌工程菌株NSM18中的积累，A是四 氢嘧啶标样的色谱图，B是NSM18相容性溶质提取物的色谱图，C是对照相容性溶质提取物 的色谱图。图12为苜蓿中华根瘤菌工程菌株NSM18的结瘤实验，A是结瘤实验第40天的整 株照片，B是结瘤实验第40天植株根部结瘤的照片。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。本发明所使用的常规分子生物学实验操作，如DNA酶切、连接、转化和质粒提取 等，均参考“分子克隆指南”。本发明所使用的培养基为MM63 培养基(1L) (NH4) 2S04 15mmol/L, KH2P04 22mmol/L, K2HP04 40mmol/L，葡萄 糖 40mmol/L, MgS04lmmol/L, FeCl2 25 u mol/L,定容至 1L, pH6. 8-7. 2。LBK液体培养基胰蛋白胨10g，酵母粉5g，KC1 6. 48g，自然pH。液体TY培养基(1L)胰蛋白胨5g，酵母粉3g，CaCl2 0. 6g，定容至1L，pH 7. 0 ；固 体TY培养基胰蛋白胨5g，酵母粉3g，CaC12 0. 6g，琼脂粉15g，定容至1L，pH 7.0。LB培养基(1L)胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，定容至lL，pH 7.0。YMA 培养基(1L)甘露醇 10g，酵母粉 3g，MgS04 0. 2g，NaCl 0. lg，K2HP04 0. 25g， KH2P04 0. 25g，定容至1L，pH7. 0 ；固体培养基加15g琼脂粉后定容至1L。结瘤实验的无氮培养液(1L):CaS04 0 . 46g, KC1 0. 075g, K2HP04 0. 136g，MgS04 0. 06g，柠檬酸铁0. 075g,微量元素1ml，定容至1L ；其中微量元素(1升):H3B03 2. 86g， ZnS04 0. 22g, CuS04 0 . 8g, H2Mo04 0 . 02g, MnS04 1. 81g，蒸馏水 1000ml。本发明所用的遗传资源如下喜盐涅斯捷连科氏菌DSM 20541，于2000年3月购自德国微生物菌种保藏中心，因 为喜盐涅斯捷连科氏菌DSM 2054购自德国微生物菌种保藏中心，所以其原始来源不清楚。苜蓿中华根瘤菌1021，中国农业大学实验室保藏，无法说明其原始来源。实施例1、四氢嘧啶合成基因的全序列的获得一、ectB基因的部分片段在本发明中，四氢嘧啶合成基因是从喜盐涅斯捷连科氏菌DSM 20541 (购自德国 微生物菌种保藏中心)中分离的。基因分离是通过简并引物扩增，获得部分保守片段，引物 序列如下表所示ectB-up 5’ -GCNGGNGCNYTNAAYTAYGGNCAYAA-3’ectB-dn 5’ -ARNCCNCCYTCNCCYTGNACNGTYTC-3’PCR的扩增条件为组分体积2XGC rich buffer I25 u 1dNTP Mixture (各 2. 5mmoL/L)4 u 1ectB-up (20mmoL/L)1 u 1ectB-dn (20mmoL/L)1 u 1喜盐涅捷连科氏菌DSM20541的基因组DNA lu 1 (1-10ng)TaKaRa LA Taq0. 25 u 1ddH2050 ill反应条件94°C 5min94°C 30s,56°C 30s,72°C,30s30 轮循环
72 °C lOminPCR扩增获得大小为497bp左右的DNA片段，将扩增产物电泳回收纯化，然后连接 到pGEM-T easy载体上。用碱解法提取质粒，用于序列测定，测序反应由上海生工生物技 术有限公司完成。在GenBank中进行BLAST比较，表明已经获得了喜盐涅捷连科氏菌DSM 20541 ectB基因的部分片段。二、ectBC及其下游序列为了进一步获得ectABC基因簇全序列，将喜盐涅捷连科氏菌DSM 20541的基因组 DNA用BamHI完全酶切后自连。根据已知的497bp部分ectB片段，设计一对反向引物NIP1 和NIP2，引物序列如下NIP1-116 5'-gccgcgaacctgcctcagaa-3‘NIP2-284 5， _tgacgctgggctcgctgtcggt_3，PCR反应体系如下组分2XGC rich buffer IIdNTP Mixture (各 2. 5mmoL/L)NIPl-116(20mmoL/L)NIP2-284(20mmoL/L)BamHI切后自连环化的DNATaKaRa LA TaqddH20反应条件94°C 5min94°C 30s, 56°C 30s, 72°C，30s72°C lOmin经反向PCR扩增，结果得到2. 87kb左右的DNA片段。测序结果表明，此次的克隆 序列只包括ectBC及其下游序列，没有克隆到ectA基因序列。三、ectABC基因簇的全序列的获得用构建部分基因文库的方法克隆ectA。根据两次杂交结果，在SphI和Bglll双酶 切的约5Kb具有阳性信号，回收5Kb左右的DNA片段，连到pUC19的SphI和BamHI位点上， 转化大肠杆菌DH5 a，构建了部分基因文库。经过菌落PCR，将阳性克隆筛选出来，测序后与 已知序列拼接，获得5. 946Kb的DNA片段。菌落PCR所使用的引物如下Ectupl 5'-gccgcatcacggagga-3‘Ectdnl 5'-gtaggggatcttggag-3‘菌落PCR体系如下2XGC richbufferl 12. 5u 1XNdNTPmix2u 1XNEctupl0. 5u 1XNEctdnl0. 5 u 1 XN
体积 25 u 1 4u 1 1 u 1 1 u 1
1 u 1(1-10 ng)
0. 25u 1 50 u 1
30轮循环
LA Taq(or EX Taq) 0.25 μ IXN
菌悬液Ομ ddH208.75 μ IXN总体积24. 5 μ IXN菌落PCR的扩增条件为变性95°C，IOmin30 轮循环:94°C, Imin ；58°C, Imin ；72°C,40s延伸72°C，IOmin;4°C，IOmin由此，获得了完整的四氢嘧啶合成基因。ectABC基因的克隆策略如附图1所示。 ectABC基因簇的全序列如序列表中序列1所示。序列表中序列1有5496个碱基，其中自 5，端第62-1625位为DUFl 12的编码区，自5，端第2047-2575位为ectA的编码区，自5，端 第2746-4030位为ectB的编码区，自5，端第4238-4625位为ectC的编码区。实施例2、重组大肠杆菌的获得及其检测一、本发明所用的ectABC基因全序列的获得利用primer premier 5. 0设计一对引物，扩增包括启动子和终止子序列在内的 ectABC基因全序列。引物序列如下NectupE 5’ -GCGAATTCGGCGCAGATCACAGGAATACAA-3’ (EcoRI site)NectdnX 5’ -GCTCTAGAGCTCTCCCTCAGCCAGGG-3’ (XbaI site)PCR扩增条件如下5 X Phusion GC Buffer (含有 Mg2+)10 μ 1
dNTP (各 2. 5mmoL/L) 4 μ 1上游引物(NectupE)1 μ 1 (0. 5 μ moL/L下游引物(NectdnX)1 μ 1 (0. 5 μ moL/L)喜盐涅捷连科氏菌DSM 20541的基因组DNA 1 μ 1 (1 IOng)Phusion DNA 聚合酶0. 5 μ 1 (2U)ddH2032. 5 μ 1总体积50 μ 1PCR的扩增条件为变性98°C，2min30 轮循环98°C，1. 5min ;52°C，Imin ;72°C，Imin 30s延伸72°C，5min以NectupE和NectdnX为引物，以喜盐涅捷连科氏菌DSM 20541的基因组DNA为 模板进行扩增，得到3. 444kb的PCR产物。将该PCR产物送交公司测定序列。测序结果表 明目的片段的DNA序列具有序列表中序列1的自5’端第1809-5236位的所示的核苷酸，将 该片段命名为Nect。二、用于大肠杆菌的重组质粒的构建使用EcoRI和XbaI进行双酶切Nect，经凝胶试剂盒回收后，插入到载体 pGEM-3zf (+)(购自美国Promega公司)的EcoRI和XbaI位点上，获得重组质粒pGEM-Nect。 其构建策略如附图2所示。
三、重组大肠杆菌XLl-Blue的获得及其检测
1、重组大肠杆菌XLl-Blue的获得通过电转化的方法将重组质粒pGEM-Nect转入大肠杆菌XLl-Blue (购自北京鼎国 生物技术公司)中，得到转化子XLl-Blue/pGEM-Nect。同时将克隆质粒pGEM_3zf (+)转入 大肠杆菌XLl-Blue中，获得转化子XLl-Blue/pGEM-3zf (+)，作为对照。2、检测将上述步骤1得到的转化子和其对照在无NaCl的液体培养基MM63中过夜培养， 制成种子液，然后按的接种量接种到含0. 68mol/L NaCl的MM63液体培养基中，每隔1 小时测定培养液中的0D_。结果如图3所示，Nect能使大肠杆菌XLl-Blue在含0. 68mol/L NaCl的MM63培 养基中生长，并且可明显缩短大肠杆菌XLl-Blue的生长延滞期，提高其最终的0D_。四、重组大肠杆菌KNabc及其检测大肠杆菌突变株KNabc(美国Terry A. Krulwich教授惠赠，记载过该突变株
Masahiro I, Arthur AG, Bauke 0, Terry AK(1999)mrp, a multigene, multifunctional locus in Bacillus subtil is with roles in resistance to cholate and to Na+and in pH homeostasis. J Bacteriol 181:2394—2402.)由于缺失了 NhaA 和 NhaB两个主要的Na+/H+逆向转运蛋白，对盐非常敏感，0. 2mol/L NaCl就可以完全抑制该菌 的生长。1、重组大肠杆菌KNabc的获得本发明同样通过电转化的方法将重组质粒pGEM-Nect转入大肠杆菌突变株 KNabc，得到转化子KNabc/pGEM-Nect，同时将克隆质粒pGEM_3zf(+)转入大肠杆菌突变株 KNabc中，获得转化子KNabc/pGEM-3zf (+)，作为对照。2、检测将转化子KNabc/pGEM-Nect与对照KNabc/pGEM_3zf (+)先接种在不含Nacl的 LBK液体培养基中，过夜培养，按的接种量接种于不同NaCl浓度(0、0. 05、0. 1,0. 15和 0. 2mol/L)的LBK液体培养基中，振荡培养48小时后测定最终0D600值。结果如图4所示，发现转化子KNabc/pGEM-Nect能在含0. 2mol/L NaCl的LBK液 体培养基中生长，而阴性对照KNabc/pGEM-3Zf (+)在此条件下不能生长。3、验证为了证实重组子KNabc/pGEM-Nect在含0. 2moL/L NaCl的LBK液体培养基上的生 长，是由于相容性溶质四氢嘧啶在其细胞质内合成的结果，本发明使用HPLC-UV对重组子 KNabc/pGEM-Nect和KNabc/pGEM_3zf (+)细胞内有无四氢嘧啶进行了分析。相容性溶质的提取方法为接种重组子于相应培养基中，37°C过夜摇菌。次日按 的接种量接种于三角瓶中，继续摇菌，直到菌液的0D_约为1.0。常温离心收集菌体，
并置于冷冻干燥机中干燥；称量菌体的干重后，置于400 μ 1的提取混合液(甲醇/氯仿/ 水，10 5 4[体积比])中剧烈震荡(或超声)30min。再加入等体积(130μ1)的氯仿 和水，再次振荡30min。回收含有相容性溶质和其它溶质的上层水相，冻干；加入100 μ 1水 和400 μ 1的乙腈，完全溶解后，过滤，备用。HPLC-UV分析条件是仪器为美国安捷伦公司的Agilent 1100系列高效液相色谱仪，检测器为紫外检测器(UV-detector)。检测条件流动相为水乙腈=1 4，流速为 lml/min，检测波长为210nm。结果如图5所示，四氢嘧啶标样(购自Sigma公司)的出峰时间在4. 43min。同 样，在KNabc/pGEM-Nect提取的相容性溶质的色谱图中，在4. 43min也具有一个明显的色谱 峰(图5B)，而对照KNabc/pGEM-3Zf (+)中则没有该峰出现(图5C)，说明四氢嘧啶确实在 KNabc/pGEM-Nect细胞内合成。由此，已证明从中度嗜盐菌喜盐涅捷连科氏菌中克隆得到的 四氢嘧啶合成基因具有明显的遗传优势，不但能在大肠杆菌中异源表达，而且能显著提高 大肠杆菌KNabc的耐盐能力，并且能在大肠杆菌KNabc中积累。实施例3、重组根瘤菌的获得及其检测苜蓿中华根瘤菌是重要的农用微生物，可以与苜蓿等牧草结瘤固氮，提高牧草产 量，其共生体系在农牧业上具有重要的应用前景。但这种共生体系往往会受到盐胁迫的抑 制。基于四氢嘧啶合成基因在大肠杆菌中的高效表达，可以将其作为耐盐的基因资源在重 要的农用菌株中进行应用。一、重组根瘤菌的获得1、重组表达载体的构建运用EcoRI和Hindlll双酶切重组质粒pGEM-Nect，胶回收酶切过的片段，连接到 PLAFR3 (中国农业大学已保存，记载过该载体的非专利文献是孙栋唐莉丽王倩倩等，2006， 高盐极端环境土壤基因组DNA的分离纯化方法研究及基因文库的构建，广西农业生物科 学，25 (1) 24-29)的EcoRI和Hindlll位点中，构成重组表达载体pLAFR-Nect，然后转化大 肠杆菌DH5ci，挑出能在含有25i!g/ml四环素(Tc)的LBK平板上能生长的单菌落，提取质 粒，酶切验证。构建策略如附图6所示。2、重组根瘤菌的获得利用三亲本接合实验，将重组质粒pLAFR-Nect转移至苜蓿中华根瘤菌1021 (中 国农业大学已保存，记载过该载体的非专利文献是Jebbar M.，Sohn-Bosser L.，Bremer E. , Bernard T. and Blanco C. Ectoine—Induced Proteins in Sinorhizobium meli loti Include an Ectoine ABC-Type Transporter Involved in Osmoprotection and Ec toine Catabolism. J. Bacteriol.，2005，187 1293-1304)中，获得苜蓿中华根瘤菌工程菌 株 NSM18。其中，三亲本接合的具体操作如下将受体菌株苜蓿中华根瘤菌1021在固体TY培 养基上活化，28°C培养2-3天。挑取单菌落接种于5ml含有400 u g/ml链霉素的TY培养液 中，28°C振荡培养24h。按的接种量转接于另一含有5ml含有400 y g/ml链霉素的TY 培养液的试管中，28°C继续培养20h左右。将含有供体质粒pLAFR-Nect的大肠杆菌菌株DH5 a和含有辅助质粒pRK2013的 大肠杆菌菌株DH5 a分别活化后，同时接种于5ml含25 y g/ml四环素和50 u g/ml的卡那 霉素的LB培养液中，37°C振荡培养16h。按的接种量转接于另一 LB试管中，继续培养 8h左右。同时，分别收获供体、受体菌株和含辅助质粒的菌株，以10，000rpm离心lmin，收
集菌体，然后分别用0. 9%的生理盐水培养液洗涤菌体2-3次。将三种菌悬液等量混和，离 心，倒掉上清，静置，用200 yl枪头将松散的菌泥转移到TY固体培养基上的硝酸纤维素膜(45口111微孔滤膜)上，281培养2411。注意不要倒置培养。用接种环将滤膜上的菌体刮 下，溶于无菌生理盐水中，充分打散菌体后进行梯度稀释。各取ΙΟΟμ 1不同稀释度的菌悬 液，涂布于含50 μ g/ml四环素和400 μ g/ml链霉素的YMA培养基上，同时涂布适当浓度的 供体和受体菌悬液，作为阴性对照。将平板表面吹干后，于28°C倒置培养2-4天。将平板 上长出的单菌落分别挑到含有50 μ g/ml四环素和400 μ g/ml链霉素的YMA培养基培养， 提取质粒，并酶切验证，至此，得到含有PLAFR-Nect的苜蓿中华根瘤菌1021，命名为Sm/ pLAFR-Nect,其中的一株命名为苜蓿中华根瘤菌工程菌株NSM18。同时，按照获得Sm/pLAFR-Nect的方法将pLAFR3转移至苜蓿中华根瘤菌1021，获 得对照 Sm/pLAFR3。二、检测 1、耐盐实验挑取接合子的单菌落，接种于含有50 μ g/ml四环素和400 μ g/ml链霉素的TY液 体培养基中，28°C下摇菌2天，然后按1 %比例接种于含有不同浓度的NaCl (浓度分别是0 ； 0. 1 ；0. 3 ；0. 5 ；0. 7 ;0· 9 ;1. 1 ;1· 3 禾口 1. 5mol/L)、KCl (浓度分别是 0 ；0. 1 ；0. 3 ；0. 5 ;0· 7 ； 0. 9 ；1. 1 ；1. 3 ；1. 5 和 1. 7mol/L)和 LiCl (浓度分别是 0 ；0. 1 ；0. 2 ；0. 3 ；0. 4 ；0. 5 ；0. 6 ；0. 7 和0. 8mol/L)的液体TY培养基中，3天后测定0D·。1)耐 NaCl 实验结果如图7所示，NSM18菌株能够在高达1. 4mol/L NaCl的TY培养基上生长，而 对照苜蓿中华根瘤1021 (Sm/pLAFR3)最高只能在0. 6mol/L的NaCl上生长，表明NSM18菌 株具有很高的NaCl抗性。2)耐 KCl 实验结果如图8所示，NSM18菌株能够在高达1. 5mol/L KCl的TY培养基上生长，而苜 蓿中华根瘤菌1021 (Sm/pLAFR3)最高只能在0. 6mol/L的KCl上生长，表明NSM18菌株具有 很高的KCl抗性。3)耐 LiCl 实验结果如图9所示，在小于0. 4mol/L LiCl，尤其是在0. 2_0. 4mol/L LiCl之间， NSM18菌株的生长比苜蓿中华根瘤1021 (Sm/pLAFR3)弱，并随着LiCl浓度的升高而降低。但 在大于0. 5mol/L LiCl培养条件下，NSM18菌株依然能够生长，而苜蓿中华根瘤菌1021 (Sm/ PLAFR3)却不能生长。4)高盐下的HPLC-UV检测为了进一步证实NSM18菌株在含高盐的TY培养基上的生长，是由于相容性物质四 氢嘧啶在其细胞内积累的结果，将生长在含0. 5mol/L NaCl的TY液体培养基中的NSM18菌 株细胞内的相容性溶质提取，然后以HPLC-UV检测其细胞内四氢嘧啶的积累情况。检测条 件为流动相为水乙腈=4 1，流速为lml/min，检测波长为210nm。其中相容性溶质提取的方法与实施例2中KNabc/pGEM-Nect中相容性溶质的提取 方法一致。结果如图IlA所示，四氢嘧啶标样的峰出现在色谱图中的2. 176min处。从图IlB 可以明显看出，NSM18菌株细胞内提取物中具有与标样一致的四氢嘧啶特征峰，而苜蓿中华 根瘤菌1021(Sm/pLAFR3)则不具有该特征峰(图11C)，表明该工程菌株中确实有四氢嘧啶的积累。2、耐高温检测由于四氢嘧啶能够稳定微生物等生物体内各种酶的构型，从而提高微生物耐受极 端环境的能力，因此，本发明对NSM18菌株的耐温性能进行了研究。实验步骤如下挑取接合子的单菌落，接种于含有50 u g/ml四环素和400 u g/ml链霉素的TY液 体培养基中，28°C下摇菌2天，然后按的接种量接种于上述培养基中，置于不同温度下 28°C、37°C、42°C三个温度梯度，大约3天测定0D6(1(1。结果如图10所示，在28°C的常规培养温度下，NSM18菌株和苜蓿中华根瘤菌 1021(Sm/pLAFR3)生长没有任何差异(图10A)。在37°C培养条件下，NSM18菌株的延滞期 明显缩短，比苜蓿中华根瘤菌1021(Sm/pLAFR3)缩短了近10h(图10B)。在42°C培养条件 下，Sm/pLAFR3已经完全不能生长，而NSM18却依然能够生长，只是生长延滞期达到20h(图 10C)。从上可以看出，NSM18菌株确实具有一定的耐热能力。由上述步骤1耐盐性试验和步骤2的耐高温检测表明，工程菌株NSM18具有耐盐、 耐高温的能力。3、结瘤实验的研究为了分析NSM18菌株(Sm/pLAFR-Nect)、Sm/pLAFR3和野生型对照苜蓿中华根瘤 菌1021共生固氮能力，本发明选用优良的苜蓿品种紫花苜蓿保定，购自北京中畜东方草业 科技有限责任公司，作为结瘤实验的植物宿主，在温室中培养(温度在25-28°C，光照时间 12h)40天后收获。结瘤实验操作步骤如下将紫花苜蓿种子放入无菌培养皿中，加入95%乙醇，用枪头反复抽吸，使种子表面 被完全浸润。5分钟后，吸掉乙醇，加入0. 升汞5ml，消毒5分钟，然后用无菌的生理盐 水反复冲洗3遍。将表面消毒的种子置于垫有湿润滤纸的无菌培养皿中，于28°C培养2-3 天，待主根长到2-3cm时，进行瓶栽和接种。每瓶中保留3-5棵苜蓿幼苗。采用双层瓶法进 行结瘤实验，将萌发的无菌种子种植于无菌双层瓶中，上层瓶中装满蛭石，下层瓶中装有上 述的无氮培养液，用纱布经上层瓶瓶底的小孔引流到上层瓶中，以保证蛭石的湿润度。双层 瓶经121°C灭菌1小时。将根瘤菌(工程菌株NSM18、Sm/pLAFR3和Sml021)分别在TY培 养液中培养至对数期，以5000rpm离心5min，收集菌体，用生理盐水重悬菌体，调整其浓度 为107-108菌体/ml。每瓶接种量为1ml，以不接种的处理为对照(图12中的CK为没有接 种的处理)。每组处理设3-5瓶重复。将双层瓶随机摆放在温室中，每天光照时间约为12 小时，温度25-28°C。40天后收获，测定根瘤数。剪取植株地上部分，测定株高，并于70°C温 箱烘至恒重，即得植株干重。表1.结瘤实验结果 注Sml021表示苜蓿中华根瘤菌1021结果如表1和图12所示，工程菌株NSM18 (Sm/pLAFR-Nect)仍保持亲本菌株优良 的固结瘤能力。表明它是一株耐盐高效的苜蓿中华根瘤菌工程菌株。苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)NSM18已于2009年11月3日保藏于 中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为中国北京市朝阳区 大屯路)，保藏号为CGMCC Na . 3383。序列表<110>中国农业大学<120> 一株耐盐的苜蓿中华根瘤菌NSM18及其专用基因簇<160>1<210>1<211>5496<212>DNA<213> 喜盐涅斯捷连科氏菌(Nesterenkonia halobia)<400>1gcatgccctcccggcaggccgcacgcgacccgccgcccccaccagtcgaaggagcccggt60
gatgtcgtcgcaccccaccaccccggaaaccgacaggaccagagaggccgCgggCCCCCg120
CCCgggggCCtcggaggagcacgtgccgcacacccggctctggaccggacgcgtcctggg180
cccggtgctcggggtgatcgtctacctcgccagcagccaggacccggccctgagcacgga240
cgcggcgatgacgctcggcgtcgccgtgctcatcgccgtgtggtggatgaccgaggcgct300
gccgctggcggtgacctcgctgatgccgctgctgctcttccccctgctgggcgtcttcga360
catcgaccaggccgccagccagtacggcgacaacatcgtcttcctcttcctcggcggctt420
catcatcgccctggcgatggagaagtggaacctgcacaagcgcatcgccctgctgacgat480
gcgcggcatcggttctcgaccccgccagctgctgctcggcatcatggtcgcgacctggtt540
cctgtccatgtgggtctccaacacggcgacgacgatgatgatgctgcccatcggcgtctc600
cgtgctgaccatggtcgccagcgagaagctctcccacctgcccgccgcccagcgccccgc660
cggcgacgacgacccggtcaccgcgctctccggcgaccgcgacacccgcaacttcgccat720
cagcgtcatgctcggcatcgccttcgccgccacgatcggcggactgggcacgctgatcgg780
cagcccgcccaacctcgtcatggtcggggtgatggagcagcagttcgacaccaccgtcag840
cttcgccgactggatgaagctgggcgtgccgctgtcgctggtgttcctgttcgtcgcctg900
gctgatgctcagtcgggtcatcttccccacgaccatgaccgacgccatgggcggccggga960
cgtcgtccgcgacgagctccgcgcgctcgg gaagatgtcccgcggcgagtggagcgtgtt1020
13
ggcggtcttcgtctccaccgccctgctgtgggtcttcaccggccagctgcagaagatcga1080
ctggctggtcgatgccctgcccttcctcgagggcatgaacgacaccagcatcgcgatggc1140
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cgcgtcatggcgcagatcacaggaatacaaggggctttgacgtcttcttcatcacaaaga1860
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gatgtgaacaccccgtacgcctacctgctgtggacccgcgacttcgccacgacgtcggtg2220
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ctgctgcgccgccacaagat cctgctgatc atcgacgacg tgcaggccgg ctgcggccgc3480accggcaccttcttctcctt cgaggaggcc ggcatcaccc cggacatcat ctgcatgtcc3540aagtcgatctccggctacgg cctgccgatg gcgatcacgc tgttcaagcc ggagctggac3600gtctgggagggcggcgagca caacggcacc ttccgcggca acaacctcgg cttcatcacc3660ggcgcccgggccctggagct gttctggtcg gacgactcct tccagaagca gctggccgcg3720aagatcgagacgctccgcga gggcctggag gacatcgccc agcacgtgaa gggcgcgacg3780ctgcgcggccgcggcttcct gaccggcatc tgcttccccg acgccgacac cgccggcaag3840gtcgccgccgagtcctataa gcggaacctg ctgctggaga cctccggccc cgaggacgag3900gtcatcaaggtcatgccgcc gctgaccatc gaggacgacg acctgcagaa gggcatcaag3960gtcatcgaggacgccgggct ggccgccacc ggccagatga gcgagecgag ccgcctgcgc4020gccccgcgctgatcccgctc cgacgcggag ctccccgcgt cccccggtcc cctctcctcc4080gacggcttgcgccgtgggat gatgcggaga ccggggacgc gagccgtgcg ggaccgccgc4140cccgcgccggcctcgacccc gcccggacgt cggtccgccg acgtcggccg tccatgacga4200cctccgcaccatccctcccc gcagacagga gacgactatg tacacgctgc acatcgacga4260cctcaacgacggcgagcgcg acatccgcga cgccgactgg cgctcccgcc ggatggtcct4320gggccgtgagaaggtcggct tctcgctgca cgagaccacc atctacgccg gctccaccca4380ctcgttctggtacgcgaacc acatcgaggc cgtctactgc gtcggcggca agggtcggct4440gaccaacctggagaccgacg aggtccacga gatcaccgac ggcttcctct acctgctcga4500cggtcacgagaagcaccagg tggaggccga cgaggagctc cgactggtct gcgtgttcaa4560cccgccggtgaccggcaagg agatecacga cgagaacggc gtgtacccgc tgatcgtcga4620agactgagcaccgccgcgcg ctgagccggc gcgagccctc gctcgcccgc acgacgacgc4680ccgccccgggatcgcggaga tctccggggc gggcgtcgtg gtgtgcggcg ccgctactcg4740gctccggtccggtccaggtc cgcccggttc ttccggacct gccggatctt cggcagcacc4800atggcaccgccaggatcagc accgcgatca tcaggatgac cacggtcgag ggccgggtga4860agaacaccgagaagtcgccc tggctgaggg agagcgcccg ccgcagctgg gtctcgacca4920tcggcccgaggatcgcgccg aggatcgcgg gggcgaccgg gaagtcgtag acccgcatga4980agaagccggccacaccgatc aggcagacga gcatcacctc gatgagegag ccggagatcg5040agtacacgccgaggatgcct agcaccagga tgccggcgta gagcagcgtc ttggggatct5100ccagcagcttgatccagatc ttcaccagcg gcagattgat caccagcagc atcacgttgc5160cgatgaacagcgaggcgatc agcgtccaga ccaggtccgg ggagttctcg aagagcttcg5220gcccgggctggatgttgtag acctggaagg ccgagaggat gatcgccgcc gtggccgagg5280tcgggatgcccagcgtcagc agcggcacca gcacgccgga gaaggaggcg ttgttcgccg5340cctccggtccggcgacacct tcgatggcgc cgtggccgaa ctcctccggg tgcttcgaga5400gccgccgctcggtggtgtag gagaggaacg tgggcacctc ggagccgccg gtgggcatgg5460agecgaaggtgaatccgagc aggccgccgc ggatcc549权利要求
一个基因簇，为如下1)-4)中任一种1)其核苷酸序列是序列表中序列1的自5′末端第1809-5236位脱氧核糖核苷酸；2)其核苷酸序列是序列表中的序列1；3)在严格条件下与1)或2)的基因杂交且与四氢嘧啶合成相关的DNA分子；4)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性且与四氢嘧啶合成相关的DNA分子。
2.含有权利要求1所述基因簇的重组载体。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于所述重组载体是将权利要求1所述 的基因簇插入PLAFR3的多克隆位点构成的重组表达载体。
4.含有权利要求1所述基因簇的转基因细胞系或重组菌。
5.一种培育耐逆的转基因重组菌的方法，是将权利要求1所述基因簇导入目的菌中构 成的重组菌。
6.根据权利要求4所述的重组菌或权利要求5所述的方法，其特征在于所述重组菌 是将权利要求2或3所述的重组载体导入根瘤菌中构成的重组根瘤菌。
7.根据权利要求6所述的重组菌或方法，其特征在于所述根瘤菌是苜蓿中华根瘤菌； 所述苜蓿中华根瘤菌是苜蓿中华根瘤菌1021。
8.根据权利要求7所述的重组菌或方法，其特征在于所述重组菌是苜蓿中华根瘤菌 (Sinorhizobium meliloti)NSM18 CGMCC Ns.3383。
9.根据权利要求5-7任一所述的方法，其特征在于所述耐逆是耐盐和/或耐高温。
10.权利要求1所述的基因簇、权利要求2或3所述的重组载体、或权利要求4-8任一 所述的重组菌在合成四氢嘧啶中的应用。
全文摘要
本发明公开了一株耐盐的苜蓿中华根瘤菌NSM18及其专用基因簇。该基因簇如序列表中序列1所示。将该基因簇转移至苜蓿中华根瘤菌中构建成一株工程菌株NSM18。耐盐性实验表明，该工程菌株能耐受高达1.4mol/LNaCl、1.5mol/L KCl以及0.6mol/L LiCl的盐浓度条件，而且，工程菌能在42℃下生长，而对照则不能生长，表现出抗高温能力。并且本发明的工程菌株NSM18在拥有上述的优点基础上仍保持其优良的结瘤固氮能力。
文档编号C12P17/12GK101875940SQ20091023760
公开日2010年11月3日 申请日期2009年11月19日 优先权日2009年11月19日
发明者冯德芹, 刘文彦, 张博, 杨苏声, 王磊 申请人:中国农业大学