专利名称：苜蓿青贮的复合菌添加剂的制备方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物技术领域的方法，具体是一种苜蓿青贮的复合菌添加剂的制备方法。
背景技术：
紫花苜蓿(Medicago sativa L.，以下简称苜蓿)是一种多年生豆科牧草，营养价值丰富，是草食动物优质的饲草，有“牧草之王”的美誉。长期以来，紫花苜蓿的保存主要以晒制干草为主，这种方法的最大缺点是营养物质损失严重。近几年，加拿大、日本等国家开始利用青贮的方法保存苜蓿，解决了苜蓿保存过程中营养物质损失严重的问题。由于苜蓿可溶性糖含量低，缓冲能高，属于难青贮的豆科牧草，直接青贮效果不好，需要在青贮发酵过程中使用添加剂。国外目前使用比较普遍的添加剂种类有甲酸、乳酸菌制剂、酶制剂、以及乳酸菌和酶制剂的混合物等。我国在苜蓿青贮方面的研究尚处于起步阶段，对苜蓿青贮添加剂的研究尚属空白，但我国苜蓿青贮市场潜力巨大，青贮添加剂的市场前景很好。
经对现有技术的文献检索发现，Mitsuaki Ohshima等(1997)在AnimalFeed Science Technology杂志第66期(129-137页)首次提出绿汁发酵液(Previously Fermented Juice，简写为PFJ)的制作方法及其在苜蓿青贮中的效果。该方法的主要制作过程如下新鲜苜蓿→切碎→加水→浸渍→粉碎(打浆)→过滤→滤液中加葡萄糖→发酵→制成PFJ。由于绿汁发酵液含有多种来源于苜蓿的乳酸菌菌种，在苜蓿青贮中有明显降低青贮料pH值的作用，并且，绿汁发酵液制作简单，取材方便，家畜食用青贮料后无副作用，青贮制作过程中对人体无害，因此，逐渐开始在生产中得到应用。作为乳酸发酵的启动因子，绿汁发酵液能够在青贮过程中促进乳酸菌种群扩大，抑制其它有害菌的生长，改善苜蓿青贮品质。许多的研究证明用绿汁发酵液青贮苜蓿，其作用比接种单一乳酸菌更有效，可显著降低青贮苜蓿的pH值。然而，绿汁发酵液中除含有多种乳酸菌外，还含有多种有害的菌种，这些菌种同样也具有启动因子的作用，在苜蓿青贮过程中诱导有害菌种群扩大，因而降低或减缓了绿汁发酵液更好地促进乳酸菌扩大繁殖的作用，使得青贮苜蓿在预备发酵期和酸化前期不能在短期内急剧降低青贮料的pH值，这是绿汁发酵液作为青贮添加剂在苜蓿青贮中存在的最大缺陷，影响到青贮苜蓿高质量发酵和形成高质量的青贮料。在进一步的检索中，尚未见将绿汁发酵液与乳酸链球菌和粪链球菌混合作为苜蓿青贮添加剂及其制备方法的报道。
发明内容
本发明针对背景技术中PFJ青贮的不足和缺陷对其进行改进，提供一种苜蓿青贮的复合菌添加剂的制备方法，使其在绿汁发酵液中加入该乳酸链球菌和粪链球菌强化了绿汁发酵液促进青贮苜蓿发酵、快速降低pH值的作用。
本发明是通过以下技术方案实现的，所述的苜蓿青贮的复合菌添加剂由绿汁发酵液与保存有乳酸链球菌和粪链球菌的MRS液体培养基按50-60％∶20-25％∶20-25％的重量百分比混合而成，其制备步骤如下(1)制作绿汁发酵液；(2)从绿汁发酵液中分离乳酸链球菌；(3)乳酸链球菌和粪链球菌活化；(4)把绿汁发酵液与活化的乳酸链球菌和粪链球菌按比例混合，形成苜蓿青贮的复合菌添加剂。
所述的步骤(1)，具体为(a)取新鲜的苜蓿植株，去掉基部和顶部各约10cm，同时去掉主枝和比较粗的枝条，将剩余的幼枝和叶保留，切碎成3-5cm；(b)按苜蓿(g)和水(ml)1∶2.5的比例加入蒸馏水，充分混合，用高速组织粉碎机将混合后的苜蓿捣碎，静置1小时，双层纱布过滤；(c)按苜蓿原料∶葡萄糖＝10g∶1g的比例在滤液中加入葡萄糖或相当葡萄糖量的糖浆，充分搅拌，置于30℃的环境中发酵48小时，制成绿汁发酵液。
所述的步骤(2)，具体为(a)将绿汁发酵液稀释60～100倍，置于分离固体培养基中，培养基pH＝5.8～6.4，35～40℃下培养48h；(b)挑选溶钙圈大、培养基变黄的菌落，放置在MRS固体培养基纯化，得到乳酸链球菌(ST)，纯化后的乳酸链球菌用装有MRS固体培养基的试管保存，该乳酸链球菌在48小时内的产酸性能见表1。
所述的分离固体培养基(％)配方为牛肉膏1g，蛋白胨1g，酵母膏1g，葡萄糖1g，番茄汁20％，土温800.05％，碳酸钙2g，溴甲酚绿0.01％，琼脂1.5g，pH 5.8～6.4。
所述的MRS固体培养基(％)配方为蛋白胨1g，牛肉膏1g，酵母膏0.5g，K2HPO40.2g，柠檬酸二铵0.2g，乙酸钠0.5g，葡萄糖2g，土温80 0.1％，MgSO4.7H2O 0.058g，MnSO4.4H2O 0.025g，琼脂1.5g，pH＝6.2，121℃灭菌15min。
表1 ST菌株培养液的pH值和乳酸含量变化(mmol/L)
所述的步骤(3)，具体为分别将乳酸链球菌和粪链球菌放在MRS液体培养基中活化，活化温度35～37℃，活化时间24～36小时，活化完成时，每ml液体培养基中至少含有乳酸链球菌或粪链球菌5×106cfu。
所述的MRS液体培养基(％)配方为蛋白胨1g，牛肉膏1g，酵母膏0.5g，K2HPO40.2g，柠檬酸二铵0.2g，乙酸钠0.5g，葡萄糖2g，土温80 0.1％，MgSO4.7H2O 0.058g，MnSO4.4Hx2O 0.025g，pH＝6.2，121℃灭菌15min。
所述的步骤(4)，具体为把绿汁发酵液与保存有乳酸链球菌和粪链球菌的MRS液体培养基按50-60％∶20-25％∶20-25％的比例混合，形成苜蓿青贮微生物添加剂，其中每10ml该添加剂含PFJ 5-6ml，乳酸链球菌和粪链球菌各106～107cuf，青贮时每公斤苜蓿加入10-15ml添加剂。
本发明的特点在于(1)乳酸链球菌由苜蓿中分离；(2)将该乳酸链球菌、粪链球菌与绿汁发酵液三种功能互补的添加剂按比例混合，形成本添加剂，它不同于国外单独使用乳酸链球菌或PFJ作为苜蓿青贮添加剂的方法。绿汁发酵液是乳酸发酵的启动因子；乳酸链球菌是预备发酵期起主要作用的乳酸菌菌种，是预备发酵期繁殖最快的乳酸菌菌种；粪链球菌是青贮酸化期起主要作用的乳酸菌菌种，是酸化期繁殖最快的乳酸菌菌种，三种添加剂的综合和互补，强化了绿汁发酵液促进青贮苜蓿发酵的作用，使本添加剂比绿汁发酵液和乳酸链球菌两种添加剂单独使用有更好的降低pH和提高青贮质量的效果。用本添加剂处理的苜蓿，经30天青贮，青贮料pH值比用绿汁发酵液处理降低13.3～13.8％。
具体实施例方式
结合本发明方法步骤提供以下实施例实施例一1、绿汁发酵液制作(1)取新鲜的苜蓿植株，去掉基部和顶部各约10cm，同时去掉主枝和比较粗的枝条，将剩余的幼枝和叶保留，切碎成3-5cm，(2)按苜蓿(g)和水(ml)1∶2.5的比例加入蒸馏水，充分混合，用高速组织粉碎机捣碎，静置1小时，双层纱布过滤，按苜蓿原料∶葡萄糖＝10g∶1g的比例在滤液中加入葡萄糖或相当葡萄糖量的糖浆，充分搅拌，置于30℃的环境中发酵48小时，制成绿汁发酵液；2、乳酸链球菌分离、纯化将绿汁发酵液稀释100倍，置于分离固体培养基中，培养基pH＝5.8，35℃下培养48h，挑选溶钙圈大、培养基变黄的菌落，放置在MRS固体培养基纯化，得到乳酸链球菌(ST)，纯化后的乳酸链球菌用装有MRS固体培养基的试管保存。
所述的分离固体培养基(％)配方为牛肉膏1g，蛋白胨1g，酵母膏1g，葡萄糖1g，番茄汁20％，土温80 0.05％，碳酸钙2g，溴甲酚绿0.01％，琼脂1.5g，pH＝5.8。
所述的MRS固体培养基(％)配方为蛋白胨1g，牛肉膏1g，酵母膏0.5g，K2HPO40.2g，柠檬酸二铵0.2g，乙酸钠0.5g，葡萄糖2g，土温80 0.1％，MgSO4.7H2O 0.058g，MnSO4.4H2O 0.025g，琼脂1.5g，pH＝6.2，121℃灭菌15min。
3、乳酸链球菌和粪链球菌活化分别将乳酸链球菌和粪链球菌放在MRS液体培养基中活化，活化温度35℃，活化时间36小时，活化完成时，每ml液体培养基中至少含有乳酸链球菌或粪链球菌5×106cfu。
所述的MRS液体培养基(％)配方为蛋白胨1g，牛肉膏1g，酵母膏0.5g，K2HPO40.2g，柠檬酸二铵0.2g，乙酸钠0.5g，葡萄糖2g，土温800.1％，MgSO4.7H2O 0.058g，MnSO4.4H2O 0.025g，pH＝6.2，121℃灭菌15min。
4、苜蓿青贮的复合菌添加剂的制作把绿汁发酵液与保存有乳酸链球菌和粪链球菌的MRS液体培养基按50％∶25％∶25％的比例混合，形成苜蓿青贮微生物添加剂，其中每10ml该添加剂含PFJ 5ml，乳酸链球菌和粪链球菌各1.25×107cuf，青贮时每公斤苜蓿加入10ml添加剂。
表2 实施例一的苜蓿青贮效果
从表2看出，用本发酵液处理的苜蓿，经30天青贮，青贮料感观评价达到优良，而PFJ的感观评价为中等；pH值和蛋白质含量分别比PFJ处理低13.3％和提高14.5％，差异均达到显著水平。
实施例二1、绿汁发酵液制作(1)取新鲜的苜蓿植株，去掉基部和顶部各约10cm，同时去掉主枝和比较粗的枝条，将剩余的幼枝和叶保留，切碎成3-5cm，(2)按苜蓿(g)和水(ml)1∶2.5的比例加入蒸馏水，充分混合，用高速组织粉碎机捣碎，静置1小时，双层纱布过滤，按苜蓿原料∶葡萄糖＝10g∶1g的比例在滤液中加入葡萄糖或相当葡萄糖量的糖浆，充分搅拌，置于30℃的环境中发酵48小时，制成绿汁发酵液；2、乳酸链球菌分离、纯化将绿汁发酵液稀释80倍，置于分离固体培养基中，培养基pH＝6.1，37℃下培养48h，挑选溶钙圈大、培养基变黄的菌落，放置在MRS固体培养基纯化，得到乳酸链球菌(ST)，纯化后的乳酸链球菌用装有MRS固体培养基的试管保存；所述的分离固体培养基(％)配方为牛肉膏1g，蛋白胨1g，酵母膏1g，葡萄糖1g，番茄汁20％，土温800.05％，碳酸钙2g，溴甲酚绿0.01％，琼脂1.5g，pH＝6.1。
所述的MRS固体培养基(％)配方与实施例一相同。
3、乳酸链球菌和粪链球菌活化分别将乳酸链球菌和粪链球菌放在MRS液体培养基中活化，活化温度35℃，活化时间30小时，活化完成时，每ml液体培养基中至少含有乳酸链球菌或粪链球菌5×106cfu。
所述的MRS液体培养基(％)配方与实施例一相同。
4、苜蓿青贮的复合菌添加剂的制作把绿汁发酵液与保存有乳酸链球菌和粪链球菌的MRS液体培养基按55％∶20％∶25％的比例混合，形成苜蓿青贮微生物添加剂，其中每10ml该添加剂含PFJ 5ml，乳酸链球菌107cuf、粪链球菌1.25×107cuf，青贮时每公斤苜蓿加入12ml添加剂。
表3 实施例一的苜蓿青贮效果
从表3看出，用本发酵液处理的苜蓿，经30天青贮，青贮料感观评价达到优良，而PFJ的感观评价为中等；pH值和蛋白质含量分别比PFJ处理低13.8％和提高15.7％，差异均达到显著水平。
实施例三1、绿汁发酵液制作(1)取新鲜的苜蓿植株，去掉基部和顶部各约10cm，同时去掉主枝和比较粗的枝条，将剩余的幼枝和叶保留，切碎成3-5cm，(2)按苜蓿(g)和水(ml)1∶2.5的比例加入蒸馏水，充分混合，用高速组织粉碎机捣碎，静置1小时，双层纱布过滤，按苜蓿原料∶葡萄糖＝10g∶1g的比例在滤液中加入葡萄糖或相当葡萄糖量的糖浆，充分搅拌，置于30℃的环境中发酵48小时，制成绿汁发酵液；2、乳酸链球菌分离、纯化将绿汁发酵液稀释60倍，置于固体培养基中，培养基pH＝6.4，40℃下培养48h，挑选溶钙圈大、培养基变黄的菌落，放置在MRS固体培养基纯化，得到乳酸链球菌(ST)，纯化后的乳酸链球菌用装有MRS固体培养基的试管保存；所述的固体培养基(％)配方为牛肉膏1g，蛋白胨1g，酵母膏1g，葡萄糖1g，番茄汁20％，土温800.05％，碳酸钙2g，溴甲酚绿0.01％，琼脂1.5g，pH＝6.4。
所述的MRS固体培养基(％)配方与实施例一相同。
3、乳酸链球菌和粪链球菌活化分别将乳酸链球菌和粪链球菌放在MRS液体培养基中活化，活化温度37℃，活化时间24小时，活化完成时，每ml液体培养基中至少含有乳酸链球菌或粪链球菌5×106cfu。
所述的MRS液体培养基(％)配方与实施例一相同。
4、苜蓿青贮的复合菌添加剂的制作把绿汁发酵液与保存有乳酸链球菌和粪链球菌的MRS液体培养基按60％∶20％∶20％的比例混合，形成苜蓿青贮微生物添加剂，其中每10ml该添加剂含PFJ 6ml，乳酸链球菌和粪链球菌各107cuf，青贮时每公斤苜蓿加入15ml添加剂。
表4 实施例一的苜蓿青贮效果
从表4看出，用本发酵液处理的苜蓿，经30天青贮，青贮料感观评价达到优良，而PFJ的感观评价为中等；pH值和蛋白质含量分别比PFJ处理低13.3％和提高13.9％，差异均达到显著水平。
上述三个实施例的制作方法流程可简述为新鲜苜蓿→精选→切碎→浸渍→粉碎(打浆)→静置→过滤→加葡萄糖→发酵→制成PFJ→稀释→乳酸链球菌培养→纯化→获得乳酸链球菌→选取粪链球菌→活化→PFJ与乳酸链球菌和粪链球菌混合→苜蓿青贮的复合菌添加剂。
权利要求
1.一种苜蓿青贮的复合菌添加剂的制备方法，其特征在于，由绿汁发酵液与保存有乳酸链球菌和粪链球菌的MRS液体培养基按50-60％.20-25％.20-25％的重量百分比混合组成，制备步骤如下(1)制作绿汁发酵液；(2)从绿汁发酵液中分离乳酸链球菌；(3)乳酸链球菌和粪链球菌活化；(4)把绿汁发酵液与活化的乳酸链球菌和粪链球菌按比例混合，形成苜蓿青贮的复合菌添加剂。
2.根据权利要求1所述的苜蓿青贮的复合菌添加剂的制备方法，其特征是，所述的步骤(1)，具体为(a)取新鲜的苜蓿植株，去掉基部和顶部各10cm，同时去掉主枝和比较粗的枝条，将剩余的幼枝和叶保留，切碎成3-5cm；(b)加入蒸馏水，充分混合，用高速组织粉碎机将混合后的苜蓿捣碎，静置1小时，双层纱布过滤；(c)在滤液中加入葡萄糖或相当葡萄糖量的糖浆，充分搅拌，置于30℃的环境中发酵48小时，制成绿汁发酵液。
3.根据权利要求2所述的苜蓿青贮的微生物发酵液的制备方法，其特征是，所述的(b)中，按苜蓿g和水ml 1∶2.5的比例加入蒸馏水。
4.根据权利要求2所述的苜蓿青贮的微生物发酵液的制备方法，其特征是，所述的(c)中，按苜蓿原料∶葡萄糖＝10g∶1g的比例在滤液中加入葡萄糖或相当葡萄糖量的糖浆。
5.根据权利要求1所述的苜蓿青贮的复合菌添加剂的制备方法，其特征是，所述的步骤(2)，具体为(a)将绿汁发酵液稀释60～100倍，置于分离固体培养基中，培养基pH＝5.8～6.4，35~40℃下培养48h；(b)挑选溶钙圈大、培养基变黄的菌落，放置在MRS固体培养基纯化，得到乳酸链球菌。
6.根据权利要求5所述的苜蓿青贮的复合菌添加剂的制备方法，其特征是，所述的分离固体培养基，配方为牛肉膏1g，蛋白胨1g，酵母膏1g，葡萄糖1g，番茄汁20％，土温800.05％，碳酸钙2g，溴甲酚绿0.01％，琼脂1.5g，pH5.8～6.4。
7.根据权利要求5所述的苜蓿青贮的复合菌添加剂的制备方法，其特征是，所述的MRS固体培养基，配方为蛋白胨1g，牛肉膏1g，酵母膏0.5g，K2HPO40.2g，柠檬酸二铵0.2g，乙酸钠0.5g，葡萄糖2g，土温80 0.1％，MgSO4.7H2O0.058g，MnSO4.4H2O 0.025g，琼脂1.5g，pH＝6.2，121℃灭菌15min。
8.根据权利要求1所述的苜蓿青贮的复合菌添加剂的制备方法，其特征是，所述的步骤(3)，具体为分别将乳酸链球菌和粪链球菌放在MRS液体培养基中活化，活化温度35～37℃，活化时间24～36小时，活化完成时，每ml液体培养基中至少含有乳酸链球菌或粪链球菌5×106cfu。
9.根据权利要求8所述的苜蓿青贮的复合菌添加剂的制备方法，其特征是，所述的MRS液体培养基，配方为蛋白胨1g，牛肉膏1g，酵母膏0.5g，K2HPO40.2g，柠檬酸二铵0.2g，乙酸钠0.5g，葡萄糖2g，土温80 0.1％，MgSO4.7H2O 0.058g，MnSO4.4H2O 0.025g，pH＝6.2，121℃灭菌15min。
10.根据权利要求1所述的苜蓿青贮的复合菌添加剂的制备方法，其特征是，所述的步骤(4)，具体为把绿汁发酵液与保存有乳酸链球菌和粪链球菌的MRS液体培养基按50-60％∶20-25％∶20-25％的比例混合，形成苜蓿青贮微生物添加剂，其中每10ml该添加剂含PFJ 5-6ml，乳酸链球菌和粪链球菌各106～107cuf，青贮时每公斤苜蓿加入10-15ml添加剂。
全文摘要
一种生物技术领域的苜蓿青贮的复合菌添加剂的制备方法，所述的复合菌添加剂由绿汁发酵液与保存有乳酸链球菌和粪链球菌的MRS液体培养基按50－60％∶20－25％∶20－25％的重量百分比混合组成，制备步骤如下(1)制作绿汁发酵液；(2)从绿汁发酵液中分离乳酸链球菌；(3)乳酸链球菌和粪链球菌活化；(4)把绿汁发酵液与活化的乳酸链球菌和粪链球菌按比例混合，形成苜蓿青贮的复合菌添加剂。本发明添加剂比绿汁发酵液和乳酸链球菌两种添加剂单独使用有更好的降低pH和提高青贮质量的效果。用本添加剂处理的苜蓿，经30天青贮，青贮料pH值比用绿汁发酵液处理降低13.3～13.8％。
文档编号C12R1/46GK1757715SQ20051002869
公开日2006年4月12日 申请日期2005年8月11日 优先权日2005年8月11日
发明者安渊, 田瑞霞, 王光文 申请人:上海交通大学