专利名称：一种在三七细胞培养中增强原人参三醇型皂甙的生产方法
技术领域：
本发明涉及一种三七细胞培养方法，特别涉及一种诱导原人参三醇型皂甙甙元合成酶即原人参二醇-6-羟化酶的活性来调节人参皂甙的成分比例等，提高原人参三醇型皂甙含量及生产率的培养方法。
背景技术：
三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)又称田七、三七参、人参三七等，为五加科人参属植物，主要分布于中国西南部的云南、广西等地。
《本草纲目》中载有其药用功效，如活血化瘀、镇定止痛、止血补血和滋补强壮等功效，现代医学研究揭示了三萜类人参皂甙是其主要生物活性成分之一。人参皂甙并非单一成分，它们种类多，根据其甙元的不同可分为达玛烷型四环三萜皂甙和齐墩果烷型五环三萜皂甙。已经证明达玛烷型四环三萜皂甙比齐墩果烷型五环三萜皂甙具有更强的生物活性，前者又分为原人参二醇型(如Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rh2、Rg3等)和原人参三醇型(如Rg1、Rg2、Rg1、Re等)人参皂甙。各人参皂甙单体的生物活性不一，有的甚至相反。例如，Rb1、Rb2抑制中枢神经系统，而Rg1兴奋中枢神经(郑光植等，三七生物学及其应用，1994)。近来研究发现，人参皂甙Re具有明显的抗高血糖活性(Attele等，Diabetes 2002，61851-1858)，可能成为一类新型抗糖尿病药物；人参皂甙Re和Rg1具有抑制神经细胞调亡作用(Xu等，J Asian Nat Prod Res 2005，7215-224；Chen等，Eur JPharmacal 2003，4731-7)，可能成为一类新型治疗帕金森等神经性疾病的药物。原人参三醇型人参皂甙Rg1和Re新生物活性的发现使其备受关注。
近年来，商业化人参产品已覆盖许多国家，仅人参原材料2002年的销量已超过12亿美元(金在汉，硕士学位论文，2004)。
细胞培养法生产人参皂甙有效成份，由于生产周期短、劳动力省以及受外部环境影响小等优点被认为是一种更有效的可操作的方法，因此，利用细胞培养大规模生产人参皂甙具有较大的市场潜力。由于不同人参皂甙组分的生理活性的差别大，使得总人参皂甙(各单体人参皂甙的混合物)较难显示良好的原人参三醇型人参皂甙的专一生物活性。并且，如上述，各单体人参皂甙的分子结构非常相似、理化性质也相近，故难以简单把它们分离开来；即使能分离获得，由此也会大大增加生产成本，这使得以目前的技术用原人参三醇型人参皂甙单体开发新药较为困难。
Wang和Zhong(J Biosci Bioeng 2002，9348-53)以及钟建江和王威(中国发明专利，ZL 01126882.4)报道了茉莉酮酸类化合物能提高三七细胞的皂甙含量和改变单体含量比例，但这些工作是侧重提高原人参二醇型人参皂甙(Rb1)与原人参三醇型人参皂甙(Rg1+Re)的含量的比例。如果能对细胞培养过程中各单体皂甙的积累进行更好调控，使其生产更多的原人参三醇型人参皂甙，对于其商业应用无疑具有重要价值。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是公开一利在三七细胞培养中增强原人参三醇型皂甙的生产方法，以克服现有技术存在的无法提高原人参三醇型人参皂甙含量占总人参皂甙含量比例和生产率偏低的缺陷，为工业化经济生产原人参三醇型人参皂甙奠定基础。
本发明的技术构思是这样的本发明在在三七细胞培养基中添加苯巴比妥，诱导原人参二醇-6-羟化酶(P6H)的活性，从而来提高三七细胞原人参三醇型人参皂甙含量比例和生产率。
本发明的方法包括如下步骤将三七(Panax notoginseng)种子细胞在添加有苯巴比妥的MS培养基中进行培养；所说的MS培养基在文献Murashige等(Plant Physiol 1962，15473-479)中已经有公开的报道；每隔10-15天传代一次，培养使用旋转式摇床，转速为50-200rpm，培养温度20-30℃，暗培养；所说的三七细胞的来源，在发明人以往的专利(中国发明专利，ZL 01126882.4)中已经公开报道，具体如下三七种子经消毒后诱导出无菌三七植株，从无菌三七植株剪取0.5-1.0cm长的胚根，在添加有0-20mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)，0-10mg/L6-糠基氨基嘌呤(KT)及10-30g/L蔗糖的MS琼脂培养基中于20-30℃下暗培养，2-4周后长出愈伤组织。选择较旺盛生长的愈伤组织接种到装有50ml新鲜培养基的250ml三角摇瓶中，培养基为添加2mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)、0.7mg/L 6-糠基氨基嘌呤(KT)及30g/L蔗糖的MS液体培养基。每隔10～15天传代一次，培养使用旋转式摇床，转速为50-200rpm，培养温度20-30℃，暗培养。
培养基中添加的苯巴比妥的浓度为0.001～10.0mM，特别优选的为0.01-5.0mM。
培养基中添加苯巴比妥的时间为培养期间的第0～15天，即苯巴比妥可在培养初期加入培养基，或在培养过程中加入培养基；所说的苯巴比妥可采用商业化的产品，其化学结构通式如下C12H12O3N2分子量为232.24人参单体皂甙可通过高压液相色谱法(Wang W & Zhong JJ，J BiosciBioeng 2002，9348-53)测定。
本发明的方法，可显著提高P6H酶的活性和原人参三醇型皂甙(Rg1+Re)含量，使原人参三醇型皂甙占总皂甙含量达85％，同时原人参三醇型皂甙生产率提高了约2倍。这表明通过添加苯巴比妥诱导P6H，可有效调节单体皂甙组份的多样性并增强三七培养细胞原人参三醇型皂甙的生产能力，显示了本发明的方法具备工业化实施的前景。
具体实施例方式
实施例1实验采用的是由多年生三七植株的根诱导而得三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)细胞。对照培养采用MS培养基，另外添加2mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)，0.7mg/L 6-糠基氨基嘌呤(KT)及30g/L蔗糖。将真空过滤所得湿细胞2g接种到装有50ml新鲜培养基的250ml三角摇瓶中，25℃暗培养，细胞在40℃干燥后称重。P6H活性诱导和单体皂甙的调控方法是于培养第4天添加苯巴比妥。P6H活性的测定依照岳才军(博士论文，2005)介绍的方法；干细胞按照Wang和Zhong(J Biosci Bioeng 2002，9348-53)的方法萃取处理后高效液相色谱分析各单体皂甙的含量。结果见表1和表2(培养13天)。
实施例2单体皂甙的调控采用对照培养基在不同时间添加0.5mM苯巴比妥，其它条件同实例1。结果见表3和表4(培养13天)。
表1.不同浓度苯巴比妥(PB)对P6H酶活性的诱导作用
*kat每秒钟每毫克蛋白合成原人参三醇的摩尔数；f＝1×10-15。
表2.不同浓度苯巴比妥(PB)对三七培养细胞人参皂甙含量比例和原人参三醇型皂甙生产率的影响
*Rg∶Rb＝(Rg1+Re)/Rb1。
**生产率是指原人参三醇型人参皂甙(Rg1+Re)的生产率。
表3.不同时间添加苯巴比妥(PB)对P6H酶活性的诱导作用
*kat每秒钟每毫克蛋白合成原人参三醇的摩尔数；f＝1×10-15。
表4.不同时间添加苯巴比妥(PB)对三七培养细胞人参皂甙含量比例和原人参三醇型皂甙生产率的影响
*Rg∶Rb＝(Rg1+Re)/Rb1。
**生产率是指原人参三醇型皂甙(Rg1+Re)的生产率。
权利要求
1.一种在三七细胞培养中增强原人参三醇型皂甙的生产方法，其特征在于，包括将三七(Panax notoginseng)种子细胞在添加有苯巴比妥的MS培养基中进行培养的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，培养使用旋转式摇床，每隔10-15天传代一次。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，摇床转速为50-200rpm，培养温度20-30℃，暗培养。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，培养基中添加的苯巴比妥的浓度为0.001～10.0mM。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，培养基中添加的苯巴比妥的浓度为0.01-5.0mM。
6.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，培养基中添加苯巴比妥的时间为培养期间的第0～15天。
全文摘要
本发明公开了一种在三七细胞培养中增强原人参三醇型皂甙的生产方法。本发明的方法是基于对原人参三醇型皂甙甙元(原人参三醇)的合成酶酶活水平的操作。在三七细胞培养过程中添加原人参三醇合成酶酶活的诱导剂苯巴比妥，有效提高了原人参三醇型皂甙含量占总皂甙含量的比例和生产率。占总皂甙含量可达85％，生产率约提高了2倍。本发明所述的方法克服了现有生产技术存在的原人参三醇型皂甙含量占总人参皂甙含量比例和生产率偏低的缺陷，为工业化经济生产原人参三醇型皂甙奠定基础。
文档编号C12P33/00GK1710093SQ200510027538
公开日2005年12月21日 申请日期2005年7月6日 优先权日2005年7月6日
发明者钟建江, 岳才军 申请人:华东理工大学, 上海颖兴生物科技有限公司