专利名称：遗传改良玉米品系mon863的品系特异性pcr检测方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物工程技术领域的检测方法。具体的说，是涉及一种遗传改良玉米品系MON863的品系特异性PCR检测方法。
背景技术：
随着现代生物技术的迅速发展，基因工程技术已经广泛应用于农业生产领域，数百例基因遗传改良农作物已在全球范围内广泛种植，为人类提供了丰富的食品和医疗产品。到2004年底，全球转基因种植面积已经达到8100万公顷，较2003年增长了20％。我国政府已经批准了多种转基因大豆、玉米、油菜和棉花品系在中国市场的安全生产，其中包括MON863玉米品系。随着转基因植物的广泛种植，转基因食品的安全性问题引起了公众的重视，许多国家和地区纷纷开始实施转基因标签制度，包括中国。
转基因标签制度的实施依赖于对转基因植物及其加工产品的成分检测。Ahmed FE 2002年发表在TRENDS in Biotechnology的文章中指出，用于转基因检测方法主要有两种一种是基于DNA的核酸检测方法，一种是基于蛋白质的免疫学检测方法。其中，以DNA检测为基础的核酸检测方法由于其高灵敏度和高通量的优点已经成为最主要、最适用的转基因检测方法。转基因植物及其加工产品的检测，主要是通过检测插入植物基因组中的DNA序列来实现的。因此，在实际检测过程中，必须了解外源插入的DNA的序列信息。Jensen HA等2003年发表在Anal Bioanal Chem的文章中指出根据PCR检测扩增的目的片段的性质，转基因植物及其加工产品检测可以分为筛选、基因特异性、构建特异性和品系特异性PCR检测四种方法。品系特异性检测是通过检测外源插入载体与植物基因组的连接区序列实现的，由于每一个转基因植物品系，都具有特异的外源插入载体与植物基因组的连接区序列，并且连接区序列是单拷贝的，所以品系特异性检测方法具有较筛选、基因特异性和构建特异性PCR检测方法高的特异性和准确性。鉴于品系特异性检测的高特异性，品系特异性检测已经成为目前转基因检测研究的重点，并逐步地为国际检测标准和国际各检测实验室所采用。到目前为止，已有相当部分的转基因植物品系的品系特异性检测方法的报道，例如Roundup Ready大豆、MON810玉米、NK603玉米、T25玉米、Bt11玉米等，但是还没有关于MON863玉米品系特异性PCR检测方法的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种遗传改良玉米品系MON863的品系特异性PCR检测方法。依据MON863玉米外源插入载体的旁邻序列，设计特异性的定性、定量PCR引物和探针，优化定性、定量PCR反应的体系和条件，建立MON863玉米品系的5’和3’端品系特异性定性、定量PCR检测方法，所建立的转基因品系特异性检测方法是较转基因筛选PCR检测、基因特异性PCR检测和构建特异性PCR检测方法更加特异的PCR检测方法。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明适合于MON863玉米及其加工产品的品系特异性PCR检测，其中包括以玉米基因组和外源插入载体5’端的CaMV35S启动子的邻接区DNA序列为目的扩增片段的5’端品系特异性检测方法；以外源插入载体3’端的tahsp 17 3’终止子和玉米基因组的邻接区DNA序列为目的扩增片段的3’端品系特异性检测方法。具体包括如下步骤适合于MON863玉米及其加工产品的品系特异性PCR检测，其中包括以玉米基因组和外源插入载体5’端的CaMV35S启动子的邻接区DNA序列为目的扩增片段的5’端品系特异性检测方法；以外源插入载体3’端的tahsp 17 3’终止子和玉米基因组的邻接区DNA序列为目的扩增片段的3’端品系特异性检测方法。
具体包括如下步骤①.MON863玉米的外源插入载体旁邻基因序列分析，5’端旁邻基因序列包括玉米基因组序列和外源插入载体CaMV35S启动子的5’端部分序列；3’端旁邻基因序列包括玉米基因组序列和外源插入载体tahsp 17 3’终止子的3’端部分序列；②.品系特异性定性PCR引物和定量PCR引物和探针设计所述的品系特异性定性PCR引物，指的是长度为22±4Nt的寡核苷酸链，其与MON863玉米旁邻基因序列完全互补或者相同。MON863玉米品系的5’端品系特异性定性PCR引物扩增的目的片段大小是411bp；MON863玉米品系的3’端品系特异性定性PCR引物扩增的目的片段大小是200bp。
所述的品系特异性定量PCR引物，指的是长度为25±5Nt的寡核苷酸链，其与MON863玉米旁邻基因序列完全互补或者相同。MON863玉米品系的5’端品系特异性定性PCR引物扩增的目的片段大小是90bp；MON863玉米品系的3’端品系特异性定性PCR引物扩增的目的片段大小是150bp。
所述的品系特异性定量PCR探针，指的是长度为30±5Nt的寡核苷酸链，其5’端标记着FAM荧光激发基团，3’端或寡核苷酸链中间标记着TAMRA荧光淬灭基团；其与MON863玉米旁邻基因序列完全互补或者相同；其与定量PCR引物结合组成一套定量PCR反应体系。
③.品系特异性定性、定量PCR体系的建立和优化，品系特异性定性PCR体系，是长度为22±4Nt的寡核苷酸链，其与MON863玉米旁邻基因序列完全互补或者相同，品系特异性定量PCR体系，是长度为25±5Nt的寡核苷酸链，其与MON863玉米旁邻基因序列完全互补或者相同；④.品系特异性定性、定量PCR检测方法验证，定性PCR检测方法验证包括建立的品系特异性定性PCR扩增的特异性片段只能在MON863玉米基因组中扩增获得，定量PCR检测方法验证包括建立的品系特异性定量PCR体系，只能在MON863玉米基因组中扩增并检测到荧光信号。
所述的MON863玉米的外源插入载体旁邻基因序列，指的是MON863玉米中外源插入载体和玉米基因组邻接区的序列。
所述的品系特异性定性PCR体系的建立和优化，指的是，通过100-1000nM范围内各个浓度的引物的组合，寻找所要求的反应效率和曲线的反应体系。
所述的品系特异性定性PCR体系的建立和优化，指的是，通过100-1000nM范围内各个浓度的引物和探针的组合，寻找所要求的反应效率和曲线的反应体系。
所述的品系特异性定性PCR检测方法验证，包括两个部分。其中，第一部分指的是建立的品系特异性定性PCR扩增的特异性片段只能在MON863玉米基因组中扩增获得，而不能在其他遗传改良玉米品系(MON810、Bt11、Bt176、GA21、NK603、TC1507等)，和其他基因遗传改良植物(Roundup Ready大豆、GT73油菜、华番一号番茄和MON531棉花等)基因组中扩增得到；第二部分指的是建立的品系特异性定性PCR体系的灵敏度检测。建立的PCR体系必须具有非常高的灵敏度，能够检测到低至转基因含量为0.1％的极限。
所述的品系特异性定量PCR检测方法验证，包括两个部分。其中，第一部分指的是建立的品系特异性定量PCR体系，只能在MON863玉米基因组中扩增并检测到荧光信号，而不能在其他遗传改良玉米品系(MON810、Bt11、Bt176、GA21、NK603、TC1507等)，和其他基因遗传改良植物(Roundup Ready大豆、GT73油菜、华番一号番茄和MON531棉花等)基因组中扩增并检测到荧光信号；第二部分指的是建立的品系特异性定量PCR体系的检测极限测试和标准曲线的构建。定量PCR体系的检测极限测试和标准曲线的构建方法是，用一组用梯度稀释法将其分别稀释为200、20、2、0.2、0.02、0.002ng/μL的纯合MON863玉米基因组DNA溶液，分别取1μL上述稀释的DNA溶液进行定量PCR扩增，每个反应重复三次，根据定量PCR扩增的循环数和扩增荧光信号的线性关系确定检测极限和标准曲线。
本发明首次利用MON863玉米品系的外源插入载体的旁邻序列，设计了特异性的定性、定量PCR引物和探针，建立了高度灵敏、特异性的玉米MON863的品系特异性定性、定量PCR检测方法。本发明所建立的转基因品系特异性检测方法是较转基因筛选检测、基因特异性检测和构建特异性检测方法更加特异的高效检测方法，符合国际上转基因植物及其加工产品检测方法研究的趋势，推动了MON863玉米标准检测方法建立的进程。本发明利用玉米基因组和外源插入载体5’端的CaMV35S启动子的邻接区DNA序列，以及外源插入载体3’端的tahsp17 3’终止子和玉米基因组的邻接区DNA序列，设计特异性的定性PCR引物、定量TaqMan PCR引物和探针，优化相应的定性、定量PCR反应的反应体系及反应条件，建立MON863玉米的品系特异性PCR检测方法。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1一.实验材料1、植物材料基因遗传改良玉米品系MON863玉米、MON810玉米、Bt11玉米、Bt176玉米、TC1507玉米、6A21玉米等。
常规玉米其他转基因植物Roundup Ready大豆、GT73油菜、MON531棉花、“华番一号”番茄等。
2、酶与试剂植物基因组DNA提取试剂盒为上海市农业科学院和上海出入境检验检疫局联合研制的食品DNA抽提试剂盒。
dNTPs、Taq DNA聚合酶及其缓冲液、DL2000 Marker购自大连宝生物工程有限公司。随机引物、TaqMan探针及引物由上海博亚生物工程有限公司合成。
其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。
3.实验仪器DY-501型核酸电泳仪(上海精密科学仪器有限公司)PTC-100型PCR扩增仪(MJ Research Inc.)Rotor-Gene 2000定量PCR仪(Corbett Research，Australia)BECKMAN公司的DUR 640核酸和蛋白分析仪DNA测序仪(Applied Biosystem377型全自动荧光序列分析仪)DNA电泳分析系统包括暗箱、数码照相机、计算机、扫描仪、喷墨打印机、光敏打印机、Tanon UV-2000紫外分析仪、Gis凝胶图象分析软件(上海天能公司)其他仪器包括离心机，恒温水浴锅，培养箱，天平等。
二、实验方法与过程1、植物基因组DNA提取与检测1)植物DNA提取取适量的玉米样品放在研钵中，加入液氮将样品研磨成粉末，称取约70mg-100mg磨碎的样品转入1.5ml的Eppendorf管中；
视材料量的多少，加入600-700μl已预热的Buffer A，轻轻混匀后，65℃水浴保温1小时，期间间或振荡混匀；在管中加入等体积酚/氯仿(600-700μl)，上下颠倒充分混匀，静置抽提10min；12000rpm离心10分钟，吸取上清到一新的Eppendorf管中；加入与上清等体积的异丙醇(约600μl)，混匀，常温放置10min后，12000rpm离心10min，去上清，保留沉淀；在沉淀中加入60μl TER，37℃放置2min后用枪头将其充分混匀后，于37℃放置约1小时；取出后补加140μl TE，再加入200μl酚/氯仿，混匀，静置片刻；12000rpm离心5min，取上清(约180μl)，加入1/10体积3M NaAc和2倍体积无水乙醇，-20℃放置30min；12000rpm离心10min，去上清，加75％乙醇200μl，12000rpm离心5min，弃上清，室温晾干，溶于50μl无菌ddH2O中。
2)DNA检测取3ul提取的DNA溶液，以1％的琼脂糖凝胶电泳，根据其亮度和扩散程度来判断DNA的质量。
利用紫外分光光度计测定所提DNA的浓度与纯度。
2、MON863玉米品系特异性定性PCR检测的引物设计根据获得的MON863玉米品系的外源插入载体的旁邻序列，利用引物设计软件primer 5.0设计两对定性PCR引物，分别扩增MON863玉米的外源插入载体与玉米基因组的5’和3’邻接区序列，其中，在每对引物中，一条位于玉米基因组上，另一条位于外源插入载体上。具体的引物序列见表1。
表1.MON863玉米定性品系特异性检测引物序列检测体系 名称 序列(5’-3’)扩增长度(bp)5’端品系特 引物1GCACTCAAAGACCTGGCGAATGA411异性 引物2CCATCTTTGGGACCACTGTCG
3’端品系特 引物6 GGCGATGAATAAATGAGAAATA200异性 引物7 TAGCCAGTTCATTGCGAGTA3、MON863玉米品系特异性定量PCR检测的引物及探针设计根据获得的MON863玉米品系的外源插入载体的旁邻序列，利用引物设计软件Primer Express2.0设计两对TaqMan定量PCR引物和探针，分别扩增MON863玉米的外源插入载体5’和3’端与玉米基因组的邻接区序列，其中，在每组引物中，一条位于玉米基因组上，另一条位于外源插入载体上，探针位于玉米基因组与外源插入载体临界的序列上。具体的引物序列见表2。
表2.MON863玉米定量品系特异性检测引物和探针序列检测名扩增长序列(5’-3’)体称 度(bp)系引5’物CCTACTTGTTCGGATGGGTGTT端3品引系物 CTTCCTTTTCTACTGTCCTTTTGATGA 90特4异探FAM性针AGTGTACCAAGCT(TAMARA)TTCCGATCCTACCTGTCA53’引端物 GAAATAAATTGTTCTGATTTTGAGTGCAA 150品8系引特物 ATATGATACAACCATATCTAAATGGAACTTT异9
性探FAM TCACTATGCTCTGCTCTATAGGGAGACCGAATT针TAMRA104、MON863玉米品系特异性定性PCR检测方法的特异性分析优化MON863玉米定性品系特异性PCR检测体系及反应条件，分别以多种不同的转基因玉米品系和其他转基因植物为检测模板定性扩增品系特异性的目的片段，确定建立的MON863玉米品系特异性检测方法的特异性。
5、MON863玉米品系特异性定性PCR检测方法的灵敏度分析将纯化的纯合MON863玉米基因组DNA溶液与非转基因玉米基因组DNA混合，混合DNA溶液终浓度为100ng/μL，分别含有10％，5.0％，3.0％，1.0％，0.5％，0.1％，0.01％的转基因MON863玉米成分，分别取1μL上述稀释的DNA溶液进行定性PCR扩增，确定MON863玉米品系特异性定性PCR检测方法的检测灵敏度。
6、MON863玉米品系特异性定量PCR检测方法的特异性分析优化MON863玉米品系特异性定量PCR检测体系及反应条件，分别以多种不同的转基因玉米品系和其他转基因植物为检测模板定量扩增品系特异性的目的片段，确定建立的MON863玉米品系特异性定量检测方法的特异性。
7、MON863玉米品系特异性定量PCR检测方法的灵敏度分析将纯化的纯合MON863玉米基因组DNA溶液，用梯度稀释法将其分别稀释为200、20、2、0.2、0.02、0.002ng/μL的DNA溶液，分别取1μL上述稀释的DNA溶液进行定量PCR扩增，每个反应重复三次，根据定量PCR扩增的标准曲线和扩增荧光信号的线性关系确定MON863玉米品系特异性定量PCR检测方法的灵敏度。
三、实验结果1、MON863玉米品系的5’端品系特异性定性PCR检测体系及条件经过优化，MON863玉米品系的5’端品系特异性定性PCR检测的体系见表3；PCR扩增条件见表6。
表3.MON863玉米5’端品系特异性定性PCR检测体系反应试剂体积(μL) 终浓度
10×PCR 1×(50mM KCl，10mM Tris-HCl，PH8.3，1.5mM3Buffer MgCl2)dNTPs 3 200μM引物1 1 100nM引物2 1 100nMTaq酶 1.5 1.5unit/reactionDNA模板1ddH2O 补足至30μl表4.MON863玉米品系特异性定性PCR检测扩增条件循环数 温度(℃) 时间1 94 10min94 30sec35 60 30sec72 30sec1 72 7min2、MON863玉米品系的3’端品系特异性定性PCR检测体系及反应条件经过优化，MON863玉米品系的3’端品系特异性定性PCR检测的体系见表5；PCR扩增条件见表4。
表5.MON863玉米3’端品系特异性定性PCR检测体系反应试剂体积(μl) 终浓度10×PCR 1×(50mM KCl，10mM Tris-HCl，PH8.3，1.5mM3Buffer MgCl2)dNTPs 3200μM引物6 1100nM引物7 1100nMTaq酶 1.5 1.5unit/reactionDNA模板 1ddH2O 补足至30μl
3、MON863玉米品系的5’端品系特异性定性PCR检测方法的特异性检测以特异性引物1和2建立的定性PCR扩增结果表明，在MON863玉米基因组中扩增得到了目的片段大小的条带(411bp)，在MON810、GA21、T25、Bt11和Event176玉米、Roundup Ready大豆和常规玉米基因组中没有扩增得到目的片段大小的条带。通过测序分析表明MON863基因组中扩增获得的的序列与目的扩增片段序列一致。上述结果表明引物1和2建立的MON863玉米5’端品系特异性PCR检测体系具有高度特异性。
4、MON863玉米品系的5’端品系特异性定性PCR检测方法的灵敏度检测以特异性引物1和2建立的的定性PCR灵敏度扩增结果显示，MON863玉米成分为10％，5.0％，3.0％，1.0％，0.5％，0.1％的PCR反应中都扩增出了目的片段大小的条带，而MON863玉米含量为0.01％时没有扩增出目的片段大小的条带，说明MON863玉米品系的5’端品系特异性定性PCR检测体系的检测灵敏度为0.1％。
5、MON863玉米品系的3’端品系特异性定性PCR检测方法的特异性检测以特异性引物6和7建立的定性PCR扩增结果表明，在MON863玉米基因组中扩增得到了目的片段大小的条带(200bp)，在MON810、GA21、T25、Bt11和Event176玉米、Roundup Ready大豆和常规玉米基因组中没有扩增得到目的片段大小的条带。通过测序分析表明转基因MON863基因组中扩增获得的目的片段大小的条带的序列与目的扩增片段序列一致。以特异性引物6和7建立的MON863玉米3’端品系特异性PCR检测体系具有很好的特异性。
6、MON863玉米品系的3’端品系特异性定性PCR检测方法的灵敏度检测以特异性引物6和7建立的定性PCR灵敏度扩增结果显示，在MON863玉米成分为10％，5.0％，3.0％，1.0％，0.5％，0.1％的PCR反应中都扩增出了目的片段大小的条带，而MON863玉米含量为0.01％时没有扩增出目的片段大小的条带，说明MON863玉米品系的3’端品系特异性定性PCR检测体系的检测灵敏度为0.1％。
7、MON863玉米品系的5’端品系特异性定量PCR检测体系及反应条件经过优化，MON863玉米品系的5’端品系特异性定量PCR检测的体系见表6；PCR扩增条件见表7。
表6.MON863玉米5’端品系特异性定量PCR检测体系反应试剂 体积(μl) 终浓度5×PCR Buffer 51×(50mM KCl，10mM Tris-HCl，PH8.3)MgCl266mM400μM dATP，dGTP，dCTP；800μMdNTPs 3dUTP引物3 0.6 600nM引物4 0.6 600nM探针5 0.9 450nMHotstar Taq酶 1.5 1.5unit/reactionUNG酶 0.2 0.2unit/reactionDNA模板 1ddH2O补足至25μl表7.MON863玉米品系特异性定量PCR检测扩增条件循环数温度(℃) 时间1 50 2min1 95 10min94 30sec4560 30sec72 30sec1 72 7min8、MON863玉米品系的3’端品系特异性定量PCR检测体系及反应条件经过优化，MON863玉米品系的3’端定量品系特异性PCR检测的体系见表8；PCR扩增条件见表7。
表8.MON863玉米3’端定量品系特异性PCR检测体系反应试剂 体积(μl) 终浓度5×PCR Buffer 5 1×(50mM KCl，10mM Tris-HCl，PH8.3)
MgCl26 6mM400μM dATP，dGTP，dCTP；dNTPs 3800μM dUTP引物8 0.6 600nM引物9 0.6 600nM探针10 0.6 600nMHotstar Taq酶 1.5 1.5unit/reactionUNG酶 0.2 0.2unit/reactionDNA模板1ddH2O 补足至25μl9、MON863玉米品系的5’端品系特异性定量PCR检测方法的特异性检测以特异性引物3，4和探针5建立的定量PCR扩增结果表明，在转基因MON863玉米基因组为模板的扩增反应中检测到了明显的荧光信号，而在MON810、GA21、T25、Bt11和Event176玉米、转基因Roundup Ready大豆和常规玉米基因组的扩增反应中没有检测到明显的荧光信号。上述结果表明利用特异性引物3，4和探针5建立的的MON863玉米5’端品系特异性的定量PCR检测体系具有很好的特异性。
10、MON863玉米品系的3’端品系特异性定量PCR检测方法的特异性检测以特异性引物8，9和探针10建立的定量PCR扩增结果表明，在转基因MON863玉米基因组为模板的扩增反应中检测到了明显的荧光信号，而在MON810、GA21、T25、Bt11和Event176玉米、转基因Roundup Ready大豆和常规玉米基因组的扩增反应中没有检测到明显的荧光信号。上述结果表明利用特异性引物8，9和探针10建立的MON863玉米3’端品系特异性的定量PCR检测体系具有很好的特异性。
11、MON863玉米品系的5’端品系特异性定量PCR检测方法的灵敏度检测利用优化的MON863玉米5’端品系特异性定量PCR检测体系，一组浓度分别为200、20、2、0.2、0.02、0.002ng/μL的MON863玉米基因组DNA溶液用来构建该定量PCR检测系统的定量标准曲线，以及确定该系统的定量检测灵敏度，构建的标准曲线及扩增荧光信号与循环数的线性关系，该系统的定量检测灵敏度为20pg玉米基因组DNA，相当于7个拷贝的玉米单倍体基因组。从定量标准曲线和检测灵敏度的结果可以认为，本研究建立的MON863玉米5’端品系特异性定量PCR检测系统具有很高的准确性和灵敏度，完全可以用于MON863玉米及其加工产品的实际检测。
12、MON863玉米品系的3’端品系特异性定量PCR检测方法的灵敏度检测利用优化的MON863玉米3’端品系特异性定量PCR检测体系，一组浓度分别为200、20、2、0.2、0.02、0.002ng/μL的MON863玉米基因组DNA溶液用来构建该定量PCR检测系统的定量标准曲线，以及确定该系统的定量检测灵敏度，构建的标准曲线及扩增荧光信号与循环数的线性关系，该系统的定量检测灵敏度为20pg玉米基因组DNA，相当于7个拷贝的玉米单倍体基因组。从定量标准曲线和检测灵敏度的结果可以认为，本研究建立的MON863玉米3’端品系特异性定量PCR检测系统具有很高的准确性和灵敏度，完全可以用于MON863玉米及其加工产品的实际检测。
权利要求
1.一种遗传改良玉米品系MON863的品系特异性PCR检测方法，其特征在于，适合于MON863玉米及其加工产品的品系特异性PCR检测，其中包括以玉米基因组和外源插入载体5’端的CaMV35S启动子的邻接区DNA序列为目的扩增片段的5’端品系特异性检测方法；以外源插入载体3’端的tahsp 17 3’终止子和玉米基因组的邻接区DNA序列为目的扩增片段的3’端品系特异性检测方法。
2.根据权利要求1所述的遗传改良玉米品系MON863的品系特异性PCR检测方法，其特征是，具体包括如下步骤①.MON863玉米的外源插入载体旁邻基因序列分析，5’端旁邻基因序列包括玉米基因组序列和外源插入载体CaMV35S启动子的5’端部分序列；3’端旁邻基因序列包括玉米基因组序列和外源插入载体tahsp 17 3’终止子的3’端部分序列；②.品系特异性定性PCR引物和定量PCR引物和探针设计，所述的品系特异性定性PCR引物，指的是长度为22±4Nt的寡核苷酸链，其与MON863玉米旁邻基因序列完全互补或者相同，所述的品系特异性定量PCR引物，指的是长度为25±5Nt的寡核苷酸链，其与MON863玉米旁邻基因序列完全互补或者相同，所述的品系特异性定量PCR探针，指的是长度为30±5Nt的寡核苷酸链，其5’端标记着FAM荧光激发基团，3’端或寡核苷酸链中间标记着TAMRA荧光淬灭基团；③.品系特异性定性、定量PCR体系的建立和优化，品系特异性定性PCR体系，是长度为22±4Nt的寡核苷酸链，其与MON863玉米旁邻基因序列完全互补或者相同，品系特异性定量PCR体系，是长度为25±5Nt的寡核苷酸链，其与MON863玉米旁邻基因序列完全互补或者相同；④.品系特异性定性、定量PCR检测方法验证，定性PCR检测方法验证包括建立的品系特异性定性PCR扩增的特异性片段只能在MON863玉米基因组中扩增获得，定量PCR检测方法验证包括建立的品系特异性定量PCR体系，只能在MON863玉米基因组中扩增并检测到荧光信号。
3.根据权利要求1所述的遗传改良玉米品系MON863的品系特异性PCR检测方法，其特征是，所述的MON863玉米的外源插入载体旁邻基因序列，指的是MON863玉米中外源插入载体和玉米基因组邻接区的序列。
4.根据权利要求1所述的遗传改良玉米品系MON863的品系特异性PCR检测方法，其特征是，所述的品系特异性定性PCR体系的建立和优化，指的是，通过100-1000nM范围内各个浓度的引物的组合，寻找所要求的反应效率和曲线的反应体系。
5.根据权利要求1所述的遗传改良玉米品系MON863的品系特异性PCR检测方法，其特征是，所述的品系特异性定性PCR体系的建立和优化，指的是，通过100-1000nM范围内各个浓度的引物和探针的组合，寻找所要求的反应效率和曲线的反应体系。
6.根据权利要求1所述的遗传改良玉米品系MON863的品系特异性PCR检测方法，其特征是，所述的品系特异性定性PCR检测方法验证，能够检测到低至转基因含量为0.1％的极限。
7.根据权利要求1所述的遗传改良玉米品系MON863的品系特异性PCR检测方法，其特征是，所述的品系特异性定量PCR检测方法验证，建立其极限测试和标准曲线的构建方法是，用一组用梯度稀释法将其分别稀释为200、20、2、0.2、0.02、0.002ng/μL的纯合MON863玉米基因组DNA溶液，分别取1μL上述稀释的DNA溶液进行定量PCR扩增，每个反应重复三次，根据定量PCR扩增的循环数和扩增荧光信号的线性关系确定检测极限和标准曲线。
全文摘要
一种遗传改良玉米品系MON863的品系特异性PCR检测方法，本发明适合于MON863玉米及其加工产品的品系特异性PCR检测，其中包括以玉米基因组和外源插入载体5’端的CaMV35S启动子的邻接区DNA序列为目的扩增片段的5’端品系特异性检测方法；以外源插入载体3’端的tahsp 17 3’终止子和玉米基因组的邻接区DNA序列为目的扩增片段的3’端品系特异性检测方法。通过①MON863玉米的外源插入载体旁邻基因序列分析；②品系特异性定性PCR引物和定量PCR引物和探针设计；③品系特异性定性、定量PCR体系的建立和优化；④品系特异性定性、定量PCR检测方法验证，来建立遗传改良玉米品系MON863的品系特异性PCR检测平台。
文档编号C12Q1/68GK1724689SQ20051002794
公开日2006年1月25日 申请日期2005年7月21日 优先权日2005年7月21日
发明者张大兵, 杨立桃, 潘爱虎, 梁婉琪, 许诵辞, 尹长松, 章可为 申请人:上海交通大学