专利名称：一种改良小麦品质的方法
技术领域：
本发明涉及一种改良小麦品质的方法。
背景技术：
小麦是一种异源六倍体作物，包含A、B和D三个基因组，基因组大小为17Gb，是人 类基因组的5倍，仅3B染色体就是水稻整个基因组的2倍多。由于小麦是世界上三大重要 粮食作物之一，为全世界约35%人口的主粮。因此小麦的研究工作一直是各国研究的重点 (Paux等，2008)。小麦面粉和面团具有独特的物理特性-粘弹性和延展性，因此可以用来 制作面包、披萨、面条、馒头、糕点、饼干等多种专用食品。种子蛋白的组成和含量在很大程 度上决定了小麦加工品质的优劣。小麦是人类粮食消费中重要的蛋白质来源，小麦籽粒蛋白按其功能可分为两大 类一类为谷醇溶蛋白，包括麦醇溶蛋白(Gliadins)和麦谷蛋白(Glutenins);另一类为非 醇溶蛋白，由水溶性的清蛋白和盐溶性的球蛋白组成。麦醇溶蛋白和麦谷蛋白称为小麦贮 减蛋白，约占杆粒蛋白总量的85%左右(Majoul等,2004)。麦醇溶蛋白王要包括ct / PY 和o四种类型，主要影响面团的延展性(Metakovsky等，1984)。麦谷蛋白包括高分子量谷 蛋白亚基(high molecular weight glutenin subunit; HMW-GS)和低分子量谷蛋白亚基 (low molecular weight glutenin subunit; LMW-GS)两种，分别占胚乳总蛋白含量的 10% 和40%左右(Payne, 1987)。研究表明，HMW-GS主要赋予面团的弹性，LMW-GS赋予面团的粘 性(Ma等，2005)。尽管HMW-GS的含量仅占小麦种子蛋白的5-10%，但面包的烘烤参数变异 大概有 67% 受其影响(Branlard 和 Dardevet, 1985 ；Payne 等，1988 ；Ng 和 Bushuk, 1988 ； He等，2005)。因此HMW-GS与面包烘烤有着密切的关系。HMW-GS由位于1号同源染色群的1A、1B和1D的Glu_l位点编码(D’ Ovidio和 Masci，2004)。每个位点包括两个紧密连锁的基因，一个编码稍微大些的x_型亚基(分子量 为80-88 KDa)，另一个编码稍小些的y-型亚基(67-73 KDa) (Mackie等，1996)。这两种亚 基的主要差别是半胱氨酸含量和重复区的motifs组成不同(Shewry等，2003)。目前有20 个以上HMW-GS基因已经在面包小麦中克隆(Juhdsz等，2003 ；Li等，2004 ；Pang和Zhang, 2008 ;Yan等，2009 Jiang等，2009)。然而普通小麦中的HMW-GS基因变异很小，并且理论上 可以表达6个HMW-GS基因的普通小麦品种，往往只表达3-5个基因(一般有1_3个基因沉 默)。不同亚基组成对小麦品质的影响是不相同的，研究结果表明，含有lDx5+lDylO、lAxl、 lBy8和lBxl3+lByl6的面团具有高的弹性，更适合做面包；而lDx2+lDyl2和1Bx20在谷 蛋白品质上却起负作用，因此含有这些亚基的小麦不适合面包烘烤(Payne, 1987 ；Shewry 等，1992，2003 ；Pang 和 Zhang, 2008 ；Yan 等，2009)。HMW-GS等位变异对小麦加工品质有着重要的影响，目前尽管有大量的HMW-GS 基因的克隆，但是还没有发现对品质影响超过lDx5+lDylO的谷蛋白组合的亚基。由于 lDx5+lDylO是由欧洲学者首先发现，因此到目前为止我国还没有获得具有自主知识产权、 被广泛证实对品质有重要作用的优质HMW-GS基因。
发明内容
HMW-GS对面包的烘烤品质所起的重要作用已经被众多的研究者所证实 (Wrigley, 1996)。目前仅有少数的优质亚基如1Dx5、IDylO、lAxl等应用于小麦的转基因 育种上。因此，可以从小麦近缘种中鉴定、分离新的优质亚基基因，通过转基因方法或者传 统杂交育种方法来改良小麦品种的烘烤品质。本发明的目的是提供一种改良小麦品质的方法。具体方法是通过多次杂交和回交 转育以及分子细胞遗传学鉴定方法将高大山羊草longissima, 2n=14, S^1)中 的S1基因组代换普通小麦中国春中的1B基因组，培育中国春SVIB代换系，S1基因组编码 的蛋白X和蛋白Y基因导入普通小麦后面包品质得到显著改善。所述蛋白X是如下1)或2):
1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加且与小麦品质相关的由序列1衍生的蛋白质；
所述蛋白Y是如下3)或4):
3)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
4)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加且与小麦品质相关的由序列3衍生的蛋白质。所述蛋白X的编码基因是如下a)至c)中任一所述的DNA分子
a)序列表中序列2所示的DNA分子；
b)在严格条件下与a)限定的DNA序列杂交且编码与小麦品质相关蛋白的DNA分子；
c)与a)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码与小麦品质相关蛋白的DNA分子； 所述蛋白Y的编码基因是如下d)至f)中任一所述的DNA分子
d)序列表中序列4所示的DNA分子；
e)在严格条件下与d)限定的DNA序列杂交且编码与小麦品质相关蛋白的DNA分子；
f)与d)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码与小麦品质相关蛋白的DNA分子。所述小麦的品质为如下至少一种品质
(1)干、湿筋谷蛋白含量；
(2)和面时间；
(3)8分钟宽度；
(4)8分钟面积；
(5)SDS沉降值；
(6)面包体积。上述严格条件可为在0. 1XSSPE (或0. 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65°C条件 下杂交并洗膜。上述蛋白X和/或蛋白Y、以及蛋白X和/或蛋白Y的编码基因也属于本发明的保 护范围。本发明还保护含有蛋白X和/或蛋白Y的编码基因的重组载体、表达盒、转基因细 胞系或重组菌；以及扩增蛋白X和/或蛋白Y编码基因全长或其任意片段的引物对。
另外，蛋白X和/或蛋白Y、蛋白X和/或蛋白Y的编码基因、以及含有蛋白X和 /或蛋白Y编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在小麦品质改良中的应用 也属于本发明的保护范围。本发明通过杂交、回交转育以及分子细胞遗传学鉴定方法将小麦近缘基因组编码 的优质HMW-GS基因转到普通小麦中去，进而改良小麦品质。即本发明从小麦B基因组的 近缘基因组入手，以高大山羊草longissima,2n-\\, S1S1)和中国春 aestivum cv. Chinese Spring)为材料获得了 IS1代换IB染色体的中国春-高大山羊草 代换系(CS-1SV1B)。品质參数分析证实，将IS1染色体代换中国春IB染色体后，面包品质 得到了显著改善。因此，本发明方法可用于定向改良小麦品质，对小麦品质育种具有重要应 用价值。
图I为中国春-高大山羊草代换系小麦CS-1S71B谷蛋白的分离与鉴定結果。图2为1S42. 3*和1S\16*亚基基因在大肠杆菌中的表达与鉴定。图3为中国春和代换系的和面品质參数和面包烘烤品质的比较結果。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值。实施例I、中国春-高大山羊草代换系小麦CS-ISVlB的获得 中国春-高大山羊草代换系小麦CS-ISVlB的具体培育方法如下
I、双二倍体的获得
将中国春小麦(Yan等，J Cereal Sci 2009 (50): 398-406)和高大山羊草(Wang等， Genome 2011 (54) : 273-284)杂交得到F1代，由于F1代不育(染色体组成为21+7)，利用 秋水仙素处理F1代使其染色体加倍，得到中国春-高大山羊草双二倍体(染色体组成为 42+14)。2、中国春-高大山羊草附加系的获得
将上述步骤I获得的双二倍体和中国春小麦进行多次回交，结合染色体数目和形态观 察以及分子标记鉴定，得到含有44条染色体的中国春-高大山羊草附加系(42条小麦染色 体+ I对IS1染色体)。3、中国春-高大山羊草代换系的获得
将上述步骤2获得的中国春-高大山羊草附加系和中国春小麦IB单体系(CS monosomic IB八参考又献Sears, 1954 The aneuploids of common wheat. Res Bull Univ Mo. USA 572:1-59)，进行杂交，选育得到中国春-高大山羊草代换系小麦CS-1SV1B。上述获得的中国春-高大山羊草代换系小麦CS-1S71B和中国春小麦的的区别在 于用亚基1S42. 3*和1SV16*代替了亚基1Bx7和lBy8，既中国春-高大山羊草代换系小 麦CS-ISVlB的高分子量谷蛋白亚基组成为(1^2. 3*+lsVl6*, !Dx2+lDyl2),中国春小麦的高分子量谷蛋白亚基组成为(lBx7+lBy8，lDx2+lDyl2)。实施例2、中国春-高大山羊草代换系小麦(CS-1SV1B)高分子量谷蛋白1SS2. 3* 和lsVie*亚基的鉴定
(1)中国春-高大山羊草代换系小麦(CS-1SV1B) HMW-GS的提取 取30mg中国春代换系(CS-1SV1B)的面粉放入1.5 ml离心管中，加入1 ml体积百分 含量为70%的乙醇水溶液，润旋30 min, 13000 rpm离心10 min,去上清；加入1ml体积百 分含量为55%的异丙醇水溶液，混匀，65 °C水浴30 min, 13000 rpm离心10 min，去上清。 此步骤重复3次(中间每隔10 min晃动一次)。加入150 yl溶液B (质量百分含量为1% 的二硫苏糖醇DTT水溶液),65 °C水浴30 min ； 13000 rpm离心15 min,取60 ii 1上清至 一新的离心管中，然后加入40 yl预冷的丙酮，-20 °C沉淀过夜。第2天13000 rpm离心 15 min，去上清，加入90 yl溶液B (溶液B含有质量百分含量为1%的二硫苏糖醇DTT、体 积百分含量为55%的异丙醇和0. 08mol/l pH值8. 0的Tris-HCl )，65 ° C水浴30 min ;取 60 yl上清至一新的离心管中，然后加入40 yl预冷的丙酮，-20 ° C沉淀过夜。第3天 13000 rpm离心15 min，去上清，充分干燥后，利用含有0. 5% TFA和50%乙腈的水溶液(将 TFA和乙腈溶解在水中，使其在水溶液中的质量百分含量分别为0. 5 %和50 %)溶解。用作SDS-PAGE分离的谷蛋白，省去上述丙酮沉淀的步骤，体积百分含量为55%的 异丙醇水溶液洗涤后，先后加入溶液B和溶液C (溶液C含有体积百分含量为1. 4%的4-乙 烯吡啶、体积百分含量为55%的异丙醇和0. 08mol/l pH值8. 0的Tris_HCl)各100 u 1 ； 65 °C水浴30 min, 13000 rpm离心10 min ;取上清，加入等体积的谷蛋白上样buffer (上 样buffer的组成如下2%的SDS、0. 02%的溴酚蓝、0. 08 mol/1的Tris-HCl和40%的甘油)， 65 °C 水浴 30 min, 13000 rpm 离心 5 min, SDS-PAGE 上样。(2) HMW谷蛋白亚基的鉴定 A. SDS-PAGE 电泳
利用Boi-Rad Mini-PROTEAN 3电泳槽、4%浓缩胶、12%分离胶，磷酸-甘氨酸缓冲 液系统，10mA电泳2小时，0. 1%考马斯亮蓝R-250染色，25 %甲醇和7%乙酸脱色，电泳 结果如图1 A所示。其中，SDS-PAGE条带上的数字代表标准亚基的名字，泳道上的数 字1-6代表小麦或者小麦近缘种，依次为中国春-高大山羊草代换系小麦CS-1SV1B(N， lSk. 3*+奶16*，lDx2+lDyl2)、中国春小麦 CS(N, lBx7+lBy8, lDx2+lDyl2)、MG315 (N, lBx7+lBy8, 1Dx2. 2*+lDyl2) (Wan 等，Theor Appl Genet 2005 (111): 1183-1190)、 MG7249(lAx2*，lBx7+lBy8, 1Dx2. 2+lDyl2) (Wan 等，Theor Appl Genet 2005 (111): 1183-1190)、济麦 20(lAxl, lBxl3+lByl6, lDx4+lDylO)(张秀华，《山东农业科学》2008 (6) :101-10)和 CB037(lAxl, lBxl7+lByl8, lDx2+lDyl2)(别晓敏等，《核农学报》2011 25(5) : 1023-1028)。其中，CS、CB037、济麦20为小麦品种的名称，MG315和MG7249为小麦 近缘种的名称。从图1A中可以看出，在代换系中出现了两条新的蛋白亚基，结合标准亚基图谱， 将新的亚基分别命名为lSk. 3*和1SV16*。B.高效液相色谱(HPLC)
利用waters公司生产的HPLC仪器进行谷蛋白的分离。具体参数如下
检测器DAD ；波长210 nm ；
柱温50 ° C ;
梯度55分钟内流动相乙腈的浓度由21 %升到48 % (v/v)；
流速1. 00 ml/min ；
样间冲洗时间15 min ；
进样量20 ill。高效液相色谱结果如图1 B所示。结果表明，两个新的高分子量亚基1S42. 3*+lSVl6*的疏水性跟lDx2+lDyl2很相 似，很难通过这种方法将新的亚基分离；但是这种方法可以很好的分析低分子量麦谷蛋白 亚基，从图1B中也可以看出，这两个小麦品种的低分子量麦谷蛋白亚基很相似。C. MALDI-T0F-MS
使用岛津AXIMA-CFRTMPlus型基质辅助激光解析附电离飞行质谱仪(配有软件用于系 统操作和数据处理)。取1 Ul上述步骤2提取的样品，加入9iU含有终浓度为10mg/ml芥 子酸的TFA乙腈水溶液(其中TFA和乙腈在水溶液中的质量百分含量分别为0. 5%和50%)， 混匀。然后取lu 1上述混合溶液点到MALDI-TOF盘子上，自然干燥后，重复1次。分子量测定范围50000-100000。结果如图1C所示。结果表明，质谱技术可以很好的鉴定这两个新的高分子量麦谷蛋白亚基，它们的 分子量分别为97797. 20和780165. 57。实施例3、中国春-高大山羊草代换系小麦CS-1SV1B高分子量谷蛋白1S\2. 3* 和1SV16*亚基基因的克隆
UAS-PCR引物设计
根据已发表的HMW谷蛋白相关基因保守序列设计了两对AS-PCR引物，SxlF/lR用于扩 增x型HMW谷蛋白亚基基因序列，SylF/lR用于扩增y-型HMW谷蛋白亚基基因序列。具体 引物序列如下
权利要求
1.一种改良小麦品质的方法，是将蛋白X和蛋白Y的编码基因导入出发小麦，获得转基 因小麦，所述转基因小麦的品质优于所述出发小麦的品质；所述蛋白X是如下1)或2):1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加且与小麦品质相关的由序列1衍生的蛋白质；所述蛋白Y是如下3)或4):3)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；4)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加且与小麦品质相关的由序列3衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述蛋白X的编码基因是如下a)至c)中 任一所述的DNA分子a)序列表中序列2所示的DNA分子；b)在严格条件下与a)限定的DNA序列杂交且编码与小麦品质相关蛋白的DNA分子；c)与a)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码与小麦品质相关蛋白的DNA分子； 所述蛋白Y的编码基因是如下d)至f)中任一所述的DNA分子d)序列表中序列4所示的DNA分子；e)在严格条件下与d)限定的DNA序列杂交且编码与小麦品质相关蛋白的DNA分子；f)与d)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码与小麦品质相关蛋白的DNA分子。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述小麦的品质为如下至少一种品质(1)干、湿筋谷蛋白含量；(2)和面时间；(3)8分钟宽度；(4)8分钟面积；(5)SDS沉降值；(6)面包体积。
4.一种蛋白，是如下1)或2):1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加且与小麦品质相关的由序列1衍生的蛋白质。
5.权利要求4所述蛋白的编码基因，其特征在于所述编码基因是如下a)至c)中任 一所述的DNA分子a)序列表中序列2所示的DNA分子；b)在严格条件下与a)限定的DNA序列杂交且编码与小麦品质相关蛋白的DNA分子；c)与a)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码与小麦品质相关蛋白的DNA分子。
6.一种蛋白，是如下3)或4):3)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；4)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与小麦品质相关的由序列3衍生的蛋白质。
7.权利要求6所述蛋白的编码基因，其特征在于所述编码基因是如下d)至f)中任 一所述的DNA分子d)序列表中序列4所示的DNA分子；e)在严格条件下与d)限定的DNA序列杂交且编码与小麦品质相关蛋白的DNA分子；f)与d)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码与小麦品质相关蛋白的DNA分子。
8.含有权利要求5和/或7所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
9.扩增权利要求5或7所述基因全长或其任意片段的引物对。
10.权利要求4和/或6所述蛋白、权利要求5和/或7所述编码基因、权利要求8所 述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在小麦品质改良中的应用；所述小麦品质为如下至少一种品质(1)干、湿筋谷蛋白含量；(2)和面时间；(3)8分钟宽度；(4)8分钟面积；(5)SDS沉降值；(6)面包体积。
全文摘要
本发明公开了一种改良小麦品质的方法。即从小麦B基因组的近缘基因组入手，以高大山羊草(Aegilopslongissima，2n=14,SlSl)和中国春(Triticumaestivumcv.ChineseSpring)为材料获得了1Sl代换1B染色体的中国春-高大山羊草代换系(CS-1Sl/1B)。品质参数初步分析证实，将1Sl染色体代换中国春1B染色体后，面包的品质得到了显著改善。因此，本发明方法可用于定向改良小麦的品质，对于小麦品质育种具有重要应用价值。
文档编号C12N15/11GK102719474SQ20121023187
公开日2012年10月10日 申请日期2012年7月6日 优先权日2012年7月6日
发明者于子桐, 晏月明, 李小辉, 沈锡喜, 王顺利, 马武军 申请人:首都师范大学