乙内酰脲消旋酶的制作方法

专利名称：乙内酰脲消旋酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有乙内酰脲消旋酶活性的分离的多肽。另外，本发明也涉及这些多肽的应用。
具有乙内酰脲消旋酶活性的多肽，也称为乙内酰脲消旋酶，是本领域已知的。已发现它们存在于多种生物体内，例如，WO 01/23582描述了来源于金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens)(DSM 3747)的乙内酰脲消旋酶，而JP04271784描述了来源于假单胞菌(Pseudomonas)NS 671的乙内酰脲消旋酶(Watabe等人，J.Bact.174；3461-66(1992))。乙内酰脲消旋酶在苜蓿根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)(acc.Nr.CAC 47181，Capela等人，PNAS 989877-9882(2001))、液化微杆菌(Microbacterium liquefaciens)(acc nr CAD 32593，EP 1.188.826)、以及根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)C58菌株(acc.nrs.AAL 45498，AAK88746和AAK 90298，Las Heras-Vazquez等人，Biochem Biophys Res Commun303541-547(2003)，Wood等人，Science 2001，2942317-23以及Hinkle等人，NCBI数据库，根癌农杆菌C58(放射根瘤菌(Rhizobium radiobacter)C58)的完整基因组序列，植物冠瘿病的致病因素，直接提交，于2001年8月14日提交)中也有描述。
在本发明的范围内，乙内酰脲消旋酶活性可理解为指催化被取代的D或L乙内酰脲的外消旋化的能力。
已知的乙内酰脲消旋酶的缺点是它们显示底物抑制，特别是对于L-5-甲巯基乙基乙内酰脲。例如，Wiese等人描述了从L-5-甲巯基乙基乙内酰脲的浓度为5mM时就发生对来自于金黄节杆菌DSM 3747的乙内酰脲消旋酶的底物抑制(J.Biotechn.80；217-230(2000))。来自于假单胞菌NS 671的乙内酰脲消旋酶也在相似的浓度表现出底物抑制(Watabe等人，J.Bact.174；3461-66(1992))。作为这一特性的结果，该酶只有在低底物浓度时才能被有效地应用。
需要一种不受底物抑制作用的乙内酰脲消旋酶，因为这可以容许被取代的D-或L-乙内酰脲的外消旋反应在较高的底物浓度下进行。这将有效地促进降低中间产物和终产物生产中的成本。
因此本发明的目的是提供不显示底物抑制的乙内酰脲消旋酶。
令人惊奇地，已经发现了不显示底物抑制的乙内酰脲消旋酶。因此，本发明通过提供可以从放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)获得的乙内酰脲消旋酶或其功能等同物来达到本发明的目的。SEQ IDNO.2和SEQ IDNO.4给出了来自于放射形土壤杆菌的乙内酰脲消旋酶的氨基酸序列。SEQ IDNO.4相比于SEQ IDNO.2在N端具有11个附加的氨基酸。SEQ IDNO.1给出了来源于放射形土壤杆菌的，编码SEQ IDNO.2所示氨基酸序列的核酸序列，而SEQ IDNO.3给出了来源于放射形土壤杆菌的，编码SEQ IDNO.4所示氨基酸序列的核酸序列。
在本发明的范围内，底物抑制可理解为指随底物浓度增加而酶的起始活性降低。
在本发明的范围内，可以获得自放射形土壤杆菌的乙内酰脲消旋酶的功能等同物在此定义为具有不受L-5-甲巯基乙基乙内酰脲底物抑制的乙内酰脲消旋酶活性的多肽。这些功能等同物中特别有用的实例是与SEQ IDNO.2或SEQIDNO.4具有至少87％，更优选至少90％，例如至少93％、95％、97％、98％或99％的同一性的多肽。可以获得自放射形土壤杆菌的乙内酰脲消旋酶及其功能等同物在此共同指本发明所述的乙内酰脲消旋酶或本发明所述的多肽。
本发明所述的具有乙内酰脲消旋酶活性的多肽与SEQ IDNO.2或SEQIDNO.4具有至少87％的同一性，优选与SEQ IDNO.2或SEQ IDNO.4具有至少90％的同一性，更优选地至少为95％，特别地至少为97％，更特别的至少为98％，甚至更特别的至少为99％，最特别的是与SEQ IDNO.2或SEQIDNO.4具有至少99.5％的同一性。
在本发明的范围内，两个氨基酸序列之间的同一性百分比是通过blast逐对序列比对算法(NCBI)的帮助来确定的，其具有同一性表及下述的序列对比参数错配＝-3，罚分＝-3，空位延伸＝1，匹配奖分＝1，空位x-droff＝50，期望值＝10，字长＝3。
本发明的另一个实施方案涉及具有不受底物抑制的乙内酰脲消旋酶活性的分离多肽，该多肽是由在高严谨条件下，优选特别高严谨的条件下，与SEQ IDNO.1或SEQ IDNO.3所示的核酸序列或其互补序列杂交的核酸序列所编码的。
杂交实验可以利用本领域已知的不同方法进行。对这些方法进行选择的常规指导方针可以参见例如Sambrook，J.，Fritsh，E.F，Maniatis，T.分子克隆实验室手册，第二版编辑，冷泉港实验室，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989的第9章。
杂交条件的严谨性可理解为进行由实际的杂交和洗涤步骤所组成的杂交的条件。洗涤步骤是用于，例如除去未与例如固定在硝酸纤维素膜上的靶核酸杂交的核酸。杂交条件的严谨度可以例如，通过改变洗涤液的盐浓度和/或洗涤步骤进行时的温度(洗涤温度)来改变。例如可以通过降低洗涤液的盐浓度或提高洗涤温度来提高杂交的严谨度。在本发明的范围内，杂交是在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，温度约为45℃下进行大约12小时。杂交条件的实例是在1×SSC、0.1％SDS中，在60℃(高严谨杂交条件)或65℃(特别高严谨的杂交条件)下连续洗涤两次，每次30分钟。
在另一实施方案中，本发明涉及具有不受底物抑制的乙内酰脲消旋酶活性的分离多肽，并且其显示与针对至少部分的SEQ IDNO.2或SEQ IDNO.4所示氨基酸序列的抗体发生免疫交叉反应。
免疫交叉反应可以通过利用针对根据本发明的具有乙内酰脲消旋酶活性的分离多肽的至少一个表位或与其反应的抗体制剂来证明。抗体制剂，可以是单克隆及多克隆抗体，可以利用本领域已知的方法生产。免疫交叉反应也可以用本领域已知的方法来证明。抗体的制备及免疫交叉反应的证明在例如，Hudson等人，实用免疫学(Practical Immunology)，第三版(1989)，Blackwell ScientificPublications中有描述。
本发明也涉及通过将可操作地连接到一个(或多个)编码标记多肽的核酸序列上的编码至少部分的本发明所述多肽的核酸序列，进行表达所得到的融合蛋白。‘可操作地连接’可理解为指两个核酸序列以这样的方式连接当表达时，所产生的本发明所述多肽在其N-或C-末端或两个末端都具有标记多肽。标记多肽可用于多种目的；例如它可以用于增加融合蛋白的稳定性或可溶性、作为分泌信号(指导融合蛋白定位到细胞特定区室的信号)或促进融合蛋白的纯化。用于促进融合蛋白纯化的标记多肽的实例是六组氨酸肽。具有六组氨酸标记的融合蛋白的纯化，在例如Gentz等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第86卷，第821-824页中有描述。具有六组氨酸标记的融合蛋白可以例如在pQE(Qiagen，Inc.)载体上，按照供应商所提供的技术方案进行生产。
本发明也包括与天然存在的氨基酸序列相比，具有一个或多个突变的，具有乙内酰脲消旋酶活性的多肽突变体。产生突变的方法是本领域技术人员已知的，例如可以是随机诱变(例如通过PCR的帮助或UV照射的方式)、定点PCR等。
本发明也涉及编码本发明所述的具有乙内酰脲消旋酶活性的多肽的核酸序列。
可将编码本发明所述多肽的核酸序列克隆到合适的载体中，并在导入合适的宿主细胞后，可表达该核酸序列以产生本发明所述的多肽。核酸序列的克隆和表达是本领域的常规技术，其在例如Sambrook，J.，Fritsh，E.F，和Maniatis，T.分子克隆，实验室手册(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，第二版，冷泉港实验室，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989中有描述。
本发明所述的多肽也可以通过将编码该多肽的核酸序列整合到宿主细胞的基因组中并进行(过)表达来产生。核酸序列的整合及该序列的(过)表达可以利用本领域技术人员已知的方法来实现。使本发明所述的多肽在微生物内以天然存在的方式过表达也是可能的，例如通过将合适的启动子置于微生物基因组中的本发明所述的核酸序列前、通过将本发明所述核酸序列的一个或多个拷贝整合到微生物基因组中、或通过在合适载体中在其天然宿主内过表达本发明所述的核酸序列。
因此本发明也涉及包含本发明所述核酸序列的载体。本发明还涉及含有编码本发明所述多肽的核酸序列的宿主细胞。优选地，本发明涉及包含具有本发明所述核酸序列的载体的宿主细胞。本发明还涉及本发明所述核酸序列的过表达。
适合表达本发明所述核酸序列的载体的实例，是常规用于克隆和表达的载体。这些载体对于本领域的普通技术人员是已知的。在大肠杆菌(Escherichiacoli)中表达的适合载体的实例在例如，Makrides.S.C.，微生物学综述(Microbiological reviews)，(1996)，512-538的表1中给出。载体优选地具有在诱导型启动子控制下的克隆位点。诱导型启动子的实例是lac启动子、araBAD启动子、T7启动子、trc启动子、tac启动子和trp启动子。合适的宿主细胞是常规用于克隆和表达的宿主细胞，并且是本领域普通技术人员已知的。合适的大肠杆菌宿主细胞菌株的实例是TOP10F′、TOP10、DH10B、DH5α、HB101、W3110、BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS、BL21 Star(DE3)。
载体的选择有时候取决于宿主细胞(和其他相关因素)的选择；例如，如果采用了具有araBAD启动子的载体，则优选使用不能够降解阿拉伯糖诱导物的大肠杆菌宿主细胞菌株(大肠杆菌ara-宿主细胞)。
编码本发明所述多肽的核酸序列可通过常规的分子生物学技术以及现有文献中所给出的序列信息在其他生物体中发现。例如，使用SEQ IDNO.1或SEQIDNO.3所描述的核酸序列的完整序列或其部分序列作为杂交探针能够分离出编码本发明所述多肽的核酸序列(例如，如Sambrook，J.，Fritsh，E.F，和Maniatis，T.分子克隆实验室手册(Molecular cloningA Laboratory Manual)，第二版冷泉港实验室，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989中所描述的)。
部分或全部地包括SEQ IDNO.1或SEQ IDNO.3的核酸序列也可以利用基于SEQ IDNO.1、SEQ IDNO.2、SFQ IDNO.3和/或SEQ IDNO.4中的序列信息的(合成的)寡核苷酸引物，通过聚合酶链式反应(PCR)的方式而发现。
本发明所述的核酸序列可以利用，例如，cDNA、mRNA、基因组DNA作为模板以及合适的寡核苷酸引物，以常规的PCR扩增技术的方式来扩增。可将这样扩增出来的核酸序列克隆入合适的载体，并可通过DNA序列分析表征。
也可以利用常规的合成技术，例如通过利用DNA自动合成仪来制备与本发明所述核酸序列相应的或能够与其杂交的寡核苷酸序列。
本发明所述的核酸序列可以在分离后，利用本领域已知的技术，克隆到合适的表达载体中，并在合适的宿主细胞内表达，以生产本发明所述的多肽。
如果需要证实所克隆的序列确实编码本发明所述的蛋白质，即不受底物抑制的乙内酰脲消旋酶，可以采用实施例3所列出的方法。
既然在此已经证实存在不受底物抑制的乙内酰脲消旋酶，自此D-或L-乙内酰脲的外消旋化作用可以在较高的底物浓度下进行。因此在一个实施方案中，本发明涉及富含对映异构体的乙内酰脲化合物的外消旋化方法，包括使所述的富含对映异构体的乙内酰脲混合物接触具有乙内酰脲消旋酶的多肽的步骤，其中该多肽具有不受底物抑制的乙内酰脲消旋酶活性。这一方法在下文中称作本发明所述的方法。
在优选的实施方案中，本发明所述的乙内酰脲消旋酶用于本发明所述的方法，更优选地，可获得自放射形土壤杆菌中的乙内酰脲消旋酶用于本发明所述的方法，甚至更优选地SEQ ID NO2或SEQ ID NO4所示的乙内酰脲消旋酶被用于本发明所述的方法。
可被本发明所述的乙内酰脲消旋酶外消旋化的D-或L-乙内酰脲的实例是通式1的D-或L-乙内酰脲， 其中R代表氨基酸的侧基，例如，任选被例如具有1-20个碳原子的(杂)烷基取代或任选被具有1-20个碳原子的(杂)芳基取代。(杂)芳基或(杂)烷基上的取代基的实例是羟基、烷氧基、巯基、硫代烷基、烷基、羧基、氨基、硝基、卤素、氨甲酰基、腈和酰基。R基团的实例是甲基、异丙基、异丁基、2-甲基硫代亚乙基、4-氨基亚丁基、羟亚甲基、甲氧亚甲基、羧亚甲基、羧亚乙基、苯基、对羟苯基、间羟苯基、邻羟苯基、对氯苯基、间氯苯基、2，4-二氯苯基、对甲氧苯基、苄基、对羟苄基、3，4-二羟苄基、3，4-二甲氧苄基、苄氧亚甲基、3，4-亚甲二氧基苄基、吲哚亚甲基。
本发明所述方法中的D-或L-乙内酰脲的外消旋化可以并入另外一个过程并且可在外部进行。并入一个过程可理解为指D-(或L-)乙内酰脲被外消旋化，并且所得到的外消旋物的L-(或D-)乙内酰脲在原处立即被进一步转化，以使D-(或L-)乙内酰脲的外消旋化反应实际上可以持续进行。外部地可理解为指D-(或L-)乙内酰脲在独立的反应步骤中被外消旋化。
因此本发明涉及在下列物质存在时制备富含对映异构体的α-氨基酸的方法1)不受底物抑制的乙内酰脲消旋酶2)乙内酰脲酶和/或3)对映异构体选择性的氨基甲酰酶。
在这种方法中使用乙内酰脲消旋酶相对于使用传统的乙内酰脲消旋酶或根本不使用乙内酰脲消旋酶的方法来说，其优点就在于可以将取代的乙内酰脲更快和/或更多地转化为相应的α-氨基酸。本发明所述的乙内酰脲消旋酶的另外一个优点在于其具有广泛的底物特异性，因此它们可用于制备多种不同的富含对映异构体的α-氨基酸。
不受底物抑制的乙内酰脲消旋酶可有利地应用于富含对映异构体的乙内酰脲化合物与所述乙内酰脲消旋酶接触的方法中，其中富含对映异构体的乙内酰脲化合物的浓度大于5mM，优选大于7.5或10mM，更优选大于15或20mM，以及最优选大于25mM。
具有氨基酸侧基R的α-氨基酸，其中R如上文所定义，是富含对映异构体的α-氨基酸的实例，可以根据本发明的方法制备，其中共同使用本发明所述的乙内酰脲消旋酶和对映异构体选择性的氨基甲酰酶以及乙内酰脲酶。α-氨基酸的实例是丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、瓜氨酸、苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸。
在这种制备富含对映异构体的D-或L-α-氨基酸的方法中优选使用对映异构体选择性至少为90％的对映异构体选择性氨基甲酰酶，更优选对映异构体选择性至少为95％，特别地至少为98％，最特别的至少为99％的对映异构体选择性。在本发明的范围内，氨基甲酰酶(例如D-氨基甲酰酶)的对映异构体选择性为90％可理解为指氨基甲酰酶可将N-氨甲酰基-D-α-氨基酸和N-氨甲酰基-L-α-氨基酸的外消旋混合物转化为90％的一种对映异构体(例如D-α-氨基酸)，和10％的另一种对映异构体(例如L-α-氨基酸)，而总体将50％的N-氨甲酰基-D-α-氨基酸和N-氨甲酰基-L-α-氨基酸的外消旋混合物进行转化。
本发明还涉及从相应的N-氨甲酰基-L-氨基酸或N-氨甲酰基-D-氨基酸、或任何N-氨甲酰基-L-氨基酸和N-氨甲酰基-D-氨基酸的混合物制备D-或L-氨基酸的方法。在这种方法中，不受底物抑制的乙内酰脲消旋酶可有利地与D-或L-氨基甲酰酶及乙内酰脲酶共同使用，例如用于一锅反应中。
此外，本发明还涉及同时使用乙内酰脲消旋酶、对映异构体选择性氨基甲酰酶和乙内酰脲酶，分别从相应的L-α-氨基酸或相应的D-α-氨基酸、或分别从相应的D-和-L-α氨基酸的任何混合物中制备D-或L-α-氨基酸。在将L-α-氨基酸转化成D-α-氨基酸的这种方法的实例中，L-α-氨基酸可以先根据本领域已知的方法，化学地转化成相应的N-氨甲酰基-L-α-氨基酸。然后N-氨甲酰基-L-α-氨基酸可以在存在对映异构体选择性的D-氨基甲酰酶、乙内酰脲酶和乙内酰脲消旋酶时酶促转化成D-α-氨基酸。
优选选择包括乙内酰脲消旋酶的反应的温度和pH，以使得乙内酰脲消旋酶达到最适的稳定性和活性。如果该反应中还包括除乙内酰脲消旋酶以外的另一种酶，则也要选择温度和pH，以使乙内酰脲消旋酶的稳定性和活性以及另一种酶的活性、稳定性和所需要的对映异构体选择性尽可能得好。N-氨甲酰基-L-α-氨基酸或N-氨甲酰基-D-α-氨基酸或L-或D-乙内酰脲在分别存在本发明所述的乙内酰脲消旋酶、D-或L-氨基甲酰酶以及乙内酰脲酶时，分别转化成相应的D-α-氨基酸或L-α-氨基酸，并且优选在pH5-10之间进行。特别的该转化可以在pH6.0-7.5之间进行。转化的温度优选选择在0-80℃之间，特别是在10-50℃之间，更特别是在35-45℃之间。
从相应的α-氨基酸化学制备N-氨甲酰基-α-氨基酸可以通过例如使α-氨基酸与MOCN接触来实现，其中M代表碱金属，优选钾或钠。所使用的温度并不重要反应优选在大约-5-100℃之间的温度进行，特别是温度为0-80℃之间；该化学反应的pH优选选择在8-11之间，更特别是在9-10之间。
优选地，通过相应的N-氨甲酰基-L-α-氨基酸(或相应的N-氨甲酰基-D-α-氨基酸)从相应的L-α-氨基酸(或其他途径)制备D-α-氨基酸的反应是在一锅中进行的。
当乙内酰脲消旋酶以纯化的形式使用或以无细胞提取物存在时，可以加入添加剂以增加乙内酰脲消旋酶的稳定性和/或活性(例如Watabe等人，1992，J.Bact.，第7989-7995页和Wiese等人，2000，J.Bact，第217-230页中所描述的)。此类添加剂的实例是含有二价硫的化合物，例如L-甲硫氨酸、D-甲硫氨酸、L-半胱氨酸、N-氨甲酰基-L-甲硫氨酸、N-乙酰基-D，L-甲硫氨酸、2-酮基4-(甲硫基)丁酸、D，L-2-羟基-4-(甲硫基)丁酸、L-甲硫氨酸甲酯、D，L-甲硫氨酸异羟肟酸、S-甲基-L-半胱氨酸、D-钙长石、β-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)、谷胱甘肽。
本发明参考下述实施例做进一步说明，但并不只限于这些。


图1来自于放射形土壤杆菌、假单胞菌菌株NS671和金黄节杆菌DSM3747的乙内酰脲消旋酶相对于起始的L-5-甲巯基乙基乙内酰脲浓度的相对起始活性实施例一般步骤常规的分子生物学技术，例如质粒DNA的分离、琼脂糖凝胶电泳、核酸的限制性酶切修饰、大肠杆菌的转化等，按照Sambrook等人，1989，“分子克隆实验室手册”。冷泉港实验室，冷泉港，纽约所描述的进行或根据不同供应商所提供的使用说明的指示进行。
合成的寡脱氧核糖核苷酸从Invitrogen(Groningen，荷兰)购买。
DNA序列分析是由BaseClear(Leiden，荷兰)，利用染料标记的双脱氧终止子的链终止法进行的。
细胞粗提物中的蛋白质浓度利用Bradford试剂在595nm处测定。
实施例1 pET-Hrac-S和pET-Hrac-L质粒的构建于30℃，在由10g/l胰蛋白胨(Difco实验室，Becton Dickinson微生物学系统，Sparks，美国)、5g/l酵母提取物(Difco)和5g/l氯化钠组成的LB培养基中预培养放射形土壤杆菌菌株。过夜培养后，将预培养物接种到新鲜的LB培养基中至OD600为0.2。在30℃下继续培养该培养物，并在OD600为1.7时进行收获。
该放射形土壤杆菌培养物的基因组DNA通过由Qiagen(Qiagen基因组DNA手册，1998，Qiagen，Hilden，德国)所述方法的方式进行分离。
将放射形土壤杆菌的乙内酰脲消旋酶基因克隆到表达载体pET101/D-TOPO(Invitrogen)中。该基因按照Invitrogen所述的方法通过与翻译起点(ATG)融合并具有原始的终止密码子而克隆。
包括SEQ IDNO.1的721个碱基对，在5’端延伸通过引物1引入的CACC序列的片段，通过PCR从放射形土壤杆菌的染色体DNA中利用下列引物扩增5′-CACCATGCATATTCGTCTGATCAACCCG-3′[引物1；SEQ IDNO.5](粗体所示为定向TOPO克隆的CACC序列，而下划线所示为起始密码子)和，
5′-TCAGGCGACGAGCTTGGTTTC-3′[引物2；SEQ IDNO.6](下划线所示为终止密码子)。
包括SEQ IDNO.3的754个碱基对，在5’端延伸通过引物3引入的CACC的片段，通过PCR从放射形土壤杆菌的染色体DNA中利用下列正向引物扩增5′-CACCATGGCAAATGAGCGTCCTGAAAG-3′[引物3；SEQ IDNO.7](粗体所示为定向TOPO克隆的CACC序列，下划线所示为起始密码子)和作为反向引物的引物2。
扩增片段的正确长度通过琼脂糖凝胶电泳确定，然后根据供应商所提供的方案将片段直接克隆入表达载体pET101/D-TOPO，并转化到大肠杆菌TOP10的化学感受态细胞(Invitrogen)中。转化细胞在含100mg/l羧苄青霉素的LB琼脂平板上选择。具有正确的插入片段的质粒(通过双向测序检测辅助检验)称为pET-Hrac-S和pET-Hrac-L，其中Hrac-S代表具有SEQ IDNO.1的序列的插入片段，Hrac-L代表具有SEQ IDNO.3的序列的插入片段。将质粒转化入大肠杆菌TOP10中。大肠杆菌TOP10(pET-Hrac-S)和大肠杆菌TOP10(pET-Hrac-L)根据布达佩斯条约分别保藏于国立工业和海洋微生物保藏有限公司(NCIMB，英国)，保藏号分别为No.41131和No.41130。
实施例2放射形土壤杆菌的乙内酰脲消旋酶在大肠杆菌BL21 Star(DE3)中的表达含有pET-Hrac-S或pET-Hrac-L的大肠杆菌Top10菌株的质粒DNA利用Qiagen所述的方法(质粒迷你试剂盒，2001年10月的方案)进行分离，然后转化入化学感受态的大肠杆菌BL21 Star(DE3)细胞(Invitrogen)中。
大肠杆菌BL21 Star(DE3)(pET-Hrac-S)和大肠杆菌BL21 Star(DE3)(pET-Hrac-L)的单克隆在28℃下，在含100mg/l羧苄青霉素的25ml LB培养基中培养过夜至OD620nm为2.5。将全部培养物(25ml)接种入250ml含有100mg/l羧苄青霉素的新鲜LB培养基中，在28℃下继续生长。1小时后，当OD620nm达到0.45时，向培养物中加入1mM(终浓度)的IPTG进行诱导，并继续在28℃下生长4.5小时至OD620nm为1.7。然后收获细胞并用任选加入1mM二硫苏糖醇(DTT)的100mM磷酸钾缓冲液，pH7.0洗涤，然后超声处理细胞，以获取无细胞提取物。
细胞分成30mg(湿重)一份于-20℃冻存备用。
实施例3使用过表达的放射形土壤杆菌乙内酰脲消旋酶基因的外消旋化实验3.1一般步骤10ml反应混合物由溶于100mM pH7.0的磷酸钾缓冲液的，终浓度如下文所述的D-5-苄基乙内酰脲、L-5-异丙基乙内酰脲或L-5-甲巯基乙基乙内酰脲组成。通过加入下文所述量的大肠杆菌BL21 Star(DE3)(pET-Hrac-S)或大肠杆菌BL21 Star(DE3)(pET-Hrac-L)的全细胞或无细胞提取物来启动反应，其中可以加入或不加二硫苏糖醇(DTT，终浓度为1mM)，并且在室温下孵育。
无细胞提取物是通过将60mg细胞重悬浮在1ml的100mM pH7.0的磷酸钾缓冲液、或含有1mM DTT的1ml 100mM pH7.0的磷酸钾缓冲液中，再进行超声处理制得。
取出样品(500μl)并加入5μl 85％的磷酸终止反应。样品通过HPLC进行分析。D，L-5-异丙基乙内酰脲和D，L-5-苄基乙内酰脲通过Astec(Whippany，美国)的Chirobiotic T柱(250mm×4.6mm，I.D.5μm)而分离，D，L-5-甲巯基乙基乙内酰脲通过Astec(Whippany，美国)的Chirobiotic T柱(250mm×4.6mm，I.D.5μm)并联合Machery-Nagel(Düren，德国)的Nucleosil 120-5 C18柱而分离。在所有的情况中，洗脱液均为80％15mM pH4.1的醋酸铵及20％的甲醇。洗脱流速为22℃的柱温下1ml/min。检测在波长为220nm的紫外光下进行。在这些条件下，对于D-和L-5-异丙基乙内酰脲的保留时间分别为5.3和6.3分钟，对于D-和L-5-苄基乙内酰脲的保留时间分别为6.3和8.3分钟，对于D-和L-5-甲巯基乙基乙内酰脲的保留时间分别为9.1和12.2分钟。
3.2D-5-苄基乙内酰脲的外消旋化以与3.1所述相同的方式，将对映体量(e.e.)为96％的2mM的D-5-苄基乙内酰脲与无细胞提取物(蛋白质终浓度0.11mg/ml)共孵育。4.5小时后，大肠杆菌BL21 Star(DE3)(pET-Hrac-S)的无细胞提取物给出52％的对映体量。4.5小时后，大肠杆菌BL21 Star(DE3)(pET-Hrac-S)的无细胞提取物给出80％的对映体量。
化学药品的空白对照在4.5小时后给出90％的对映体量。
3.3L-5-异丙基乙内酰脲的外消旋化以与3.1所述系列反应相同的方式，将对映体量为99％的40mM的L-5-异丙基乙内酰脲与大肠杆菌BL21 Star(DE3)(pET-Hrac-S)和大肠杆菌BL21 Star(DE3)(pET-Hrac-L)的完整细胞(120mg)及含DTT的无细胞提取物(蛋白质终浓度0.44mg/ml)共孵育。
采用大肠杆菌BL21 Star(DE3)(pET-Hrac-S)的完整细胞及含DTT的无细胞提取物使对映体量在5小时后达到0％。采用大肠杆菌BL21 Star(DE3)(pET-Hrac-L)的完整细胞使对映体量在19小时后达到28％。采用大肠杆菌BL21 Star(DE3)(pET-Hrac-L)的含DTT的无细胞提取物使对映体量在19小时后达到9％。
化学药品的空白对照在19小时后给出98％的对映体量。
3.4L-5-甲巯基乙基乙内酰脲的外消旋化以与3.1所述系列反应相同的方式，将对映体量为89％的不同浓度的L-5-甲巯基乙基乙内酰脲与大肠杆菌BL21 Star(DE3)(pET-Hrac-S)和大肠杆菌BL21Star(DE3)(pET-Hrac-L)的完整细胞共孵育。L-5-甲巯基乙基乙内酰脲的浓度为1、5、10、50和80mM。产物浓度(D-5-甲巯基乙基乙内酰脲)的随时间线性增长的这段时期内检测反应的初速度，并以mM每小时来表示。图1中，相对于初始底物浓度作起始活性的曲线。
从图1中可以看出，大肠杆菌BL21 Star(DE3)(pET-Hrac-S)和大肠杆菌BL21 Star(DE3)(pET-Hrac-L)的起始消旋酶活性均随起始底物浓度的增加而增加，这意味着具有SEQ IDNO.2和NO.4的乙内酰脲消旋酶未表现出针对L-5-甲巯基乙基乙内酰脲的底物抑制。另一方面，假单胞菌菌株NS671和金黄节杆菌DSM3747的乙内酰脲消旋酶清楚地显示，在L-5-甲巯基乙基乙内酰脲的浓度分别高于2.5和5mM时，其相对的起始活性下降。因此，可以得出这样的结论，从放射形土壤杆菌中克隆得到的乙内酰脲消旋酶不受L-5-甲巯基乙基乙内酰脲的抑制。L-5-甲巯基乙基乙内酰脲的Km和Vmax值可以通过在Lineweaver Burk曲线中对1/S作1/V的曲线而确定。大肠杆菌BL21 Star(DE3)(pET-Hrac-S)的无细胞提取物具有1mM的Km和0.4mM/小时的Vmax。大肠杆菌BL21 Star(DE3)(pET-Hrac-L)的无细胞提取物具有20mM的Km和0.2mM/小时的Vmax。
序列表<110>DSM NV<120>乙内酰脲消旋酶<130>乙内酰脲消旋酶<150>NL 1020663<151>2002-05-23<160>7<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>717<212>DNA<213>放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)<400>1atgcatattc gtctgatcaa cccgaactca accgcctcga tgacggcgca ggcactggac 60agcgccctgc gtgtcaaaca ggcgcacacg acgatctcag cgacaaatcc cctcgatacg 120cctgtcagca tcgaaggcgg ggccgatgag gcgctggctg ttccgggcat gctggaggaa 180atccgcaagg gtgagcgtct gggcgtcgat gcctatgtca ttgcctgctt tgacgatccc 240ggcctgcacg ctgcccggga agtggcgcgc ggtcccgtca tcggtatctg ccaggccggc 300attcaggtgg ccatgaccat cagccgccgt ttttccatca tcacgacgct gccgcgctcc 360attccgatta tcgaagacct cgtcgacaat tatggcgctc agcgtcactg ccgccgggtc 420cgcgccatca atctgccggt gctcggtctc gaggaggatc cgcatgccgc agaggcgatg 480ctgatccgcg aaatcgaagc ggcaaagaaa gaggatgcgg cagaagccat catccttggc 540tgcgccggca tgtcggcact gtgcgacagg ctgcgcgagg caacgggcgt ccccgtgatc 600gatggcgtca ccgccgccgt caagctggcg gaggcactgg tgggcgctgg atacagcacc 660tccaaggtca atgcctatga ttatccgcgc atcaaggaaa ccaagctcgt cgcctga 717
<210>2<211>238<212>PRT<213>放射形土壤杆菌<400>2Met His Ile Arg Leu Ile Asn Pro Asn Ser Thr Ala Ser Met Thr Ala1 5 10 15Gln Ala Leu Asp Ser Ala Leu Arg Val Lys Gln Ala His Thr Thr Ile20 25 30Ser Ala Thr Asn Pro Leu Asp Thr Pro Val Ser Ile Glu Gly Gly Ala35 40 45Asp Glu Ala Leu Ala Val Pro Gly Met Leu Glu Glu Ile Arg Lys Gly50 55 60Glu Arg Leu Gly Val Asp Ala Tyr Val Ile Ala Cys Phe Asp Asp Pro65 70 75 80Gly Leu His Ala Ala Arg Glu Val Ala Arg Gly Pro Val Ile Gly Ile85 90 95Cys Gln Ala Gly Ile Gln Val Ala Met Thr Ile Ser Arg Arg Phe Ser100 105 110Ile Ile Thr Thr Leu Pro Arg Ser Ile Pro Ile Ile Glu Asp Leu Val115 120 125Asp Asn Tyr Gly Ala Gln Arg His Cys Arg Arg Val Arg Ala Ile Asn130 135 140
Leu Pro Val Leu Gly Leu Glu Glu Asp Pro His Ala Ala Glu Ala Met145 150 155 160Leu Ile Arg Glu Ile Glu Ala Ala Lys Lys Glu Asp Ala Ala Glu Ala165 170 175Ile Ile Leu Gly Cys Ala Gly Met Ser Ala Leu Cys Asp Arg Leu Arg180 185 190Glu Ala Thr Gly Val Pro Val Ile Asp Gly Val Thr Ala Ala Val Lys195 200 205Leu Ala Glu Ala Leu Val Gly Ala Gly Tyr Ser Thr Ser Lys Val Asn210 215 220Ala Tyr Asp Tyr Pro Arg Ile Lys Glu Thr Lys Leu Val Ala225 230 235<210>3<211>750<212>DNA<213>放射形土壤杆菌<400>3atggcaaatg agcgtcctga aaggcgagcc cgaatgcata ttcgtctgat caacccgaac 60tcaaccgcct cgatgacggc gcaggcactg gacagcgccc tgcgtgtcaa acaggcgcac120acgacgatct cagcgacaaa tcccctcgat acgcctgtca gcatcgaagg cggggccgat180gaggcgctgg ctgttccggg catgctggag gaaatccgca agggtgagcg tctgggcgtc240gatgcctatg tcattgcctg ctttgacgat cccggcctgc acgctgcccg ggaagtggcg300cgcggtcccg tcatcggtat ctgccaggcc ggcattcagg tggccatgac catcagccgc360cgtttttcca tcatcacgac gctgccgcgc tccattccga ttatcgaaga cctcgtcgac420
aattatggcg ctcagcgtca ctgccgccgg gtccgcgcca tcaatctgcc ggtgctcggt 480ctcgaggagg atccgcatgc cgcagaggcg atgctgatcc gcgaaatcga agcggcaaag 540aaagaggatg cggcagaagc catcatcctt ggctgcgccg gcatgtcggc actgtgcgac 600aggctgcgcg aggcaacggg cgtccccgtg atcgatggcg tcaccgccgc cgtcaagctg 660gcggaggcac tggtgggcgc tggatacagc acctccaagg tcaatgccta tgattatccg 720cgcatcaagg aaaccaagct cgtcgcctga 750<210>4<211>249<212>PRT<213>放射形土壤杆菌<400>4Met Ala Asn Glu Arg Pro Glu Arg Arg Ala Arg Met His Ile Arg Leu1 5 10 15Ile Asn Pro Asn Ser Thr Ala Ser Met Thr Ala Gln Ala Leu Asp Ser20 25 30Ala Leu Arg Val Lys Gln Ala His Thr Thr Ile Ser Ala Thr Asn Pro35 40 45Leu Asp Thr Pro Val Ser Ile Glu Gly Gly Ala Asp Glu Ala Leu Ala50 55 60Val Pro Gly Met Leu Glu Glu Ile Arg Lys Gly Glu Arg Leu Gly Val65 70 75 80Asp Ala Tyr Val Ile Ala Cys Phe Asp Asp Pro Gly Leu His Ala Ala85 90 95
Arg Glu Val Ala Arg Gly Pro Val Ile Gly Ile Cys Gln Ala Gly Ile100 105 110Gln Val Ala Met Thr Ile Ser Arg Arg Phe Ser Ile Ile Thr Thr Leu115 120 125Pro Arg Ser Ile Pro Ile Ile Glu Asp Leu Val Asp Asn Tyr Gly Ala130 135 140Gln Arg His Cys Arg Arg Val Arg Ala Ile Asn Leu Pro Val Leu Gly145 150 155 160Leu Glu Glu Asp Pro His Ala Ala Glu Ala Met Leu Ile Arg Glu Ile165 170 175Glu Ala Ala Lys Lys Glu Asp Ala Ala Glu Ala Ile Ile Leu Gly Cys180 185 190Ala Gly Met Ser Ala Leu Cys Asp Arg Leu Arg Glu Ala Thr Gly Val195 200 205Pro Val Ile Asp Gly Val Thr Ala Ala Val Lys Leu Ala Glu Ala Leu210 215 220Val Gly Ala Gly Tyr Ser Thr Ser Lys Val Asn Ala Tyr Asp Tyr Pro225 230 235 240Arg Ile Lys Glu Thr Lys Leu Val Ala245<210>5<211>28<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>5caccatgcat attcgtctga tcaacccg28<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>6tcaggcgacg agcttggttt c 21<210>7<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>7caccatggca aatgagcgtc ctgaaag 2权利要求
1.分离的多肽，其具有不受底物抑制的乙内酰脲消旋酶活性。
2.根据权利要求1的分离多肽，其具有与SEQ IDNO.2或SEQ IDNO.4至少87％的同一性。
3.根据权利要求1或2的分离多肽，其是由在高严谨或特别高严谨的条件下与SEQ IDNO.1和/或SEQ IDNO.3或其互补序列杂交的核酸序列所编码的。
4.根据权利要求1至3所述的分离多肽，其能与针对至少部分的SEQIDNO.2或SEQ IDNO.4所示氨基酸序列的抗体制剂产生免疫交叉反应。
5.编码根据权利要求1至4中任一项的多肽的核酸序列。
6.包含权利要求5所述核酸序列的载体。
7.包含权利要求5所述核酸序列或权利要求6所述载体的宿主细胞。
8.富含对映异构体的乙内酰脲化合物的外消旋化的方法，包括使所述富含对映异构体的乙内酰脲化合物接触权利要求1至4所述多肽的步骤。
9.在存在下述物质时制备富含对映异构体的D-或L-α-氨基酸的方法a.权利要求1至4所述的多肽b.乙内酰脲酶和/或c.对映异构体选择性的氨基甲酰酶。
全文摘要
本发明涉及具有不受底物抑制的乙内酰脲消旋酶活性的分离多肽。该多肽是例如与SEQ IDNO.2或SEQ IDNO.4具有至少87％的同一性的分离多肽。本发明也涉及编码这些多肽的核酸序列。本发明还涉及富含对映异构体的乙内酰脲化合物的外消旋化的方法以及富含对映异构体的D－或L－α氨基酸的制备方法。
文档编号C12N5/10GK1656218SQ03811523
公开日2005年8月17日 申请日期2003年5月23日 优先权日2002年5月23日
发明者W·H·J·博伊斯坦, J·G·T·基尔科斯, F·B·J·阿塞马, L·M·鲁伊滋佩雷滋, D·冈扎勒滋帕卡诺斯卡, J·冈扎勒滋洛佩滋, S·德拉埃斯卡勒拉休索 申请人:Dsm Ip财产有限公司