乙内酰脲酶的突变体的制作方法

乙内酰脲酶的突变体的制作方法
【专利摘要】本发明涉及具有选自(i)或(ii)的氨基酸序列的乙内酰脲酶：(i)选自SEQ?ID?NO:6-20和SEQ?ID?NO:73-119的氨基酸序列；(ii)氨基酸序列，其中在SEQ?ID?NO:6-20和SEQ?ID?NO:73-119的氨基酸序列中，1至75个氨基酸残基已经被取代、删除、插入和/或添加，以及其中进一步，乙内酰脲酶的催化活性比具有SEQ?ID?NO:1所示氨基酸序列的乙内酰脲酶的催化活性高至少1.2倍。本发明进一步涉及制备氨基酸的方法，其中使用所述乙内酰脲酶。
【专利说明】乙内酰脲酶的突变体
[0001] 本发明总体上涉及乙内酰脲酶（hydantoinase)。更具体地，本发明涉及一系列修 饰的乙内酰脲酶及其在制备氨基酸的方法中的用途，特别是在全细胞催化剂中的用途，所 述修饰的乙内酰脲酶相对于先前分离的乙内酰脲酶呈现出提高的酶活性。 【背景技术】
[0002] 使用酶产生氨基酸的方法是已知的。此外，有这样的方法，其包括将作为起始材 料的低成本化学合成的5-取代的乙内酰脲化合物不对称分解为光学活性氨基酸。这些从 5_取代的乙内酰脲化合物中生产光学活性氨基酸的方法对于药物制备物的生产、化学工业 产品、食品添加剂等是重要的。
[0003] 在这种从5-取代的乙内酰脲化合物生产氨基酸的方法中，需要两种酶：（1)称作 乙内酰脲酶（乙内酰脲水解酶）的酶，其催化通过水解将5-取代的乙内酰脲化合物转化为 相应的N-氨基甲酰氨基酸形成N-氨基甲酰氨基酸的反应；(2)称作N-氨基甲酰氨基酸水 解酶的酶，其催化通过水解将上述N-氨基甲酰氨基酸转化为相应的氨基酸形成光学活性 的氨基酸的反应。
[0004] 乙内酰脲水解酶，在本文称作"乙内酰脲酶"，包含具有广泛特异性和生物学功 能的各种类别的酶。乙内酰脲酶的重要性质是其对映体选择性（enantioselectivity)， 这使其对于生产光学纯的D-或L-氨基酸是有价值的。为了从5-取代的乙内酰脲化合 物产生光学活性氨基酸，乙内酰脲酶和/或N-氨基甲酰氨基酸水解酶必须是对映体选择 性酶。已经描述了通过生产L-氨基酸的微生物或者通过由所述微生物产生的含有酶的 材料生产L-氨基酸的方法，其中采用了各种属的微生物如黄杆菌属（Flavobacterium)、 芽抱杆菌属（Bacillus)、假单胞菌属（Pseudomonas)和节杆菌属（Arthrobacter) (J. Biotechnol. 46, 63, 1996) 〇
[0005] 已经从节杆菌属微生物分离了乙内酰脲酶基因和N-氨基甲酰氨基酸水解酶基 因，由这些基因编码的重组蛋白质用于生产L-氨基酸。
[0006] 鉴于乙内酰脲酶在产生光学纯的氨基酸中的重要性，已经致力于开发具有改 良的氨基酸生产性质的修饰的酶。作为这种努力的结果，已经分离和鉴定了许多微生 物，其产生具有令人满意的酶性质的乙内酰脲酶。美国专利No.5, 516, 660公开了节杆 菌（Arthrobacter sp.)菌株，其产生能从D-、L-和/或D, L-5-单取代的乙内酰脲产生 L-α -氨基酸的乙内酰脲酶。
[0007] 较新的的进展是利用全细胞催化剂技术（W02002/077212、W02004/042047、 W02000/058449、W02003/042412)在工业规模从相应的乙内酰脲中产生D-和L-氨基酸。所 述催化剂含有在微生物如大肠杆菌（E.coli)中共表达的D-乙内酰脲酶、乙内酰脲消旋酶 和D-氨甲酰水解酶。
[0008] 国际专利申请W000/58449公开了源自节杆菌属的乙内酰脲酶的突变体，使得活 性提高大约40%。
[0009] 对源自可利用的节杆菌的这些标准催化剂的检测显示从相应的色氨酸乙内酰脲 产生D-色氨酸是可能的，但是转化率很低。低转化率是由于可利用的野生型节杆菌乙内酰 脲酶接受色氨酸乙内酰脲作为底物的性能不足所致。
[〇〇1〇] 本发明的目的是提供具有关于5-取代的乙内酰脲、优选色氨酸乙内酰脲提高的 转化率的乙内酰脲酶，及使用乙内酰脲消旋酶、乙内酰脲酶和氨甲酰水解酶生产氨基酸的 方法，优选地，所述氨基酸是D-色氨酸；特别地，所述方法从L-色氨酸乙内酰脲起始；优选 地，所述乙内酰脲消旋酶、乙内酰脲酶和氨甲酰水解酶在大肠杆菌宿主中共表达。
[0011] 因此，本发明的目的是提供改良的乙内酰脲酶，其具有增强的转化率，特别是具有 关于色氨酸乙内酰脲的增强的转化率。此外，可有益于提高乙内酰脲酶的对映体选择性。
【发明内容】

[0012] 本发明的目的通过具有选自⑴或（ii)的氨基酸序列的乙内酰脲酶得以解决：
[0013] (i)氨基酸序列，其选自：SEQ IDN0:6、SEQ IDN0:7、SEQ IDN0:8、SEQ IDN0:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16,SEQ ID NO: 17,SEQ ID NO: 18,SEQ ID NO: 19,SEQ ID NO: 20,SEQ ID NO: 73,SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 80、SEQ IDN0:81、SEQ IDN0:82、SEQ IDN0:83、SEQ IDN0:84、SEQ IDN0:85、SEQ IDN0:86、SEQ ID N0:87、SEQ IDN0:88、SEQ IDN0:89、SEQ IDN0:90、SEQ IDN0:91、SEQ IDN0:92、SEQ IDN0:93、 SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106,SEQ ID NO: 107,SEQ ID NO: 108,SEQ ID NO: 109,SEQ ID NO: 110,SEQ IDN0:11USEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 114、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 117、 SEQ ID NO: 118 或 SEQ ID NO: 119 ;
[0014] (ii)氨基酸序列，其中在 SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16,SEQ ID NO: 17,SEQ ID NO: 18,SEQ ID NO: 19,SEQ ID NO: 20,SEQ ID NO: 73,SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 80、SEQ IDN0:81、SEQ IDN0:82、SEQ IDN0:83、SEQ IDN0:84、SEQ IDN0:85、SEQ IDN0:86、SEQ ID N0:87、SEQ IDN0:88、SEQ IDN0:89、SEQ IDN0:90、SEQ IDN0:91、SEQ IDN0:92、SEQ IDN0:93、 SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106,SEQ ID NO: 107,SEQ ID NO: 108,SEQ ID NO: 109,SEQ ID NO: 110,SEQ IDN0:11USEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 114、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 117、 SEQ ID NO: 118或SEQ ID NO: 119的氨基酸序列中，1至Φ个氨基酸残基被取代、缺失、插入和 /或添加，
[〇〇15] 其中φ定义为φ = 75，
[0016] 以及其中进一步地，所述乙内酰脲酶的催化活性比具有SEQ ID NO: 1所示氨基酸序 列的乙内酰脲酶的催化活性高至少ξ倍，
[0017] 以及其中ζ定义为ζ = 1. 2。
[0018] 在本发明中，如果未另外定义，则乙内酰脲酶的催化活性应理解为是这种酶关于 将5-取代的D-乙内酰脲化合物转化为相应的D-氨基甲酰氨基酸的催化活性。
[0019] 在本发明中，乙内酰脲酶的对映体选择性定义为Dart/Laet比率，D aet =这种酶将 5_取代的D-乙内酰脲化合物转化为相应的D-氨基甲酰氨基酸的催化活性，Lart =这种酶 将5-取代的D-乙内酰脲化合物的对映异构体转化为相应的D-氨基甲酰氨基酸的对映异 构体的催化活性，换句话说，L aet =这种酶将相应5-取代的L-乙内酰脲化合物转化为相应 的L-氨基甲酰氨基酸的催化活性。
[0020] 在本发明中，术语"添加氨基酸"是指在多肽的N-末端或C-末端添加氨基酸残基。
[0021] 在本发明优选的实施方案中，Φ选自 70、60、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2 或1。
[0022] 在本发明进一步优选的实施方案中，ζ选自1. 5、2、3、4、5、10、15、20、25或30。
[0023] 在本发明进一步优选的实施方案中，如下所述选择Φ和ζ :
[0024] φ = 70 且 ζ = 1. 5, φ = 70 且 ζ = 2, φ = 70 且 ζ = 3, φ = 70 且 ζ = 4， Φ = 70 且 ζ = 5, Φ = 70 且 ζ = 10, φ = 70 且 ζ = 15, φ = 70 且 ζ = 20, φ = 70 且 ζ = 25, φ = 70且 ζ = 30，
[0025] φ = 60 且 ζ = ι· 5, φ = 60 且 ζ = 2, φ = 60 且 ζ = 3, φ = 60 且 ζ = 4， φ = 60且 ζ = 5，Φ=60且 ζ =?〇，φ=60且 ζ =?5,φ=60且 ζ =20,φ = 60 且 ζ = 25, φ = 60 且 ζ = 30，
[0026] 印=50且4=1.5,9 = 50且4=2,9 = 50且4=3,9 = 50且4=4,9 = 50 且 ζ = 5, φ = 50 且 ζ = 10, φ = 50 且 ζ = 15, φ = 50 且 ζ = 20, φ = 50 且 ζ =25, φ = 50且 ζ = 30，
[〇〇27] φ = 40且 ζ = ι· 5, φ = 40且 ζ = 2, φ = 40且 ζ = 3, φ = 40且 ζ = 4, φ = 40 且 4 = 5, φ = 40 且 ζ = ι〇, φ = 40 且 ζ = 15, φ = 40 且 ζ = 20, φ = 40 且 ζ =25, φ = 40 且 ζ = 30，
[0028] φ = 30 且 ζ = 1· 5, φ = 30 且 ζ = 2, φ = 30 且 ζ = 3, φ = 30 且 ζ = 4， 30且 4 =5，φ=30且 ζ = ι〇, φ = 30且 ζ = 15, φ = 30 且 ζ = 20, φ = 30且 ζ = 25, φ = 30 且 ζ = 30，
[〇〇29] φ = 20 且 ζ = ι· 5, φ = 20 且 ζ = 2, φ = 20 且 ζ = 3, φ = 20 且 ζ = 4， Φ = 20且 4 = 5, Φ = 20 且 4 = 10, Φ = 20 且 4 = 15, Φ = 20且 4 = 20, Φ = 20 且 ζ = 25, φ = 20 且 ζ = 30，
[0030] φ = 10 且 ζ = 1· 5, φ = 10 且 ζ = 2, φ = 10 且 ζ = 3, φ = 10 且 ζ = 4， φ= 10且 ζ = 5, φ = 10 且 ζ = 10, φ = 10 且 ζ = 15, φ= 10 且 ζ = 20, φ = 10且 ζ = 25, φ= 10 且 ζ = 30，
[0031] φ = 9且 ζ =?·5，φ = 9 且 ζ =2，φ = 9 且 ζ =3，φ = 9 且 ζ =4，φ = 9 且 ζ = 5，φ = 9且 ζ =10，φ = 9且 ζ =15，φ = 9且 ζ = 20，φ = 9且 ζ = 25，φ = 9且 ζ = 30，
[0032] φ = 8且 ζ =1·5，φ = 8 且 ζ = 2，φ = 8且 ζ =3，φ = 8且 ζ = 4，φ = 8且 ζ = 5，Φ = 8且 ζ =?〇，φ = 8 且 ζ =15，φ = 8且 ζ =20，Φ = 8且 ζ =25，Φ=8 且 ζ = 30，
[0033] φ = 7 且 ζ =1·5，φ = 7 且 ζ = 2，φ = 7 且 ζ = 3，φ = 7 且 ζ =4，φ = 7 且 ζ =5，φ = 7且 ζ =ι〇，φ = 7且 ζ =?5，φ = 7且 ζ =20，φ = 7且 ζ =25，φ=7 且 ζ = 30，
[0034] φ = 6且 ζ =1·5，φ = 6且 ζ =2，φ = 6且 ζ =3，φ = 6且 ζ =4，φ = 6且 ζ = 5，φ = 6 且 ζ = ιο，φ = 6 且 ζ = ?5，ψ = 6 且 ζ =2〇，φ = 6 且 ζ =25，cp = 6 且 ζ = 30，
[〇〇35] φ = 5且 ζ =?·5，φ = 5且 ζ = 2，φ = 5 且 ζ = 3，φ = 5且 ζ =4，φ = 5且 ζ =5，φ = 5且 ζ =1〇，φ = 5且 ζ =15，φ = 5且 ζ =20，φ = 5且 ζ =25，φ=5 且 ζ = 30，
[0036] φ = 4 且 ζ = ?· 5, φ = 4且 ζ =2，φ = 4 且 ζ =3，φ = 4 且 ζ =4，φ = 4 且 ζ =5，φ = 4且 ζ =?〇，φ = 4且 ζ =?5，φ = 4且 ζ =20，φ = 4且 ζ =25，φ=4 且 ζ = 30，
[0037] φ = 3 且 ζ =1·5，φ = 3 且 ζ =2，φ = 3 且 ζ =3，φ = 3 且 ζ =4，φ = 3 且 ζ = 5，φ = 3且 ζ =?〇，φ = 3且 ζ =?5，φ = 3且 ζ =20，φ = 3且 ζ = 25，φ = 3 且 ζ = 30,
[0038] φ = 2且 ζ =?·5，φ = 2且 ζ =2，φ = 2且 ζ =3，φ = 2且 ζ =4，φ = 2 且 ζ = 5，φ = 2且 ζ =?〇，φ = 2且 ζ =?5，φ = 2且 ζ =20，φ = 2且 ζ = 25，φ = 2 且 ζ = 30，
[0039] φ=1且 ζ =?·5，φ=1且 ζ =2，φ=1且 ζ =3，φ=1且 ζ =4，φ=1 且 ζ = 5, φ = 1 且 ζ = 10, φ = 1 且 ζ = 15, φ = 1 且 ζ = 20, φ = 1 且 ζ = 25, φ = 1 且 ζ = 30。
[〇〇4〇] 根据本发明，提供了修饰的乙内酰脲酶（乙内酰脲水解酶），其与由微生物节杆菌 产生的野生型乙内酰脲酶相比具有增强的催化活性。进一步，本发明的乙内酰脲酶可具有 与由微生物节杆菌产生的野生型乙内酰脲酶相比提高的对映体选择性。本发明的乙内酰脲 酶呈现关于5-取代的乙内酰脲化合物，特别是D-色氨酸乙内酰脲的增强的转化率，因此适 合于用于产生D-氨基酸的方法。优选地，这种方法适于从相应的色氨酸乙内酰脲中起始产 生D-色氨酸，特别是使用D-乙内酰脲酶、D-氨甲酰水解酶及任选地，乙内酰脲消旋酶。优 选地，这些酶在微生物如大肠杆菌中共表达。在从5-取代的乙内酰脲化合物产生氨基酸的 这种方法中，所述乙内酰脲酶催化形成N-氨基甲酰氨基酸的反应，所述反应通过水解5-取 代的乙内酰脲化合物，优选（D-色氨酸乙内酰脲）以产生相应的N-氨基甲酰氨基酸（优选 N-氨基甲酰D-色氨酸）。这种N-氨基甲酰氨基酸由N-氨基甲酰氨基酸水解酶水解形成 相应的氨基酸（优选D-色氨酸）。
[0041] 对于色氨酸的制备，也可以使用D，L-色氨酸乙内酰脲或L-色氨酸乙内酰脲作为 起始材料，其中特别地，存在乙内酰脲消旋酶有利于为本发明的乙内酰脲酶提供D-色氨酸 乙内酰脲底物。优选地，这种方法适于从相应的D，L-或L-色氨酸乙内酰脲起始产生D-色 氨酸，特别是使用乙内酰脲消旋酶、D-乙内酰脲酶和D-氨甲酰水解酶。优选地，这三种酶 在微生物如大肠杆菌中共表达。
[0042] 本领域技术人员理解关于特定参考的序列的特定氨基酸位置（例如152位置）给 出的信息可以移至变体乙内酰脲酶和同源氨基酸序列：本领域技术人员能比对所述参考氨 基酸序列与变体序列，并确定变体序列中的相应位置（例如氨基酸位置152)。关于这个例 子，本领域技术人员理解在变体序列中，对应于参考序列的氨基酸位置152的氨基酸位置 可以不必须是变体序列的第152位氨基酸残基，然而在变体酶的三维结构中仍具有相同位 置。排列对比氨基酸序列的方法在下文进一步描述。也可采用其它方法以确定与参考序列 相比在变体序列中的相应位置。 【专利附图】

【附图说明】
[0043] 图1显示质粒pAS6_HyuH，其含有表达具有SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的乙内酰 脲酶的野生型基因 hyuH及表达具有SEQ ID N0:4所示氨基酸序列的D-氨甲酰水解酶的基 因。在质粒图谱中标示的缩写代表如下元件：D-Carb. =D-氨甲酰水解酶基因 NRRL，农杆 菌（Agrobacterium sp.) ;rhaP =鼠李糖启动子；hyuH =乙内酰脲酶 DSM9771 ;rrnB =转录 终止子；bla = β -内酰胺酶；ori =复制起点ColEI。
[0044] 序列描述
[0045] 在本发明中，多肽序列的变体有时通过表示与AA1XAA2形式的原始序列相比在变 体序列中存在的每个氨基酸取代进行描述，其中AA1表示在原始序列中X位置存在的氨基 酸残基，AA2表示在变体序列中X位置存在的氨基酸残基。
[0046] SEQ ID NO: 1显示来自节杆菌（Arthrobacter sp.)的野生型乙内酰脲酶的氨基酸 序列。
[0047] SEQ ID N0:2显示编码来自节杆菌的野生型乙内酰脲酶的核苷酸序列。
[0048] SEQ ID N0:3显示来自节杆菌的野生型乙内酰脲酶消旋酶的氨基酸序列。
[0049] SEQ ID N0:4显示来自节杆菌的野生型D-氨甲酰水解酶的氨基酸序列。
[0050] SEQ IDN0:5显示作为参考的氨基酸序列，其中在位置152、64、71、72、95、154、181、 284、285、398和452的氨基酸残基X根据权利要求书定义，在位置152的氨基酸残基代表除 了丙氨酸之外的任何氨基酸残基。
[0051] SEQ ID N0:6显示变体乙内酰脲酶的氨基酸序列，其中在152位的丙氨酸已经由甘 氨酸置换。
[0052] SEQ ID N0:7显示变体乙内酰脲酶的氨基酸序列，其中在152位的丙氨酸已经由半 胱氨酸置换。
[0053] SEQ ID N0:8显示变体乙内酰脲酶的氨基酸序列，其中在152位的丙氨酸已经由丝 氨酸置换。
[0054] SEQ ID N0:9显示变体乙内酰脲酶的氨基酸序列，其中在152位的丙氨酸已经由苏 氨酸置换。
[0055] SEQ ID N0:10显示变体乙内酰脲酶的氨基酸序列，其中在152位的丙氨酸已经由 缬氨酸置换。
[0056] SEQ ID N0:11显示变体乙内酰脲酶的氨基酸序列，其中在152位的丙氨酸已经由 丝氨酸置换，及在154位的缬氨酸已经由异亮氨酸置换。
[0057] SEQ ID N0:12显示变体乙内酰脲酶的氨基酸序列，其中在152位的丙氨酸已经由 缬氨酸置换，及在154位的缬氨酸已经由半胱氨酸置换。
[0058] SEQ ID N0:13显示变体乙内酰脲酶的氨基酸序列，其中在152位的丙氨酸已经由 半胱氨酸置换，及在154位的缬氨酸已经由丝氨酸置换。
[0059] SEQ ID N0:14显示变体乙内酰脲酶的氨基酸序列，其中在71位的精氨酸已经由天 冬酰胺置换，在72位的酪氨酸已经由组氨酸置换，及在152位的丙氨酸已经由丝氨酸置换。
[0060] SEQ ID N0:15显示变体乙内酰脲酶的氨基酸序列，其中在71位的精氨酸已经由天 冬酰胺置换，在72位的酪氨酸已经由精氨酸置换，及在152位的丙氨酸已经由丝氨酸置换。
[0061] SEQ ID N0:16显示变体乙内酰脲酶的氨基酸序列，其中在71位的精氨酸已经由缬 氨酸置换，在72位的酪氨酸已经由精氨酸置换，及在152位的丙氨酸已经由丝氨酸置换。
[0062] SEQ ID N0:17显示变体乙内酰脲酶的氨基酸序列，其中在71位的精氨酸已经由丝 氨酸置换，在72位的酪氨酸已经由精氨酸置换，及在152位的丙氨酸已经由半胱氨酸置换， 在154位的缬氨酸已经由丝氨酸置换，在181位的缬氨酸已经由丙氨酸置换。
[0063] SEQ ID N0:18显示变体乙内酰脲酶的氨基酸序列，其中在71位的精氨酸已经由酪 氨酸置换，在72位的酪氨酸已经由精氨酸置换，及在152位的丙氨酸已经由丝氨酸置换。
[0064] SEQ ID N0:19显示变体乙内酰脲酶的氨基酸序列，其中在71位的精氨酸已经由亮 氨酸置换，及在152位的丙氨酸已经由半胱氨酸置换，在154位的缬氨酸已经由丝氨酸置 换。
[0065] SEQ ID N0:20显示变体乙内酰脲酶的氨基酸序列，其中在71位的精氨酸已经由酪 氨酸置换，在72位的酪氨酸已经由组氨酸置换，及在152位的丙氨酸已经由丝氨酸置换。
[0066] SEQ ID N0:21-72显示如表1所示的用于诱变乙内酰脲酶的各种氨基酸位置的引 物序列。
[0067] SEQ ID N0:73显示与SEQ ID NO: 1相比携带取代I95H的变体乙内酰脲酶氨基酸序 列。
[0068] SEQ ID N0:74显示与SEQ ID NO: 1相比携带取代V154G的变体乙内酰脲酶氨基酸 序列。
[0069] SEQ ID N0:75显示与SEQ ID NO: 1相比携带取代V154N的变体乙内酰脲酶氨基酸 序列。
[0070] SEQ ID N0:76显示与SEQ ID NO: 1相比携带取代R71D的变体乙内酰脲酶氨基酸序 列。
[0071] SEQ ID NO:77显示与SEQ ID NO: 1相比携带取代R71E的变体乙内酰脲酶氨基酸序 列。
[0072] SEQ ID N0:78显示与SEQ ID NO: 1相比携带取代V284F的变体乙内酰脲酶氨基酸 序列。
[0073] SEQ ID N0:79显示与SEQ ID NO: 1相比携带取代V154A的变体乙内酰脲酶氨基酸 序列。
[0074] SEQ ID N0:80显示与SEQ ID NO: 1相比携带取代I64T的变体乙内酰脲酶氨基酸序 列。
[0075] SEQ ID N0:81显示与SEQ ID NO: 1相比携带取代I64V的变体乙内酰脲酶氨基酸序 列。
[0076] SEQ ID N0:82显示与SEQ ID NO: 1相比携带取代V154S的变体乙内酰脲酶氨基酸 序列。
[0077] SEQ ID N0:83显示与SEQ ID NO: 1相比携带取代V154A、T398A、H452L的变体乙内 酰脲酶氨基酸序列。
[0078] SEQ ID N0:84显示与SEQ ID N0:1相比携带取代A152S、V154I的变体乙内酰脲酶 氨基酸序列。
[0079] SEQIDN0:85显示与SEQIDN0:1相比携带取代R71D、Y72H、A152S的变体乙内酰 脲酶氨基酸序列。
[0080] SEQ ID N0:86显示与SEQ ID NO: 1相比携带取代R71V、Y72N、A152S的变体乙内酰 脲酶氨基酸序列。
[0081] SEQIDN0:87显示与SEQIDN0:1相比携带取代R71S、Y72N、A152C、V154S、V181A 的变体乙内酰脲酶氨基酸序列。
[0082] SEQIDN0:88显示与SEQIDN0:1相比携带取代R71D、Y72N、A152S的变体乙内酰 脲酶氨基酸序列。
[0083] SEQ ID N0:89显示与SEQ ID NO: 1相比携带取代R71Y、Y72N、A152S的变体乙内酰 脲酶氨基酸序列。
[0084] SEQ ID N0:90 显示与 SEQ ID NO: 1 相比携带取代 I64V、R71I、Y72N、A152S 的变体乙 内酰脲酶氨基酸序列。
[0085] SEQ ID N0:91 显示与 SEQ ID NO: 1 相比携带取代 I64C、R71Y、Y72N、A152S 的变体乙 内酰脲酶氨基酸序列。
[0086] SEQ ID N0:92 显示与 SEQ ID NO: 1 相比携带取代 I64C、R71D、Y72H、A152S 的变体乙 内酰脲酶氨基酸序列。
[0087] SEQ ID N0:93 显示与 SEQ ID NO: 1 相比携带取代 I64C、R71D、Y72H、A152S、F448L 的 变体乙内酰脲酶氨基酸序列。
[0088] SEQ ID N0:94 显示与 SEQ ID NO: 1 相比携带取代 I64C、R71D、Y72H、A152S、M417V 的 变体乙内酰脲酶氨基酸序列。
[0089] SEQ ID N0:95 显示与 SEQ ID NO: 1 相比携带取代 S14G、I64C、R71D、Y72H、A152S 的 变体乙内酰脲酶氨基酸序列。
[0090] SEQ ID N0:96 显示与 SEQ ID NO: 1 相比携带取代 S37R、I64C、R71D、Y72H、A152S 的 变体乙内酰脲酶氨基酸序列。
[0091] SEQ ID N0:97 显示与 SEQ ID NO: 1 相比携带取代 S14G、I64C、R71D、Y72H、A152S、 E358K的变体乙内酰脲酶氨基酸序列。
[0092] SEQ ID N0:98 显示与 SEQ ID NO: 1 相比携带取代 S37R、I64C、R71D、Y72H、A152S、 V318A的变体乙内酰脲酶氨基酸序列。
[0093] SEQ ID N0:99 显示与 SEQ ID NO: 1 相比携带取代 S37R、I64C、R71D、Y72H、A152S、 N303S、Q404R的变体乙内酰脲酶氨基酸序列。
[0094] SEQ ID N0:100 显示与 SEQ ID NO: 1 相比携带取代 S14G、I64C、R71D、Y72H、A152S、 N70D的变体乙内酰脲酶氨基酸序列。
[0095] SEQ IDN0:101 显示与 SEQ IDN0:1 相比携带取代 S14G、I64C、R71D、Y72H、A152S、 V154A的变体乙内酰脲酶氨基酸序列。
[0096] SEQ ID N0:102 显示与 SEQ ID NO: 1 相比携带取代 S37G、I64C、R71D、Y72H、A152S 的 变体乙内酰脲酶氨基酸序列。
[0097] SEQ ID N0:103 显示与 SEQ ID N0:1 相比携带取代 S14A、S37G、I64C、R71D、Y72H、 A152S的变体乙内酰脲酶氨基酸序列。
[0098] SEQ ID N0:104 显示与 SEQ ID NO: 1 相比携带取代 S14V、I64C、R71D、Y72H、A152S 的 变体乙内酰脲酶氨基酸序列。
[0099] SEQ ID N0:105 显示与 SEQ ID N0:1 相比携带取代 S14G、S37G、I64C、R71D、Y72H、 A152S的变体乙内酰脲酶氨基酸序列。
[0100] SEQ ID N0:106 显示与 SEQ ID N0:1 相比携带取代 S14A、S37W、I64C、R71D、Y72H、 A152S的变体乙内酰脲酶氨基酸序列。
[0101] SEQ ID N0:107 显示与 SEQ ID N0:1 相比携带取代 S14A、S37V、I64C、R71D、Y72H、 A152S的变体乙内酰脲酶氨基酸序列。
[0102] SEQ ID N0:108 显示与 SEQ ID NO: 1 相比携带取代 D15N、I64C、R71D、Y72H、A152S 的 变体乙内酰脲酶氨基酸序列。
[0103] SEQ ID N0:109 显示与 SEQ ID N0:1 相比携带取代 S14V、S37R、I64C、R71D、Y72H、 A152S的变体乙内酰脲酶氨基酸序列。
[0104] SEQIDN0:110显示与SEQIDN0:1相比携带取代D15N、I64C、R71D、Y72H、A152S、 V154C的变体乙内酰脲酶氨基酸序列。
[0105] SEQ IDN0:111 显示与 SEQ IDN0:1 相比携带取代 D15N、I64C、R71D、Y72H、A152S、 V154I的变体乙内酰脲酶氨基酸序列。
[0106] SEQ ID N0:112 显示与 SEQ ID N0:1 相比携带取代 S14P、D15G、S37G、I64C、R71D、 Y72H、A152S的变体乙内酰脲酶氨基酸序列。
[0107] SEQ ID N0:113 显示与 SEQ ID N0:1 相比携带取代 S14G、D15R、S37G、I64C、R71D、 Y72H、A152S的变体乙内酰脲酶氨基酸序列。
[0108] SEQ ID N0:114 显示与 SEQ ID N0:1 相比携带取代 S14G、D15Q、S37G、I64C、R71D、 Y72H、A152S的变体乙内酰脲酶氨基酸序列。
[0109] SEQ ID N0:115 显示与 SEQ ID N0:1 相比携带取代 S14F、D15A、S37G、I64C、R71D、 Y72H、A152S的变体乙内酰脲酶氨基酸序列。
[0110] SEQ ID N0:116 显示与 SEQ ID N0:1 相比携带取代 D15S、S37G、I64C、R71D、Y72H、 A152S的变体乙内酰脲酶氨基酸序列。
[0111] SEQ ID N0:117 显示与 SEQ ID N0:1 相比携带取代 S14P、D15G、S37G、R71D、Y72H、 A152S的变体乙内酰脲酶氨基酸序列。
[0112] SEQ ID N0:118 显示与 SEQ ID N0:1 相比携带取代 S14P、D15G、S37G、I64C、R71D、 Y72H的变体乙内酰脲酶氨基酸序列。
[0113] SEQIDN0:119显示与SEQIDN0:1相比携带取代D15S、S37G、I64C、R71D、Y72H的 变体乙内酰脲酶氨基酸序列。
[0114] 发明详述
[0115] 如上所述，本发明提供衍生自来自节杆菌的具有SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的野 生型乙内酰脲酶的新的乙内酰脲酶，其具有对于D-5-取代的乙内酰脲底物，特别是D-色氨 酸乙内酰脲提高的催化活性及任选提高的对映体选择性。
[0116] 本发明的乙内酰脲酶具有选自（i)或（ii)的氨基酸序列：
[0117] (i)氨基酸序列，其选自：SEQ IDN0:6、SEQ IDN0:7、SEQ IDN0:8、SEQ IDN0:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16,SEQ ID NO: 17,SEQ ID NO: 18,SEQ ID NO: 19,SEQ ID NO: 20,SEQ ID NO: 73,SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 80、SEQ IDN0:81、SEQ IDN0:82、SEQ IDN0:83、SEQ IDN0:84、SEQ IDN0:85、SEQ IDN0:86、SEQ ID N0:87、SEQ IDN0:88、SEQ IDN0:89、SEQ IDN0:90、SEQ IDN0:91、SEQ IDN0:92、SEQ IDN0:93、 SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO: 100,SEQ ID NO: 10USEQ ID NO: 102,SEQ ID NO: 103,SEQ ID NO: 104,SEQ ID NO: 105,SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 114、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 117、 SEQ ID NO: 118 或 SEQ ID NO: 119 ;
[0118] (ii)氨基酸序列，其中在 SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16,SEQ ID NO: 17,SEQ ID NO: 18,SEQ ID NO: 19,SEQ ID NO: 20,SEQ ID NO: 73,SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ IDN0:81、SEQ IDN0:82、SEQ IDN0:83、SEQ IDN0:84、SEQ IDN0:85、SEQ IDN0:86、SEQ ID N0:87、SEQ IDN0:88、SEQ IDN0:89、SEQ IDN0:90、SEQ IDN0:91、SEQ IDN0:92、SEQ IDN0:93、 SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO: 106,SEQ ID NO: 107,SEQ ID NO: 108,SEQ ID NO: 109,SEQ ID NO: 110,SEQ ID NO: 11USEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 114、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 117、 SEQ ID NO: 118、或SEQ ID NO: 119的氨基酸序列中，1至Φ个氨基酸残基已经被取代、缺失、 插入和/或添加，
[0119] 其中φ定义为φ = 75，
[0120] 及其中进一步地，所述乙内酰脲酶的催化活性比具有SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列 的乙内酰脲酶的催化活性高至少ζ倍，
[0121] 以及其中ζ定义为ζ = 1.2。
[0122] 在本发明中，如果未另外定义，乙内酰脲酶的催化活性定义为这种酶将5-取代的 D-乙内酰脲化合物转化为相应的D-氨基甲酰氨基酸的催化活性。
[0123] 在本发明中，乙内酰脲酶的对映体选择性定义为Daet/Laet比率，D aet =这种酶将 5_取代的D-乙内酰脲化合物转化为相应的D-氨基甲酰氨基酸的催化活性，Lart=这种酶将 5_取代的D-乙内酰脲化合物的对映异构体转化为相应的D-氨基甲酰氨基酸的对映异构体 的催化活性，换言之，L aet =这种酶将相应5-取代的L-乙内酰脲化合物转化为相应L-氨基 甲酰氨基酸的催化活性。
[0124] 在本发明优选的实施方案中，Φ 选自 70、60、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2 或1。
[0125] 在本发明进一步优选的实施方案中，ζ选自1. 5、2、3、4、5、10、15、20、25或30。
[〇126] 在本发明进一步优选的实施方案中，如下所述选择φ和ζ :
[0127] φ = 70 且 ζ = 1. 5, φ = 70 且 ζ = 2, φ = 70 且 ζ = 3, φ = 70 且 ζ = 4， φ = 70且 4 = 5, Φ = 7〇 且 4 = 1〇, Φ=7〇 且ζ = H φ = 70 且 ζ = 20, φ = 70 且 ζ = 25, φ = 70 且 ζ = 30，
[0128] φ = 60 且 ζ = ι· 5, φ = 60 且 ζ = 2, φ = 60 且 ζ = 3, φ = 60 且 ζ = 4， φ = 60 且 ζ = 5, φ = 60 且 ζ = 10, φ = 60 且 ζ = 15, φ = 60 且 ζ = 20, φ = 60且 ζ = 25, φ = 60 且 ζ = 30，
[0129] φ = 50 且 ζ = 1· 5, φ = 50 且 ζ = 2, φ = 50 且 ζ = 3, φ = 50 且 ζ = 4， Φ = 50且 ζ = 5, Φ = 5〇 且 ζ = 10, Ψ = 50 且 ζ = 15, φ = 50 且 ζ = 20, φ = 50且 ζ = 25, φ = 50且 ζ = 30，
[0130] φ = 40 且 ζ = 1· 5, φ = 40 且 ζ = 2, φ = 40 且 ζ = 3, φ = 40 且 ζ = 4， φ= 40 且 ζ = 5, φ = 40 且 ζ = 10, φ = 40 且 ζ = 15, φ = 40 且 ζ = 20, φ = 40且 ζ = 25, φ = 40 且 ζ = 30，
[0131] φ = 30 且 ζ = 1· 5, φ = 30且 ζ = 2, φ = 30且 ζ = 3, φ = 30 且 ζ = 4, φ = 30 且 ζ = 5,φ = 30-且 ζ =?〇,φ = 30 且 ζ =?5,φ = 30 且 ζ =20,φ = 3Ο 且 ζ =25, φ = 30且 ζ = 30，
[0132] φ = 20且 ζ = ?· 5, φ = 20且 ζ = 2, φ = 20且 ζ =3，φ = 20 且 ζ =4，φ = 20 且？ = 5, φ = 20且 ζ = ?υ，φ = 20 且 ζ = 15, φ = 20 且 ζ = 20, φ = 20 且 ζ =25, φ = 20且 ζ = 30，
[0133] φ = 10且 ζ = 1· 5, φ = 10且 ζ = 2, φ = 10且 ζ = 3, φ = 10 且 ζ = 4, φ = 10且 ζ = 5, φ= 10且 ζ = 10, φ = 10 且 ζ = 15, 10 且 ζ = 20, φ= 10 且 ζ = 25, φ= 10且 ζ = 30，
[0134] φ = 9且 ζ =?·5，φ = 9且 ζ =2，φ = 9 且 ζ =3，φ = 9且 ζ =4，φ = 9 且 ζ = 5，φ = 9且 ζ =1〇，φ = 9且 ζ =15，φ = 9且 ζ =20，φ = 9且 ζ =25，φ = 9 且 ζ = 30，
[0135] φ = 8且 ζ =?·5，φ = 8且 ζ =2，φ=8且 ζ =3，φ=8且 ζ =4，φ = 8且 ζ =5，φ = 8且 ζ =ιο，φ = 8且 ζ =?5，φ = 8且 ζ =2〇，φ = 8且 ζ =25，φ=8 且 ζ = 30，
[0136] φ = 7 且 ζ =ι·5，φ = 7 且 ζ =2，φ = 7 .且 ζ =3，φ = 7 且 ζ =4，φ = 7 且 ζ = 5，φ = 7且 ζ =10，φ = 7 且 ζ =15，φ = 7 且 ζ = 20，φ = 7 且 ζ = 25，φ = 7 且 ζ = 30，
[0137] φ = 6且 ζ =ι·5，φ = 6且 ζ = 2，φ = 6 且 ζ = 3，φ = 6且 ζ =4，φ = 6 且 ζ = 5，φ = 6且 ζ =?〇，φ = 6且 ζ =?5，φ = 6且 ζ = 20，φ = 6且 ζ = 25，φ = 6 且 ζ = 30,
[0138] φ = 5且 ζ =?·5，φ = 5且 ζ =2，φ = 5且 ζ =3，φ = 5且 ζ =4，φ = 5且 ζ =5，φ = 5且 ζ =?〇，φ = 5且 ζ =?5，φ = 5且 ζ =20，φ = 5且 ζ =25，φ=5 且 ζ = 30，
[0139] φ = 4且 ζ =1·5,φ = 4且 ζ = 2,φ = 4且ζ = 3，φ = 4且 ζ =4, φ = 4且 ζ =5，φ = 4且 ζ =10，φ = 4且 ζ =15，φ = 4且 ζ =20，φ = 4且 ζ =25，φ=4 且 ζ = 30，
[0140] φ = 3且 ζ =?·5，φ = 3 且 ζ =2，φ = 3 且 ζ =3，φ = 3 且 ζ =4，φ = 3 且 ζ =5,φ = 3 且 ζ =ιο，φ = 3 且 ζ =?5,φ = 3 且 ζ =2〇,φ = 3 且 ζ =25, φ = 3 且 ζ = 30，
[0141] φ = 2 且 ζ =?·5，φ = 2且 ζ =2，φ = 2且 ζ =3，φ = 2 且 ζ =4，φ = 2 且 ζ = 5,φ = 2且 ζ =?〇，φ = 2且 ζ =15,9 = 2且 ζ =20,9 = 2且 ζ =25,φ=2 且 ζ = 30，
[0142] φ=1且 ζ =1·5，φ=1且 ζ =2，φ=1且 ζ =3，φ=1且 ζ =4，φ=1 且 ζ = 5, φ = 1且 ζ = 10, φ = 1 且 ζ = 15, φ = 1,且 ζ = 20, φ = 1 且 ζ = 25, φ = 1 且 ζ = 30。
[0143] 在本发明的另一实施方案中，本发明的乙内酰脲酶与具有氨基酸序列SEQ ID Ν0:5 的乙内酰脲酶相比具有至少80%相同性或者具有包含最多90个氨基酸残基的删除、取代、 插入和/或添加的氨基酸序列；
[0144] 其中将在152、64、71、72、95、154、181、284、285、398和452位置的氨基酸残基定义 为 X152、X64、X71、X72、X95、X154、X181、X284、X285、X398 和 X452,并且其中这些氨基酸残 基进行选择如下：
[0145] X152 =除了丙氨酸之外的任何氨基酸残基；
[0146] X64 =任何氨基酸残基；
[0147] X71 =任何氨基酸残基；
[0148] X72 =任何氨基酸残基；
[0149] X95 =任何氨基酸残基；
[0150] X154 =任何氨基酸残基；
[0151] X181 =任何氨基酸残基；
[0152] X284 =任何氨基酸残基；
[0153] X285 =任何氨基酸残基；
[0154] X398 =任何氨基酸残基；
[0155] X452 =任何氨基酸残基；
[0156] 并且其中进一步地，所述乙内酰脲酶的催化活性与具有SEQ ID NO: 1所示氨基酸序 列的乙内酰脲酶的催化活性相比高至少1. 2倍。
[0157] 在一优选的实施方案中，所述催化活性比具有SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的乙内 酰脲酶的催化活性高至少1.5、2、3、4、5、10、15、20、25或30倍。
[0158] 在另一优选的实施方案中，对于D-乙内酰脲的对映体选择性比具有SEQ ID NO: 1 所示氨基酸序列的乙内酰脲酶的对映体选择性高至少1. 2、1. 5、2、3、4、5、10、15、20、25、30、 50、100或150倍。在更优选的实施方案中，针对D-5-吲哚基甲基乙内酰脲（D-色氨酸乙内 酰脲）的乙内酰脲酶的对映体选择性与具有SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的乙内酰脲酶相 比增加至少 1. 2 倍，优选至少 1. 5、2、3、4、5、10、15、20、25、30、50、100 或 150 倍。
[0159] 本领域技术人员理解如本文所述的乙内酰脲酶的变体也包括在本发明范围内。这 些变体乙内酰脲酶与具有SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:5所示氨基酸序列的乙内酰脲酶相比 分别具有至少80%相同性或者具有包含最多90个氨基酸残基的删除、取代、插入和/或添 加的氨基酸序列。在这些变体中，保留根据本发明的关于参考氨基酸序列（分别为SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:5)的特定氨基酸取代。
[0160] 此外，提供了具有乙内酰脲酶活性的上述蛋白质的衍生物，该衍生物与SEQ ID NO:5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 分别具有至少 80%相同性，优选至 少85%相同性，进一步优选至少90%相同性，再进一步优选至少95%相同性，进一步优选 至少96%相同性，进一步优选至少97%相同性，进一步优选至少98%相同性，最优选至少 99%相同性。如上所述，在这些变体中，保留了根据本发明的相对于参考序列（分别为SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:5)的氨基酸取代。
[0161] 此外，提供了具有乙内酰脲酶活性的上述蛋白质的衍生物，该衍生物由具有与SEQ ID N0:5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 所示氨基酸序列相比包含删除、 取代、插入和/或添加最多90个氣基酸残基的氣基酸序列的蛋白质表不。如上所述，在这 些变体中，保留了相对于参考序列（分别为SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:5)的根据本发明的氨 基酸取代。
[0162] 本发明还涉及变体乙内酰脲酶，其具有包含删除、取代、插入和/或添加最多90个 氨基酸残基的氨基酸序列。在本文使用的短语"包含最多90个氨基酸残基的删除、取代、 插入和/或添加"中"最多90个氨基酸残基"的范围可限于最多70个、优选最多45个、进 一步优选最多40个、更优选最多35个、进一步优选最多30个、进一步优选最多25个、进一 步优选最多20个、更优选最多15个、进一步优选最多10个及最优选最多5个氨基酸残基。 在本文使用的短语"包含最多90个氨基酸残基的删除、取代、插入和/或添加"中术语"最 多90个氨基酸残基"优选是指1-70个、优选1-45个、进一步优选1-40个、更优选1-35个、 进一步优选卜30个、进一步优选1-25个、进一步优选1-20个、更优选1-15个、进一步优选 1-10个，及最优选1-5个氨基酸残基。术语"添加"是指相对于上述序列在N-末端或C-末 端添加氨基酸残基。
[0163] 此外，本发明提供了分别具有 SEQ ID N0:5、6、7、8、9、10、ll、12、13、14、15、16、17、 18、19或20所示氨基酸序列的具有乙内酰脲酶活性的上述蛋白质的片段，其中优选所述片 段含有 SEQ ID N0:5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 所示氨基酸序列的至 少300个、进一步优选至少350个及特别优选至少400个及最优选至少450个连续氨基酸， 或者如上定义的其衍生物。
[0164] 在本发明的另一实施方案中，X152、X64、X71、X72、X95、X154、X181、X284、X285、 X398、X452进一步限定如下：
[0165] X152 = Cys、Gly、Ser、Thr 或 Val ;
[0166] X64 = lie、Thr 或 Val ;
[0167] X71 = Arg、Gin、Asp、Glu、Val、Ser、Tyr 或 Leu ;
[0168] X72 = Tyr、His 或 Asn ;
[0169] X95 = lie 或 His ;
[0170] X154 = Val、Ala、Cys、Gly、lie、Asn 或 Ser ;
[0171] X181 = Val 或 Ala ;
[0172] X284 = Val 或 Phe ;
[0173] X285 = Ala 或 Asp ;
[0174] X398 = Thr 或 Ala ;
[0175] X452 = His 或 Leu。
[0176] 在本发明的另一实施方案中，X152、X64、X71、X72、X95、X154、X181、X284、X285、 X398、X452进一步限定如下：
[0177] X152 = Cys、Ser 或 Val ;
[0178] X64 = lie、Thr 或 Val
[0179] X71 = Arg、Gin、Asp、Glu、Val、Ser、Tyr 或 Leu
[0180] X72 = Tyr、His 或 Asn
[0181] X95 = lie 或 His ;
[0182] X154 = Cys、lie 或 Ser ;
[0183] X181 = Val 或 Ala ;
[0184] X284 = Val 或 Phe ;
[0185] X285 = Ala 或 Asp ;
[0186] X398 = Thr 或 Ala ;
[0187] X452 = His 或 Leu。
[0188] 在本发明的另一实施方案中，X152、X154进一步限定如下：
[0189] X152 = Cys、Gly、Ser、Thr 或 Val ;
[0190] X154 = Ala、Cys、Gly、lie、Asn 或 Ser。
[0191] 在本发明的另一实施方案中，X152、X154进一步限定如下：
[0192] X152 = Cys、Ser 或 Val ;
[0193] X154 = Cys、lie 或 Ser。
[0194] 在本发明的另一实施方案中，X152进一步限定如下：
[0195] X152 = Ser ;X152 = Cys ;X152 = Val ;X152 = Gly 或者 X152 = Thr。
[0196] 在本发明的另一实施方案中，X152和X154进一步限定如下：
[0197] X152 = Ser ；X154 = Ile〇
[0198] 在本发明的另一实施方案中，X152和X154进一步限定如下：
[0199] X152 = Val ；X154 = Cys〇
[0200] 在本发明的另一实施方案中，X152和X154进一步限定如下：
[0201] X152 = Cys ;X154 = Ser。
[0202] 在本发明的另一实施方案中，X152、X71、X72、X154、X181进一步限定如下：
[0203] X152 = Ser ;X71 = Asp ;X72 = His ;X154 = Val ;X181 = Val。
[0204] 在本发明的另一实施方案中，X152、X71、X72、X154、X181进一步限定如下：
[0205] X152 = Ser ;X71 = Asp ;X72 = Asn ;X154 = Val ;X181 = Val。
[0206] 在本发明的另一实施方案中，X152、X71、X72、X154、X181进一步限定如下：
[0207] X152 = Ser ;X71 = Val ;X72 = Asn ;X154 = Val ;X181 = Val。
[0208] 在本发明的另一实施方案中，X152、X71、X72、X154、X181进一步限定如下：
[0209] X152 = Cys ;X71 = Ser ;X72 = Asn ;X154 = Ser ;X181 = Ala。
[0210] 在本发明的另一实施方案中，X152、X71、X72、X154、X181进一步限定如下：
[0211] X152 = Ser ；X71 = Tyr ；X72 = Asn ；X154 = Val ；X181 = Val〇
[0212] 在本发明的另一实施方案中，X152、X71、X72、X154、X181进一步限定如下：
[0213] X152 = Cys ;X71 = Leu ;X72 = Tyr ;X154 = Ser ;X181 = Val。
[0214] 在本发明的另一实施方案中，X152、X71、X72、X154、X181进一步限定如下：
[0215] X152 = Ser ;X71 = Tyr ;X72 = His ;X154 = Val ;X181 = Val。
[0216] 在本发明的另一实施方案中，提供了乙内酰脲酶，其中X152、X64、X71、X72、X95、 X154、Π 81、X284、X285、X398、X452 进一步限定如下：
[0217] X152 = Ser ；X64 = lie ；X71 = Arg ；X72 = Tyr ；X95 = lie ；X154 = Val ；X181 = Val ；X284 = Val ；X285 = Ala ；X398 = Thr ；X452 = His〇
[0218] 在本发明的另一实施方案中，X152、X64、X71、X72、X95、X154、X181、X284、X285、 X398、X452进一步限定如下：
[0219] X152 = Cys ；X64 = lie ；X71 = Arg ；X72 = Tyr ；X95 = lie ；X154 = Val ；X181 = Val ；X284 = Val ；X285 = Ala ；X398 = Thr ；X452 = His〇
[0220] 在本发明的另一实施方案中，X152、X64、X71、X72、X95、X154、X181、X284、X285、 X398、X452进一步限定如下：
[0221] X152 = Val ；X64 = lie ；X71 = Arg ；X72 = Tyr ；X95 = lie ；X154 = Val ；X181 = Val ；X284 = Val ；X285 = Ala ；X398 = Thr ；X452 = His〇
[0222] 在本发明的另一实施方案中，X152、X64、X71、X72、X95、X154、X181、X284、X285、 X398、X452进一步限定如下：
[0223] X152 = Gly ；X64 = lie ；X71 = Arg ；X72 = Tyr ；X95 = lie ；X154 = Val ；X181 = Val ；X284 = Val ；X285 = Ala ；X398 = Thr ；X452 = His〇
[0224] 在本发明的另一实施方案中，X152、X64、X71、X72、X95、X154、X181、X284、X285、 X398、X452进一步限定如下：
[0225] X152 = Thr ；X64 = lie ；X71 = Arg ；X72 = Tyr ；X95 = lie ；X154 = Val ；X181 = Val ；X284 = Val ；X285 = Ala ；X398 = Thr ；X452 = His〇
[0226] 在本发明的另一实施方案中，X152、X64、X71、X72、X95、X154、X181、X284、X285、 X398、X452进一步限定如下：
[0227] X152 = Ser ；X64 = lie ；X71 = Arg ；X72 = Tyr ；X95 = lie ；X154 = lie ；X181 = Val ；X284 = Val ；X285 = Ala ；X398 = Thr ；X452 = His〇
[0228] 在本发明的另一实施方案中，X152、X64、X71、X72、X95、X154、X181、X284、X285、 X398、X452进一步限定如下：
[0229] X152 = Val ；X64 = lie ；X71 = Arg ；X72 = Tyr ；X95 = lie ；X154 = Cys ；X181 = Val ；X284 = Val ；X285 = Ala ；X398 = Thr ；X452 = His〇
[0230] 在本发明的另一实施方案中，X152、X64、X71、X72、X95、X154、X181、X284、X285、 X398、X452进一步限定如下：
[0231] X152 = Cys ；X64 = lie ；X71 = Arg ；X72 = Tyr ；X95 = lie ；X154 = Ser ；X181 = Val ；X284 = Val ；X285 = Ala ；X398 = Thr ；X452 = His〇
[0232] 在本发明的另一实施方案中，X152、X64、X71、X72、X95、X154、X181、X284、X285、 X398、X452进一步限定如下：
[0233] X152 = Ser ；X64 = lie ；X71 = Asp ；X72 = His ；X95 = lie ；X154 = Val ；X181 = Val ；X284 = Val ；X285 = Ala ；X398 = Thr ；X452 = His〇
[0234] 在本发明的另一实施方案中，X152、X64、X71、X72、X95、X154、X181、X284、X285、 X398、X452进一步限定如下：
[0235] X152 = Ser ；X64 = lie ；X71 = Asp ；X72 = Asn ；X95 = lie ；X154 = Val ；X181 = Val ；X284 = Val ；X285 = Ala ；X398 = Thr ；X452 = His〇
[0236] 在本发明的另一实施方案中，X152、X64、X71、X72、X95、X154、X181、X284、X285、 X398、X452进一步限定如下：
[0237] X152 = Ser ；X64 = lie ；X71 = Val ；X72 = Asn ；X95 = lie ；X154 = Val ；X181 = Val ；X284 = Val ；X285 = Ala ；X398 = Thr ；X452 = His〇
[0238] 在本发明的另一实施方案中，X152、X64、X71、X72、X95、X154、X181、X284、X285、 X398、X452进一步限定如下：
[0239] X152 = Cys ；X64 = lie ；X71 = Ser ；X72 = Asn ；X95 = lie ；X154 = Ser ；X181 = Ala ；X284 = Val ；X285 = Ala ；X398 = Thr ；X452 = His〇
[0240] 在本发明的另一实施方案中，X152、X64、X71、X72、X95、X154、X181、X284、X285、 X398、X452进一步限定如下：
[0241] X152 = Ser ；X64 = lie ；X71 = Tyr ；X72 = Asn ；X95 = lie ；X154 = Val ；X181 = Val ；X284 = Val ；X285 = Ala ；X398 = Thr ；X452 = His〇
[0242] 在本发明的另一实施方案中，X152、X64、X71、X72、X95、X154、X181、X284、X285、 X398、X452进一步限定如下：
[0243] X152 = Cys ；X64 = lie ；X71 = Leu ；X72 = Tyr ；X95 = lie ；X154 = Ser ；X181 = Val ；X284 = Val ；X285 = Ala ；X398 = Thr ；X452 = His〇
[0244] 在本发明的另一实施方案中，X152、X64、X71、X72、X95、X154、X181、X284、X285、 X398、X452进一步限定如下：
[0245] X152 = Ser ；X64 = lie ；X71 = Tyr ；X72 = His ；X95 = lie ；X154 = Val ；X181 = Val ；X284 = Val ；X285 = Ala ；X398 = Thr ；X452 = His〇
[0246] 在本发明的另一实施方案中，本发明的乙内酰脲酶将下列底物的至少一种转化为 相应的氨基甲酰氨基酸，所述底物包括乙内酰脲、5-甲基乙内酰脲、5-苯甲基乙内酰脲、 5-(4-羟基苯甲基）乙内酰脲、5-吲哚基甲基乙内酰脲、5-(3, 4-二羟基苯甲基）乙内酰脲、 5_甲基硫代乙基乙内酰脲、5-异丙基乙内酰脲、5-异丁基乙内酰脲、5-仲-丁基乙内酰脲、 5_ (4-氨基丁基）乙内酰脲、5-羟基甲基乙内酰脲或者对应于非天然氨基酸的5-取代的乙 内酰脲化合物、其相应的衍生物，其中所述乙内酰脲酶转化所述底物的催化活性至少与具 有SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的乙内酰脲酶的转化D-5-吲哚基甲基乙内酰脲的催化活性 一样高。
[0247] 如上所述，本发明的乙内酰脲酶的底物可以是任何D-5-取代的乙内酰脲化合物， 其能够作为这种酶的特异性底物而被水解。也包括对应于非天然氨基酸或其衍生物的 5-取代的乙内酰脲化合物。非天然氨基酸或其衍生物是指不是由标准遗传密码编码的氨基 酸。非天然氨基酸的相应的乙内酰脲或其衍生物包括5-苯基乙内酰脲、5-(4-羟基苯基） 乙内酰脲、5-甲氧基甲基乙内酰脲、5-苄氧基甲基乙内酰脲、5_(3, 4-甲二氧基苯甲基）乙 内酰脲、二氢尿嘧啶。优选地，本发明的乙内酰脲酶的底物是D，L-5-吲哚基甲基乙内酰脲， 更优选D-5-吲哚基甲基乙内酰脲。
[0248] 本发明还提供编码本发明的乙内酰脲酶的多核苷酸。
[0249] 因此，本发明提供了分离的或重组的多核苷酸，其在严格条件下与具有如上述本 发明核苷酸序列的多核苷酸的全长互补序列杂交，所述严格条件包括在IX氯化钠/柠檬 酸钠（SSC)和0. 1%十二烷基硫酸钠（SDS)溶液中在65°C洗涤；
[0250] 其中所述乙内酰脲酶的催化活性比具有SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的乙内酰脲 酶的催化活性高至少ξ倍，
[0251] 及其中ζ定义为ζ = 1. 2。
[0252] 本发明还提供包含如上述编码本发明乙内酰脲酶的多核苷酸的载体。优选地，所 述载体进一步包含与所述多核苷酸可操纵地连接并且适于在宿主细胞中表达的调节序列。
[0253] 本发明进一步提供分离的或转化的宿主细胞，其包含如上述编码本发明乙内 酰脲酶的多核苷酸或者包含所述多核苷酸的载体。优选地，所述宿主选自大肠杆菌 (Escherichia coli)、棒状细菌、芽孢杆菌（Bacillus sp.)。所述宿主细胞表达本发明的乙 内酰脲酶。在一优选的实施方案中，宿主细胞表达至少选自以下一组的酶活性：乙内酰脲 酶；乙内酰脲酶和乙内酰脲消旋酶；乙内酰脲酶和氨甲酰水解酶；或者乙内酰脲酶和乙内 酰脲消旋酶及氨甲酰水解酶。
[0254] 此外，本发明提供了一种制备氨基酸的方法，包括如下步骤：
[0255] (a)向反应介质提供本发明的乙内酰脲酶的乙内酰脲酶活性和氨甲酰水解酶活性 及至少一种5-取代的乙内酰脲，任选向所述反应介质提供乙内酰脲消旋酶活性；
[0256] (b)温育所述反应介质以使得通过在（a)中提供的酶活性将5-取代的乙内酰脲转 化为相应的氨基酸；及
[0257] (c)从反应介质中回收得自相应的5-取代的乙内酰脲的酶促转化的氨基酸。
[0258] 在优选的方法中，所述5-取代的乙内酰脲选自D，L-5-取代的乙内酰脲、D，L-5-吲 哚基甲基乙内酰脲（=D，L-色氨酸乙内酰脲）、D-5-取代的乙内酰脲、D-5-吲哚基甲基乙 内酰脲（ = D-色氨酸乙内酰脲）。
[0259] 在进一步优选的方法中，提供给反应介质的所述5-取代的乙内酰脲是L-5-取代 的乙内酰脲或者D，L-5_取代的乙内酰脲，此外，在步骤（a)中给反应介质提供乙内酰脲消 旋酶活性以将L-5-取代的乙内酰脲或者D，L-5-取代的乙内酰脲转化为D-5-取代的乙内 酰脲。
[0260] 在另一优选的方法中，要制备的氨基酸是D-色氨酸，及5-取代的乙内酰脲选自 D-5-吲哚基甲基乙内酰脲、L-5-吲哚基甲基乙内酰脲或者D，L-5-吲哚基甲基乙内酰脲。
[0261] 在所述方法中，5-取代的乙内酰脲由本发明的乙内酰脲酶转化为相应的氨基甲酰 氨基酸，其通过所述氨甲酰水解酶活性被转化为相应的氨基酸。在特别优选的实施方案中， 所述氨基甲酰氨基酸选自N-(氨基羰基）-DL-色氨酸（=N-氨基甲酰-DL-色氨酸；=CA 索引名：N-(氨基羰基）-色氨酸；=登记号：98299-50-4 ;化学式：C12H13N303)或者N-氨 基甲酰-L-色氨酸（=CA索引名：N-(氨基羰基）-L-色氨酸=登记号：89595-64-2 ;化学 式：C12H13N303)。
[0262] 在另一优选的方法中，反应介质是部分或全部由细胞培养基组成的介质，所述乙 内酰脲酶活性由本发明的宿主细胞提供，所述宿主细胞在所述细胞反应介质中培养。
[0263] 在特别优选的方法中，所述反应介质是部分或全部由细胞培养基组成的介质，及 所述氨甲酰水解酶活性由本发明的宿主细胞或者由第二种宿主细胞提供，所述宿主细胞在 所述反应介质中培养。
[0264] 在一优选的实施方案中，将在不同的细胞或者在相同细胞中表达乙内酰脲酶活性 和氨甲酰水解酶活性及任选地，乙内酰脲消旋酶活性的宿主细胞在细胞培养基中培养，以 产生生物量，然后分离细胞培养基与生物量，使用缓冲液或水使生物量重悬浮。在加入所述 生物量之前、期间或之后在所述缓冲液或水中加入底物，以使底物的转化开始。
[0265] 本发明的乙内酰脲酶可以如，例如，在Biocatalytic Production of Amino Acids and Derivatives(Rozzell, J. D. and Wagner, F. eds. , Hanser Publisher, NY, at pages75-176 (1992))中所述使用，用于从D，L-5-单取代的乙内酰脲生产光学纯的氨基 酸。乙内醜脈酶的一般应用也在1]12：71116〇3七315^丨8；[11〇找311；^87111：1168丨8"（0四112，1(· and Waldmann，H. eds.，VCH-Verlag，Weinheim，at pages409_431 (1995))和 Wagner, T. et al. (Production of1-methionine from D, L-5-(2-methylthioethyl)hydantoin by resting cells of a new mutant strain of Arthrobacter species DSM7330, Journal of Biotechnology46:63_68 (l"6))中描述。
[0266] 对于将D，L-或L-5-取代的乙内酰脲或者D，L-或L-氨基甲酰氨基酸经酶转化为 相应的D-氨基酸，优选应用全细胞催化技术，其包括表达本发明的乙内酰脲酶及表达氨甲 酰水解酶，进一步优选也表达乙内酰脲消旋酶。
[0267] 本发明的乙内酰脲酶可以其游离或固定化形式用于这种方法中。氨甲酰水解酶 和乙内酰脲消旋酶也可以被固定化。固定化酶的技术为本领域技术人员熟知。优选的 方法在 Bhavender P. Sharma, Lorraine F. Bailey and Ralph A. Messing(Immobilisierte Biomaterialien Techniken und Anwendungen, Angew.Chem. , 94,pp.836-852 (1992))； Dordick et al. (J. Am. Chem. Soc., 116, pp. 5009-5010(1994)) ；0kahata et al. , Tetrahedron Lett.,38,pp. 1971-1974 (1997)) ；Adlercreutz et al. (Biocatalysis ,6,291-305(1992)) ；Goto et al. (Biotechnol. Prog. 10, pp. 263-268 (1994)) ；Kamiya et al. (Biotechnol. Prog. , 11, pp. 270-275(1995)) ；0kahata et al. (Tibtech, Februaryl997, 15, pp. 50-54) ;Fishmanetal. (Biotechnol. Lett. ,20, pp. 535-538 (1998))中提及。
[0268] 将5-取代的乙内酰脲或氨基甲酰氨基酸转化为相应的氨基酸可以分批或 者连续方式进行。有利地，使用酶-膜-反应器作为反应容器（Wandrey et al. in Jahrbuchl998, Verfahrenstechnik und Chemieingenieurwesen, VDI S. 151ff. ；ffandrey et al. in Applied Homogeneous Catalysis with Organometallic Compounds, Vol. 2, VCH1996, pp. 832ff. ；Kragl et al. , Angew. Chem. , 6, pp. 684f. (1996)) 〇
[0269] 关于使用全细胞催化方法生产氨基酸，有利地，由于高再生率和应用的生长 条件易于达到而使用细菌细胞。本领域技术人员已知有一些细菌可用于这方面。优 选地，在这方面，可以使用大肠杆菌作为所述细胞和表达系统（Yanisch-Perron et al.，Gene, 33, 103-109(1985))。
[0270] 为了生产氨基酸，表达本发明的乙内酰脲酶及优选另外表达氨甲酰水解酶及进一 步优选另外表达乙内酰脲消旋酶的细胞可用于培养基中。或者，相应的分离的细胞、洗涤的 细胞、细胞处理产物、得自细胞处理产物的粗制酶溶液或者纯化的酶溶液可用于反应混合 物中。为了进行反应，将分别含有5-取代的乙内酰脲化合物作为底物的所述培养基或反应 混合物保持在温度15-451：，优选25-401：，？册-9，优选？册-8，同时静置或搅动8小时至5 天。所述培养基或反应混合物分别可进一步含有过渡金属离子，优选地，所述过度金属离子 选自Zn 2+、Mn2+和Co2+，浓度为0. 02mM-10mM，优选0. lmM-5mM。当使用完整细胞时，所述反应 混合物可进一步含有为转化的细胞生长必需的营养成分，如碳源、氮源和无机离子。此外， 可以在培养基或反应混合物中按份数加入底物（5-取代的乙内酰脲或氨基甲酰氨基酸化 合物）。
[0271] 由于所述方法中采用的酶也能催化相应的逆反应，因此本发明另外还提供制备如 上述的D-氨基酸的方法，其中使用N-氨基甲酰-D，L-氨基酸或N-氨基甲酰-L-氨基酸代 替5-取代的乙内酰脲作为底物：
[0272] 所述N-氨基甲酰-D，L-氨基酸或N-氨基甲酰-L-氨基酸通过本发明的乙内酰脲 酶被转化为相应的D，L-5-取代的乙内酰脲或L-5-取代的乙内酰脲化合物。此外，通过乙内 酰脲消旋酶将所述D，L-5-取代的乙内酰脲或L-5-取代的乙内酰脲化合物转化为D-对映 异构体，即相应的D-5-取代的乙内酰脲化合物。然后，D-5-取代的乙内酰脲化合物通过本 发明的乙内酰脲酶被转化为相应的N-氨基甲酰-D-氨基酸。随后，氨甲酰水解酶将N-氨 基甲酰-D-氨基酸转化为相应的D-氨基酸。在这个方法的特别优选的实施方案中，用作底 物的N-氨基甲酰氨基酸是N-(氨基羰基）-DL-色氨酸（=N-氨基甲酰-DL-色氨酸；=CA 索引名：N-(氨基羰基）-色氨酸；=登记号：98299-50-4 ;化学式：C12H13N303)或者N-氨 基甲酰-L-色氨酸（=CA索引名：N-(氨基羰基）-L-色氨酸=登记号：89595-64-2 ;化学 式：C12H13N303)。
[0273] 在培养基或反应混合物中产生的氨基酸可以通过已知方法快速定量。为此，可以 使用高压液相层析（HPLC)，采用C-18柱及例如含有1%乙腈的20mM磷酸钾（pH2. 3)及含 有10% H20的乙腈的混合物作为洗脱液。
[0274] 在培养基或反应混合物中积聚的氨基酸可以通过标准方法从培养基或反应混合 物中收集。例如，可以采用如过滤、离心、真空浓缩、离子交换或吸附层析、结晶化等方法，如 果需要可以彼此组合。
[0275] 如下反应方案显示催化的转化（以转化D-乙内酰脲为例）中包含的反应步骤和 酶。通过D-乙内酰脲酶的催化活性将D-乙内酰脲转化为N-氨基甲酰-D-氨基酸，所述 D-乙内酰脲酶催化水解D-5-取代的乙内酰脲化合物的反应，产生N-氨基甲酰-D-氨基 酸。在进一步的反应步骤中，称作N-氨基甲酰氨基酸水解酶的一种酶催化水解N-氨基甲 酰-D-氨基酸的反应，产生光学活性D-氨基酸。进一步地，称作乙内酰脲消旋酶的一种酶 催化光学活性的L-乙内酰脲化合物转化为光学活性的D-乙内酰脲化合物，反之亦然。
[0276] 反应方案
[0277]
【权利要求】
1. 具有选自（i)或（ii)的氨基酸序列的乙内酰脲酶： (i) 氨基酸序列，其选自：SEQ IDN0:6、SEQ IDN0:7、SEQ IDN0:8、SEQ IDN0:9、SEQ ID N0:10、SEQ IDN0:11、SEQ IDN0:12、SEQ IDN0:13、SEQ IDN0:14、SEQ IDN0:15、SEQ IDN0:16、 SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ IDNO:82、SEQ IDNO:83、SEQ IDN0:84、SEQ IDNO:85、SEQ IDNO:86、SEQ IDNO:87、 SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 114、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 117、 SEQ ID NO: 118 或 SEQ ID NO: 119 ; (ii) 氨基酸序列，其中在 SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10,SEQ IDN0:1USEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13,SEQ ID NO: 14,SEQ ID NO: 15,SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID N0:8USEQ ID N0:82,SEQ IDN0:83,SEQ ID N0:84,SEQ IDN0:85,SEQ IDN0:86,SEQ IDN0:87, SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 114、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 117、 SEQ ID NO: 118或SEQ ID NO: 119的氨基酸序列中，l-φ个氨基酸残基已经被取代、删除、插入 和/或添加， 其中φ定义为tp = 75， 以及其中进一步，所述乙内酰脲酶的催化活性比具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的乙内 酰脲酶的催化活性高至少ξ倍， 以及其中ξ定义为ξ = 1.2。
2. 权利要求1的乙内酰脲酶，其中Φ选自70、60、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、 1〇
3. 权利要求1的乙内酰脲酶，其中ζ选自1. 5、2、3、4、5、10、15、20、25或30。
4. 权利要求1-3任一项的乙内酰脲酶，其中所述乙内酰脲酶将如下底物中的至少一种 转化为相应的氨基甲酰氨基酸：乙内酰脲、5-甲基乙内酰脲、5-苯甲基乙内酰脲、5-(4-羟 基苯甲基）乙内酰脲、5-吲哚基甲基乙内酰脲、5-(3, 4-二羟基苯甲基）乙内酰脲、5-甲 基硫代乙基乙内酰脲、5-异丙基乙内酰脲、5-异丁基乙内酰脲、5-仲-丁基乙内酰脲、 5_ (4-氨基丁基）乙内酰脲、5-羟基甲基乙内酰脲或者对应于非天然氨基酸的5-取代的乙 内酰脲化合物、其相应的衍生物，其中所述乙内酰脲酶在转化所述底物方面的催化活性至 少与具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的乙内酰脲酶在转化D-5-吲哚基甲基乙内酰脲方面的 催化活性一样高。
5. 权利要求1-4任一项的乙内酰脲酶，其中对D-乙内酰脲的对映体选择性比具有SEQ ID N0:1的氨基酸序列的乙内酰脲酶的对映体选择性高至少1.2、1.5、2、3、4、5、10、15、20、 25、30、50、100 或 150 倍。
6. 编码权利要求1-5任一项的乙内酰脲酶的多核苷酸。
7. 分离的或重组的多核苷酸，其与具有权利要求6的核苷酸序列的多核苷酸的全长互 补序列在严格条件下杂交，所述严格条件包括在IX氯化钠/柠檬酸钠（SSC)和0. 1 %十二 烷基硫酸钠（SDS)溶液中在65°C洗； 其中所述乙内酰脲酶的催化活性比具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的乙内酰脲酶的催 化活性高至少ξ倍， 及其中ξ定义为ξ = 1.2。
8. 包含权利要求6或7的多核苷酸的载体。
9. 分离的或转化的宿主细胞，其包含权利要求6或7的多核苷酸或者权利要求8的载 体。
10. 权利要求9的宿主细胞，其表达至少选自以下一组的酶活性：乙内酰脲酶；乙内酰 脲酶和乙内酰脲消旋酶；乙内酰脲酶和和氨甲酰水解酶；或者乙内酰脲酶和乙内酰脲消旋 酶及氨甲酰水解酶。
11. 制备氨基酸的方法，其包括如下步骤： (a) 向反应介质提供权利要求1-5任一项的乙内酰脲酶的乙内酰脲酶活性及氨甲酰水 解酶活性和至少一种5-取代的乙内酰脲，及任选地向所述反应介质提供乙内酰脲消旋酶 活性； (b) 温育所述反应介质，以使得通过在（a)中提供的酶活性将5-取代的乙内酰脲转化 为相应的氨基酸；及 (c) 从所述反应介质中回收得自相应的5-取代的乙内酰脲的酶促转化的氨基酸。
12. 权利要求11的方法，其中所述5-取代的乙内酰脲选自D，L-5-取代的乙内酰脲、 D，L-5-吲哚基甲基乙内酰脲（=D，L-色氨酸乙内酰脲）、D-5-取代的乙内酰脲、D-5-吲哚 基甲基乙内酰脲（ = D-色氨酸乙内酰脲）。
13. 权利要求11或12的方法，其中提供给反应介质的所述5-取代的乙内酰脲是 L-5-取代的乙内酰脲或D，L-5-取代的乙内酰脲，以及其中在步骤（a)中另外向反应介质 提供乙内酰脲消旋酶活性以将L-5-取代的乙内酰脲或者D，L-5-取代的乙内酰脲转化为 D-5-取代的乙内酰脲。
14. 权利要求11-13任一项的方法，其中要制备的氨基酸是D-色氨酸，及其中5-取代 的乙内酰脲选自D-5-吲哚基甲基乙内酰脲、L-5-吲哚基甲基乙内酰脲或者D，L-5-吲哚基 甲基乙内酰脲。
15. 权利要求13-14任一项的方法，其中所述反应介质是部分或全部由细胞培养基组 成的介质，其中乙内酰脲酶活性由权利要求9或10的宿主细胞提供，以及其中所述宿主细 胞在所述反应介质中培养。
16. 权利要求11-15任一项的方法，其中所述反应介质是部分或全部由细胞培养基组 成的介质，所述氨甲酰水解酶活性由权利要求9或10的宿主细胞提供，以及其中所述宿主 细胞在所述反应介质中培养。
【文档编号】C12N9/86GK104053772SQ201280067105
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2012年11月16日 优先权日:2011年11月16日
【发明者】S·奥斯瓦尔德, H·舒斯特, J·罗斯, A·卡劳, U·施瓦内贝格, R·马丁内斯, H·蒙德哈达, U·霍尔特 申请人:赢创工业集团股份有限公司