一种抗体及其制备方法与应用的制作方法

专利名称：一种抗体及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗体及其制备方法与应用。
背景技术：
表皮生长因子受体(epidemic growth factor receptor, EGFR)是表皮生长因 子基因(erbB)家族的一员，在约30%的人体肿瘤中过度表达，尤其是非小细胞型肺癌、头 颈部鳞状细胞癌和结直肠癌等。国内外许多研究表明，针对EGFR的抗体可有效地在胞外 通过阻断配体的结合来实现对EGFR信号转导导途径的抑制，对多种由EGFR过度表达或/ 和突变所引起的人体肿瘤，尤其是头颈部鳞状细胞癌(80% 100% )，结直肠癌(25% 77%)，非小细胞型肺癌(40% 80%)等有较好的疗效。表皮生长因子受体成为目前研究 较深入且倍受关注的肿瘤治疗靶点之一，应用基因工程研制抗EGFR的单克隆抗体，成为肿 瘤免疫治疗的研究热点之一。2004、2006年，美国FDA先后批准了针对EGFR的鼠-人嵌合抗体西妥昔单抗 (cetuximab)和全人抗体帕尼单抗(panitumumab)，用于结直肠癌治疗；2005年，抗EGFR的 人源化抗体尼莫珠单抗(nimotuzumab)获得了我国药监局(SFDA)批准的一类新药证书，目 前正在进行II/III期临床试验。鼠源单抗在人体应用中可产生人抗鼠抗体反应，从而影响 其功能的发挥。采用基因工程技术改造的鼠_人嵌合抗体可大幅度减弱鼠单抗的免疫原 性、延长抗体在体内的半衰期并可借助人免疫球蛋白Fc段介导免疫调理及ADCC效应，进而 增强抗体的生物学效应，但该嵌合抗体结合抗原的能力低于鼠源抗体98. 7%。大量临床前 及临床试验均已证实西妥昔单抗单药及联合化疗/放疗具有较好的疗效，但简单CDR移植 往往会引起抗原抗体亲和力的下降；帕尼单抗是采用转基因小鼠技术制备的全人抗体，与 嵌合抗体和人源化抗体相比，人源序列接近100 %，大大增强了抗体靶亲和力，但该抗体具 有鼠糖基化模式、半衰期短和超敏反应更多等缺点。尼莫珠单抗则通过对抗EGFR鼠源单抗 进行人源化改造获得了人源化抗体，并把抗体的轻、重链基因分别连接至不同的表达载体 进行表达，由于轻重链表达存在较大差异，往往导致完整抗体分子表达水平极低。

发明内容
本发明的一个目的是提供一种可与表皮生长因子受体(EGFR)结合的抗体。本发明所提供的抗体，其重链可变区的氨基酸序列如序列表中序列3所示，其轻 链的氨基酸序列如序列表中序列2所示。上述抗体的编码基因也属于本发明的保护范围。所述重链可变区的编码基因为如下1)、2)或3)所示1)其核苷酸序列是序列表中序列6所示DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述重链可变区的DNA分子；3)与序列表中序列6自5'末端起第153bp-210bp位核苷酸具有70%以上的同源 性且编码所述重链可变区的DNA分子；
所述轻链的编码基因为如下I)、II)或III))所示I)其核苷酸序列是序列表中序列5所示DNA分子；II)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交且编码所述轻链的DNA分子；III)与序列表中序列5自5'末端起第72bp_102bp位核苷酸具有70%以上的同 源性且编码所述轻链的DNA分子。扩增上述任一所述编码基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。所述引物对为如下引物对如下引物对是扩增所述轻链编码基因的。1) 一条引物序列如序列表中序列7所示，所述引物对中的另一条引物序列如序列 表中序列8所示；2) 一条引物序列如序列表中序列9所示，所述引物对中的另一条引物序列如序列 表中序列10所示。含有上述任一所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒也属于 本发明的保护范围。本发明的另一个目的是提供一种制备上述抗体的方法。本发明所提供的制备上述抗体的方法，是将上述任一所述编码基因导入宿主细胞 中，培养，得到所述抗体。所述方法中，可以是通过重组载体将上述任一所述编码基因导入宿主细胞中的； 所述重组载体中既含有上述任一所述重链可变区的编码基因又含有上述任一所述轻链的 编码基因，且所述重链可变区的编码基因和所述轻链的编码基因在所述重组载体中受同一 启动子的调控。本发明的另一个目的是提供一种抑制表皮生长因子受体信号转导途径的抑制剂、 一种抑制肿瘤细胞侵袭的抑制剂或一种预防和/或治疗肿瘤的药物。本发明所提供的药物或抑制剂的活性成分为上述抗体和/或任一所述编码基因。上述抗体和/或任一所述编码基因在制备抑制表皮生长因子受体信号转导途径 的抑制剂中的应用也属于本发明的保护范围。上述抗体和/或任一所述编码基因在制备抑制肿瘤细胞侵袭的抑制剂中的应用 也属于本发明的保护范围。所述肿瘤细胞具体可为SW480细胞。上述抗体和/或任一所述编码基因在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的应用也属 于本发明的保护范围。所述肿瘤具体可为结肠癌。本发明基于抗体抗原晶体结构的建立，通过计算机模拟，对西妥昔单抗抗体的鼠 源可变区FR表面基因进行突变，使之类似于人抗体FR的型式，从而获得亲和力较西妥昔单 抗显著提高的抗EGFR人源化抗体。实验结果证实，本发明抗体具有良好的结合活性(亲和 力为5. 09X10-10mol/L)和抑制肿瘤细胞生长迁移能力；而国外市场上常见抗EGFR人-鼠 嵌合抗体西妥昔单抗的亲和力1. 1X10_9M。本发明的人源化抗体能更好与EGFR结合，从而 保证了其抗肿瘤效应。本发明制备抗体的方法，能够同时表达轻链和重链，使轻链和重链的 表达比例更接近1 1，产生更高比率的相互匹配双链抗体。综上，所述本发明抗体及其制 备方法在预防和/或治疗肿瘤的领域将有广阔的应用前景。


图1轻链基因、重链可变区基因PCR扩增产物的琼脂糖电泳图。图2含有本发明抗体的表达载体的结构示意图。图3本发明抗体的还原型SDS-PAGE检测。图4本发明抗体的免疫印记分析。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、抗体的轻链和重链可变区编码基因的获得根据计算机模拟，以鼠_人嵌合抗体西妥昔单抗氨基酸序列为模板，对其鼠源FR 表面基因进行人源化改造而设计合成轻链氨基酸序列L3和重链可变区氨基酸序列HI ；轻链L1 氨基酸序列如序列表中序列1所示；编码基因序列如序列表中序列4所 示；轻链L3 氨基酸序列如序列表中序列2所示；编码基因序列如序列表中序列5所 示；重链可变区HI 氨基酸序列如序列表中序列3所示；编码基因序列如序列表中序 列6所示；本发明抗体由轻链L3和重链可变区HI组成，将本发明抗体记作C5。轻链L1的编码基因和重链可变区H2的编码基因由人工合成得到。轻链L3的编码基因以轻链L1的编码基因为模板，采用重叠PCR方法，由引物1、 2、5和6扩增，得到轻链L3的编码基因；引物1 :5，-gtggctagcgccgccaccatggacat-3‘ (Nhel)；(序列 7)2 5' -gaattcctaacactctcccctgttga-3' (EcoRI)；(序歹lj 8)5:5，-gctgctaatgccctgacttgcccggcaggcaatgttga-3，；(序列 9)6 5' -gcctgccgggcaagtcagggcattagcagcaacttacactggtatcagcagaaacca-3' ； (j^-^lj 10)将扩增得到的各基因进行凝胶电泳检测，结果与预期大小一致，L和H片段大小分 别约为735bp和770bp(图1)。M.相对分子质量标准；A 泳道1为轻链基因产物L1、泳道 3为轻链基因产物L3 ；B 泳道1为重链可变区基因产物HI。再将轻链L3的编码基因和重链可变区HI的编码基因分别克隆入PMD18-T载体 (分别记作重组载体pMD18-T/L3、pMD18-T/Hl)，转化大肠杆菌DH5a，挑克隆、提取质粒并测 序鉴定，结果表明得到的基因序列均正确。实施例2、抗体的制备一、重组表达载体的构建pIRES双表达载体购自Clontech公司，产品目录号为631605 ;pMD18_T表达载体 购自Tacara Bio Company，产品目录号为:D504CA. pIRES载体自身含有重链恒定区基因。
将重组载体pMD18-T/L3和pIRES双表达载体分别用相应的限制性内切酶(Nhel 和EcoRI)酶切，琼脂糖凝胶电泳后，回收纯化目的片段；将轻链基因片段L3与载体片段 混勻，在连接试剂的作用下，16°C反应12h。转化大肠杆菌DH5a，挑克隆、提取质粒并测序 鉴定，结果该重组表达载体中基因的插入方向正确及插入序列正确，记作重组表达载体 PIRES/L3。以pIRES/L3为模板，用Xbal和NotI酶切，回收质粒大片段，记作片段1 ；以克隆 有重链可变区基因的PMD18-T/H1为模板，用Zbal和BamHI酶切，回收重链可变区片段，记 作片段2 ；以克隆有重链恒定区基因的pIRES载体为模板，用BamHI和NottI酶切，回收重 链恒定区片段，记作片段3 ；将片段1、2和片段3连接，得到重组载体，转化大肠杆菌DH5a， 挑克隆、提取质粒并测序鉴定。结果表明，得到的重组表达载体的结构正确，插入的基因的 方向及顺序正确；抗体的轻重链基因共用同一个启动子，通过IRES序列连接，最终构建了 表达质粒。将重组表达载体记作PIRES/L3/H1 (图2)。二、细胞转化及蛋白表达293T细胞(293T人胚肾T细胞)购自购自美国菌种保藏中心(又称美国模式菌种 收集中心,ATCC)，产品目录号为CRL-11268 ；Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司，产 品目录号为12566014 ；HyQSFM4CH0培养基购自HyClone公司，产品目录号为SH30518. 02 ； rProtein A层析柱购自购自GE公司，产品目录号为17-5079-01。将293T细胞按IX 106/ml分别接种于直径为10cm的培养皿中、在含10%胎牛血清 的DMEM培养基中，37°C、5% C02孵箱，培养。取5 y g步骤一中得到的质粒pIRES/L3/Hl转 染293T细胞，具体操作参照Lipofectamine 2000的试剂说明。得到重组细胞293T_pIRES/ L3/H1。将重组细胞293T-pIRES/L3/Hl用无血清DMEM培养基培养，培养6 8h后吸出无 血清培养基，代之以HyQSFM4CH0培养基。相同条件下继续共培养84h，间隔12h收取一次 细胞上清，用ELISA法初步检测抗体的表达。扩大转染体系，收集细胞培养上清4. 5L，调pH 至6. 0 7. 0，用0. 45 ii m滤膜过滤，再用rProtein A层析柱纯化抗体，具体操作参见产品 说明书。ELISA 法1.包被用0. 05M PH9. 0碳酸盐包被缓冲液将抗体(一抗为山羊抗人IgG)稀释 至蛋白质含量为1 10y g/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0. lml，4°C过夜。次日， 弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。2.加样加一定稀释的待检样品0. lml于上述已包被之反应孔中，置37°C孵育1 小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。3.加酶标抗体(二抗为山羊抗人IgG-HRP (山羊抗人IgG_辣根过氧化物酶))于 各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0. lml。37°C孵育0. 5 1小 时，洗涤。4.加底物液显色于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0. lml，37°C 10 30分钟。5.终止反应于各反应孔中加入2M硫酸0. 05ml。6.结果判定可于白色背景上，直接用肉眼观察结果反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“ + ”、“-”号表示。也可测0D值 在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔0D 值，若大于规定的阴性对照0D值的2. 1倍，即为阳性。试剂(1)包被缓冲液(PH9. 60. 05M 碳酸盐缓冲液):Na2C03 1. 59 克，NaHC032. 93 克，加 蒸馏水至1000ml。(2)洗涤缓冲液(PH7. 4PBS) 0. 15M :KH2P04 0. 2 克，Na2HP04 12H202. 9 克，NaCl 8. 0 克，KC1 0. 2 克，Tween-20 0. 05% 0. 5ml，加蒸溜水至 1000ml。(3)稀释液牛血清白蛋白(BSA)O. 1克加洗涤缓冲液至100ml或以羊血清、兔血 清等血清与洗涤液配成5 10%使用。(4)终止液(2M H2S04)蒸馏水178. 3ml，逐滴加入浓硫酸(98% )21. 7ml。用rProtein A层析柱纯化抗体纯化介质Hi Trap rProtein A FF，5ml，购自GE 公司，目录号17-5079-01，详细使用说明书请参阅其公司提供的说明书。磷酸钠盐缓冲液(结合缓冲液)用作ProteinA纯化的结合缓冲液。配制方法为 取 lMNa2HP0457. 7ml 和 lMNaH2P04 42 . 3ml 混勻，即为 0. 1M pH7. 0 的磷酸钠盐缓冲液 100ml， 再用蒸馏水稀释至20Mm备用。柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(洗脱缓冲液)用作ProteinA纯化的洗脱缓冲液。配 制方法为取0. 1M柠檬酸186ml和0. 1M柠檬酸钠14ml混勻，即为0. 1M pH3. 0的柠檬酸盐 缓冲液200ml。操作1)清洗，用1M NaOH和ddH20先后清洗管道，将小滤器用0. 1M NaOH煮沸lOmin后 再用ddH20浸泡1 2min ；2)设定程序，连接rProtein A亲和层析柱；3)用20mM结合缓冲液(pH7. 0)平衡层析柱；4)将已制备好的细胞上清以1 2ml/min的流速上样；细胞上清制备以12000g 离心15分钟，取出上清，经过0. 22um硝酸纤维素滤膜过滤除菌。5)上样将要结束时用1M洗脱缓冲液(pH3. 0)洗脱目的蛋白；6)收集蛋白，用Trise碱(pH9. 0)将其pH调至7. 0，电泳检测；7)按步骤1)清洗管道和小滤器。三、蛋白检测山羊抗人IgG-HRP抗体购自Sigma公司，产品目录号为(046K4801)；山羊抗鼠 IgGl 购自 SBA(Southern Biotechnology Associates, Inc.)，产品目录号为(1010-05)；SDS-PAGE 取15 yl洗脱液(即抗体溶液)在12%凝胶上进行还原SDS-PAGE电 泳，用考马斯亮兰R-250染色。结果显示，纯化所得抗体的重链与轻链的相对分子质量分别为25X 103、 50X 103(图3、图4)，与预期结果一致。图3中，泳道4表示本发明抗体C5，泳道3表示对 照西妥昔单抗。免疫印迹分析另取洗脱液在12%凝胶上进行还原SDS-PAGE电泳后，转移至硝酸 纤维素膜上，取出膜用封闭液(含有5%脱脂奶粉的1XPBST)在室温封闭2h，用1 5000稀释的羊抗人IgG-HRP抗体与之孵育2h (室温)，再用1 XPBST洗膜3次。最后用ECL显 色，用X线片进行曝光。同时再做加入抗鼠IgGl的对照。图4中，泳道5表示本发明抗体 C5 ；泳道2表示鼠源单抗阴性对照；泳道4表示阳性对照西妥昔单抗。免疫印记(12% )分析表明，该抗体可与羊抗人IgG特异性结合。但是也出现了部 分与抗人IgG 二抗反应的一些非特异杂交带(包括商品化的西妥昔单抗)，这可能是纯化中 有部分非全长的重链片段混合所至。但是上述结果不影响抗体亲和力的评价。上述抗体均 不与抗鼠IgGl抗体反应。由于本抗体的轻链和重链在一个表达载体上，成比例表达，自动组成含两条轻链 和重链的完整抗体。实施例3、抗体的功能检测
EGFR 蛋白购自(Sigma)，产品目录号为(E2645-500UN)。一、Biacore检测抗体与抗原的结合能力用Biacore3000设备测定抗体C5与EGFR的亲和力。配制不同pH值(4. 0,4. 5， 5.0和5. 5)的IOmmol/L NaAc稀释EGFR蛋白，在CM5芯片上做预浓缩，选择最适pH值的 NaAc稀释蛋白。将纯化的抗体(即实施例2中步骤二得到的洗脱液)共价偶联于CM5传感 芯片上，流动相为HBS-EP (ρΗ7· 4)，流速20 μ 1/min,取五种浓度的抗体C5 (0，10. 55，21. 1、 42. 2和84. 4nmol/L)与EGFR蛋白结合亲和力的检测。亲和力用Biacore3000附带软件计 算。同时以西妥昔单抗为对照。实验设3次重复，结果取平均数。结果显示C5对抗原EGFR具有良好的结合活性(亲和力为5. 09 X 1 O^mol/L)。西 妥昔单抗的亲和力为1·1Χ10_9Μ。二、肿瘤细胞侵袭实验SW480细胞购自美国菌种保藏中心(又称美国模式菌种收集中心，ATCC)，产品目 录号为(ATCC Number :CCL-228 )；西妥昔单抗抗体购自德国默克里昂制药公司(原产地 英文商品名ERBITUX;原产地英文药品名=Cetuximab ；中文参考商品译名爱必妥；分子 结构名西妥昔单抗；产地国家德国；生产厂家德国默克里昂制药公司)。用RPMI1640培养基(购自Invitrogen公司，目录号为31800-022)培养SW480细 胞。用无血清RPMI1640培养基水化侵袭室(invasion chamber)，孵育2h (37°C，5% CO2)。 弃无血清 RPMI1640，在侵袭室(BD BioCoat Matrigel InvasionChamber 购自 BD 公司， 产品目录号为354480)的孔室加入750 μ 1 RPMI 1640 (含10%血清)；在插入(insert)室 中加入475μ 1 RPMI1640(含血清)，然后向其中加入25μ 1消化的SW480细胞(细胞 数> 105/500 μ 1)，最后分别向插入室中加入阴性对照PBS和本发明抗体，每个样品均有两 个复孔，抗体终浓度均为lOOng/ml。孵育24h后，将未能穿透侵袭盒基底膜的细胞用无菌棉 签擦去；穿透基底膜的细胞固定、染色、室温晾干后，光镜计数。在100倍显微镜下计算每个插入室中样品的相应细胞数。再用Durmett t3 (双 侧分析)检验将抗体组与PBS组比较，若结果为P < 0. 05，可认为两种处理效果差异有统计
学意义。运用SPSS12. 0统计软件对细胞侵袭实验数据进行单因素4水平方差分析，单因素 4水平方差分析结果显示FaM(W4) = 2. 82, P < 0. 05，故可认为细胞数不等或不完全相等。
Dunnett t3 (双侧分析，下文简称t)检验结果(表1)显示PBS组与C5组的t值 为1. 16，P值大于0. 05，表明抗EGFR抗体C5对SW480肿瘤细胞的侵袭有一定的抑制作用， 但与对照组相比，差异不显著。表1细胞侵袭实验的Durmett，s t3检测结果
0104]注与PBS组对比，***P =0. 928，***t ==1. 16。0105]序列表0106]<110>中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所0107]<120> 一种抗体及其制备方法与应用0108]<160>100109]<210>10110]<211>2140111]<212>PRT0112]<213>人工序列0113]<220>0114]<223>0115]<400>10116]Glu LeuValMetThrGinSerProSerSerLeuSerAla SerValGly0117]1510150118]Asp ArgValAsnlieAlaCysArgAlaSerGinSerlie GluThrAsn0119]2025300120]Leu HisTrpTyrGinGinLysProGlyLysAlaProArg LeuLeulie0121]3540450122]Lys TyrThrSerArgLeuHisSerGlyValProSerArg PheSerGly0123]5055600124]Ser GlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSer LeuGinPro0125]657075800126]Glu AspPheAlalieTyrTyrCysGinGinAsnAsnAsn TrpProThr0127]8590950128]Thr PheGlyGlyGlyThrLysValGlulieLysArgThr ValAlaAla0129]1001051100130]Pro SerValPheliePheProProSerAspGluGinLeu LysSerGly0131]1151201250132]ThrAlaSerValValCysLeuLeuAsnAsnPheTyrPro ArgGluAla0133]1301351400134]LysValGinTrpLys ValAspAsnAlaLeuGinSerGly AsnSerGin0135]1451501551600136]GluSerValThrGluGinAspSerLysAspSerThrTyr SerLeuSer0137]1651701750138]SerThrLeuThrLeuSerLysAla AspTyrGluLys His LysValTyr0139]1801851900140]AlaCysGluValThrHisGinGly LeuSerSerProVal ThrLysSer0141]1952002050142]PheAsn ArgGlyGluCys0143]2100144]<210>20145]<211>2140146]<212>PRT0147]<213>人工序列0148]<220>0149]<223>0150]<400>20151]GluLeuValMetThrGinSerProSerSerLeuSerAla SerValGly0152]1510150153]AspArgValAsnlieAla CysArgAlaSerGinGlylie SerSerAsn0154]2025300155]LeuHisTrpTyrGinGin LysProGlyLysAlaProArg LeuLeulie0156]3540450157]LysTyrThrSerArgLeuHisSerGlyValProSerArg PheSerGly0158]5055600159]SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSer LeuGinPro0160]657075800161]GluAspPheAlalieTyrTyrCysGinGinAsnAsnAsn TrpProThr0162]8590950163]ThrPheGlyGlyGlyThrLysValGlulieLysArgThr ValAlaAla0164]1001051100165]ProSerValPheliePheProProSerAspGluGinLeu LysSerGly0166]1151201250167]ThrAlaSerValValCysLeuLeuAsnAsnPheTyrPro ArgGluAla0168]1301351400169]Lys ValGinTrpLysValAspAsnAlaLeuGinSerGly AsnSerGin0170]145150155160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser165170175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr180185190Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser195200205Phe Asn Arg Gly Glu Cys210<210>3<211>223<212>PRT<213>人工序列<220><223><400>3Gln Val Lys Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly151015Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser lie Gly Asn202530Tyr Gly lie His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp354045Met Gly Gly lie Trp Ser Gly Gly Asn Ala Asp Tyr Ala Gln Lys Phe505560Gln Gly Arg Val Thr lie Thr Arg Asp Thr Ser Ala Thr Thr Ala Tyr65707580Met Gly Leu Ser Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys859095Ala Arg Val Gly Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Asp Val Trp Gly Gln100105110Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val115120125Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala130135140Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser145150155160Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val165170175Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro180185190
<213>人工序列<220〉<223><400>9gctgctaatg ccctgacttg cccggcaggc aatgttga38<210>10<211>57<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>10gcctgccggg caagtcaggg cattagcagc aacttacact ggtatcagca gaaacca5权利要求
一种抗体，其重链可变区的氨基酸序列如序列表中序列3所示，其轻链的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
2.权利要求1所述抗体的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述重链可变区的编码基因为如下 1)、2)或3)所示1)其核苷酸序列是序列表中序列6所示DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述重链可变区的DNA分子；3)与序列表中序列6自5'末端起第153bp-210bp位核苷酸具有70%以上的同源性且 编码所述重链可变区的DNA分子；所述轻链的编码基因为如下I)、II)或III)所示I)其核苷酸序列是序列表中序列5所示DNA分子；II)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交且编码所述轻链的DNA分子；III)与序列表中序列5自5'末端起第72bp-102bp位核苷酸具有70%以上的同源性 且编码所述轻链的DNA分子。
4.扩增权利要求2或3所述编码基因全长或其任意片段的引物对。
5.根据权利要求4所述的引物对，其特征在于所述引物对为如下引物对1)一条引物序列如序列表中序列7所示，所述引物对中的另一条引物序列如序列表中 序列8所示；2)一条引物序列如序列表中序列9所示，所述引物对中的另一条引物序列如序列表中 序列10所示。
6.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒。
7.一种制备权利要求1所述抗体的方法，是将权利要求2或3所述编码基因导入宿主 细胞中，培养，得到所述抗体。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述方法中，是通过重组载体将权利要求 2或3所述编码基因导入宿主细胞中的；所述重组载体中既含有权利要求2或3所述重链 可变区的编码基因又含有权利要求2或3所述轻链的编码基因，且所述重链可变区的编码 基因和所述轻链的编码基因在所述重组载体中受同一启动子的调控。
9.一种抑制表皮生长因子受体信号转导途径的抑制剂、一种抑制肿瘤细胞侵袭的抑制 剂或一种预防和/或治疗肿瘤的药物，其活性成分为权利要求1中所述抗体和/或权利要 求2或3所述编码基因。
10.权利要求1中所述抗体和/或权利要求2或3所述编码基因在制备抑制表皮生长 因子受体信号转导途径的抑制剂中的应用、权利要求1中所述抗体和/或权利要求2或3 所述编码基因在制备抑制肿瘤细胞侵袭的抑制剂中的应用或权利要求1中所述抗体和/或 权利要求2或3所述编码基因在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种抗体及其制备方法与应用。该抗体，其重链可变区的氨基酸序列如序列表中序列3所示，其轻链的氨基酸序列如序列表中序列2所示。实验结果证实，本发明抗体具有良好的结合活性(亲和力为5.09×10-10mol/L)和抑制肿瘤细胞生长迁移能力；而国外市场上常见抗EGFR人-鼠嵌合抗体西妥昔单抗的亲和力1.1×10-9M。本发明的人源化抗体能更好与EGFR结合，从而保证了其抗肿瘤效应。本发明制备抗体的方法，能够同时表达轻链和重链可变区。综上，所述本发明抗体及其制备方法在预防和/或治疗肿瘤的领域将有广阔的应用前景。
文档编号C12N1/15GK101875696SQ20091023780
公开日2010年11月3日 申请日期2009年11月11日 优先权日2009年11月11日
发明者戴维·威孚, 曹诚, 米歇尔·瑞奇韦兹, 靳彦文 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所