专利名称：一种诱导型启动子的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种诱导型启动子。
背景技术：
在基因表达调控的多级层次中，转录水平的调控对于植物体是非常经济有效的调 控方式，各种调控因子通过与启动子结合，开启或关闭基因的表达而达到调控的目的。启动 子是基因转录中最主要的一种调节方式，由于基因在不同层次上受不同的调节因子控制， 这种控制机制不仅决定基因表达的水平，也决定基因表达的时空顺序，因此，可以认为启动 子在某种程度上决定基因表达的时空特异性，在转录环节中占有十分重要的地位。启动子 是基因工程表达载体的重要元件，研究启动子对于基因表达调控机制，改善作物的生产性 状，如抗虫、抗病、抗逆等性状具有十分重要的意义。获得植物来源的新的启动子，特别是特 异性启动子，可以为研究植物基因的表达、调控和利用基因工程方法改良作物提供有用的 核心元件。植物基因的启动子按其基因的表达方式分为三种1、组成型启动子。特点是表达具有持续性，不受外界因素的诱导，且表达水平在 生物体各发育阶段和不同部位没有明显差异(李一琨，王金发.高等植物启动子研究进 展植物学通报.植物学报，1998，15(增刊)增刊1-6.)。例如双子叶植物中最常使用的 组成型启动子是花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S启动子(Odell J. T.，Nagy F.，Chua N. H. · Identification of DNA sequences required for activity of the cauliflower masaic virus 35S promoter. Nature, 1985, 313 (6005) :810-820.)、胭脂碱合酶基因(Nos) 和章鱼碱合酶基因(Ocs)启动子，以及近年来从单子叶植物中克隆出的水稻肌动蛋白基 因 Actl 启动子(Wang Y. , Zhang W. , Cao. J. , et al. . Characterization of cis-acting elements regulating transcription from the promoter of a constitutively active rice actin gene. Mol Cell Biol, 1992,12(8) :3399-3406.)、玉米泛素基因 Ubil 启动子 (Christensen Α. H. , Sharrock R. Α. . Maize polyubiquitin genes !structure, thermal perturbation of expression and transcript spl icing and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation. Plant Mol Biol,1992,18 675-681.)。2、诱导型启动子。即是在某些特定的物理或化学信号的刺激下可以大幅度地提 高基因的转录水平的启动子。诱导型启动子的活化受到物理或化学信号的诱导，启动子的 分子结构都具有增强子、沉默子或类似功能的序列结构，感受特异性诱导的序列都有明显 的专一性，例如拟南芥rd29A基因在干旱、高盐碱、低温和脱落酸条件下，转录因子DREB、 ABREB与启动子-174 -55区域包含干旱应答因子DRE和ABA应答因子(ABRE)结合， i秀帛 rd29A(Seki, Μ. ， Narusaka, Μ. ， Ishida, J. ， Nanjo, Τ. ， Fujita, Μ. ， Oono, Y. , Kamiya, A. , Nakajima, Μ. , Enju, Α. , Sakurai, Τ. , Satou, Μ. , Akiyama, K. , Taji, Τ., Yamaguchi-Shinozaki, K. , Carninci, P. , Kawai, J. , Hayashizaki, Y. , and Shinozaki,K.. Monitoring the expression profiles of 7000 Arabidopsis genes under drought, cold and high-salinity stresses using a full-length cDNA microarray. Plant J, 2002,31 :279-292.)。部分诱导特异型启动子同时具有组织特异性表达的特点(王关林，方 宏筠.植物基因工程(第二版).北京科学出版社，2002.)。拟南芥DREBlA和DREB2A转 录因子分别调控与低温和干旱高盐胁迫有关的多种基因的表达，同时，DREBlA和DREB2A的 表达也受低温和干旱高盐的诱导(Liu J.，Zhu J. K. . A calcium sensor homo log required for plant salt tolerance. Science,1998, 280 :1943-1945.)。3、组织特异性启动子。也称为细胞或器官特异性启动子，在这些启动子调控下， 基因的表达往往只发生在某些特定的器官或组织部位，并表现出发育调节的特性。组织 特异性启动子除具备一般启动子的结构特点外，还具有一些控制组织特异性表达的元件， 这些元件一般位于TATA-box的上游，序列通常不超过30bp，基因的表达由这些元件的种 类、数目及相对位置等共同决定，而且这些元件也正是基因特异性表达所必须的(Keller B. , Lamb C.J. . Specific location of a plant cell wall glycine—rich protein in protoxylem cells of the vascular system. Proc Natl Acad Sci USA,1989,86: 1529-1533.)。低温、干旱和盐是植物面临的几种最严重的逆境，给农业生产造成巨大损失，利用 生物工程转基因技术提高作物的抗逆性以改良和利用盐渍化土壤是一条经济有效的途径。 近年转基因植物产业化步伐不断加快。根据农业生物技术应用国际服务组织(ISAAA)发布 的数据，2008年全世界种植转基因作物的国家达到25个，转基因作物种植面积比2007年增 长9. 4%，达到1. 25亿公顷(http://www. isaaa. org)。2007年中国种植转基因抗虫棉面积 达到380万公顷，占我国棉花总面积的66%。目前，大量优良新基因被分离克隆，但植物基 因工程中较为广泛使用的启动子有来自花椰菜花叶病毒的CaMV35S启动子、来自植物本身 的 ActKUbil 等启动子(Sanders，P. R.，Winter, J. Α.，Barnason, A. R.，Rogers，S. G.，and Fraley, R. Τ.. Comparison of cauliflower mosaic virus 35S and nopaline synthase promoters in transgenic plants. Nucleic Acids Res，1987，15 :1543—1558. ；McElroy, D.，Zhang，W.，Cao, J.，and Wu, R. Isolation of an efficient actin promoter for use in rice transformation. Plant Cell，1990，2 :163-171.)，这些均是组成型启动子。由于 组成型启动子驱动的基因在植物不同组织器官中均有不同程度的表达，应用中逐渐暴露出 一些问题。在多数情况下，人们并不希望外源基因在转基因植物整个植株、整个生育期中 广泛表达，因为一方面会增加植株的代谢负担，另一方面，有些外源蛋白对植物并非必须甚 至有毒，不利于植物正常生长(Kasuga，Μ.，Liu, Q.，Miura，S.，Yamaguchi-Shinozaki, K.， and Shinozaki, K. . Improving plant drought，salt，and freezing tolerance by gene transfer of a single stress-inducible transcription factor. Nat Biotechnol, 1999,17 :287-291.)。因此，研究和利用组织器官特异型启动子和诱导型启动子显得尤为 重要，不仅可以实现对外源基因表达施行时、空、量的三维调控，同时具有经济、环保及生物 安全等多方面的潜在价值(Venter, Μ. . Synthetic promoters :genetic control through cis engineering. Trends Plant Sci，2007，12 :118-124.)。
发明内容
本发明的目的是提供一种诱导型启动子。本发明提供的DNA片段(启动子)，为如下1)或2)或3)的DNA分子1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；3)与1)或幻限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。含有所述DNA片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的 保护范围。所述重组载体具体可为在pCAMBIA-1391Z的多克隆位点插入所述DNA片段得到 重组质粒。所述重组载体具体可为将序列1所示DNA片段插入pCAMBIA-1391Z的Mil和 EcoRI酶切识别位点间得到的重组质粒。扩增所述DNA片段的全长及其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。所述DNA片段可应用于促进逆境胁迫条件下目的基因表达。所述逆境胁迫具体可为为干旱胁迫和/或盐胁迫。所述目的基因具体可为⑶S基因。所述DNA片段可应用于促进目的基因在植物种子中特异性表达。所述目的基因具体可为⑶S基因。本发明公开的小麦耐盐相关基因TaFbox2的启动子PR0_TaFbOX2序列，该启动子 核苷酸序列全长为3076bp，靠近基因编码区的位置保守性高，差异主要集中在-500bp以外 的区域。对启动子21Λ区域进行分析，含有多个与生物胁迫和非生物胁迫诱导相关的转录 元件结合位点，表明其所控制的下游基因应该受胁迫诱导的表达。本发明的启动子具有组 织特异性，且可受逆境胁迫诱导表达，能作为植物源的诱导型表达载体，在生物工程中具有 很好的应用前景。
图1为MITE转录元件分析。图2为转基因植株PCR检测(箭头所指位置为目的片段)；P 阳性对照；N:非转基 因植株；H =H2O ；M :marker。图3为转基因植株southern杂交检测；A =HindIII酶切结果；B 杂交结果。图4为转基因植株Gus染色；A 苗期叶片；B 发芽期幼苗；C 成熟期种子。图5为转空载体植株Gus染色；A 苗期叶片；B 发芽期幼苗；C 成熟期种子。图6苗期胁迫诱导后Gus染色；A 转空载体植株；B 转基因植株；C12 冷处理 12H ；C2 冷处理 2H ；P12 =PEG 处理 12H ；P2 =PEG 处理 2H ；S12 盐处理 12H ；S2 盐处理 2H ；N 未处理。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。
培养基和溶液的配制NB 基本培养基(IL)的配制方法如下KN0328 30mg，(NH4) 2S0446 3mg, KH2P04400mg, MgSO4 · 7H20 185mg, CaCl2 · 2H20 166mg, FeSO4 · 7H20 27. 85mg, Na2-EDTA 37. 25mg, MnSO4 · 4H20 IOmg, H3B043mg, ZnSO4 · 7H20 2mg, Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg, CuSO4 · 5H20 0. 025mg, CoCl2 · 6H20 0. 025mg, KIO. 75mg，盐酸硫胺素(VBl) IOmg,盐酸吡哆醇(VB6) Img,烟酸 (VB5) Img,肌醇lOOmg，水解酪蛋白300mg，谷氨酰胺500mg，脯氨酸500mg，蔗糖30g，CEH (水 解络蛋白)300mg，植物胶2. 6g，定容到IL ；pH调整为5. 8，121 °C灭菌20min。NBco共培养基NB基本培养基添加2，4_D 2mg/L和100 μ M的乙酰丁香酮(AS)， 调整PH 5. 5。预筛选培养基NBps =NB基本培养基添加2，4_D 2mg/L和头孢霉素(cef) 500mg/L, 调整PH为5.8。筛选培养基NBs =NB基本培养基添加2，4_D 2mg/L,头孢霉素(cef) 500mg/L, Hyg 30mg/L，调整 pH 为 5. 8。MS基本培养基取50mL MS大量元素QOX)、5mL MS微量元素QOOX)、5mL铁盐 (200X)、5mL MS有机成分(200X)，混勻，加蔗糖30g，用lmol/L的NaOH调pH值到5. 8，固 体MS再加7g琼脂粉，定容至IOOOmL, 121°C灭菌20min ；MS 大量元素(20 X) (IOOOmL) :NH4N033 3 0 00mg，KN0s38000mg, CaCl2 · 2H20 8800mg, MgSO4 · 7H20 7400mg, KH2P0434 00mg ；MS 微量元素(200 X) (IOOOmL) :KI 166mg, H3BO31240mg, MnSO4 · 7H20 4460mg, ZnSO4 · 7H20 1720mg, Na2MoO4 · 2H20 50mg, CuSO4 · 2H20 5mg, CoCl 2 · 2H20 5mg ；铁盐(200X) (IOOOmL) :FeS04 · 7H20 5560mg, Na2 · EDTA · 2H20 7460mg ；MS 有机成分 QOO X) (IOOOmL):肌醇 Qnositol) 20000mg，甘氨酸 (Glycine) 400mg，烟酸(Nicotinic acid) lOOmg，盐酸硫胺素(Vitamin B1) lOOmg，盐酸吡哆 醇(Vitamin B6) IOOmg0预再生培养基MSpr :MS基本培养基添加NAA lmg/L, BAP 2mg/L,头孢霉素 (cef) 500mg/L, Hyg 30mg/L，调整 pH 5.8。再生培养基MSr :MS基本培养基添加NAA 0. 5mg/L, BAP 3mg/L,头孢霉素 (cef) 500mg/L, Hyg 30mg/L，调整 pH 5.8。lmol/L 磷酸盐缓冲液(pH7. 2) (IOOOmL) :NaH2P0438 . 9g、Na2HP042 58. 12g ；调 pH 值 到 7. 2，ddH20 定容至 IOOOmL, 121°C灭菌 20min。0. 2mol/L NaH2PO4 (ρΗ7· 0) (IOOmL) :3. 12g NaH2PO4 · 2H20 溶于灭菌 ddH20 中，定容 至 IOOmL00. 2mol/L Na2HPO4 (ρΗ7· 0) (IOOmL) :7. 17g Na2HPO4 · 12H20 溶于灭菌 ddH20 中，定容 至 IOOmL0GUS 组织化学染色反应液 QOmL) 0. 2mol/L Na2HPO4(pH7. 0)5mL, EDTA(0. 5mol/ L, pH8. 0)5mL、Tween-2080 μ L、K3 [Fe (CN)6] (170mmol/L) 118 μ L、K4 [Fe (CN) 6] (170mmol/ L) 118 μ L、X-Gluc (20mg/mL) ImL ；加 ddH20 定容至 20mL，分装后 _20°C贮存。生物材料农杆菌GV3101 刘福秀，赵芹，阮小蕾，何云蔚，李华平.水稻瘤矮病毒基因组第11片段编码一个RNA沉默抑制子.科学通报，2008，53(1) :96-103 ；中国农业科学院作物科学 研究所。水稻种子(Kitaake，日本北海道早熟粳稻品种)袁莉民，仇明，王朋，王志琴，杨 建昌.C4转基因水稻秧苗叶片气孔和叶鞘维管束结构特征.中国农业科学，2006，39 (5) 902-909 ；中国农业科学院作物科学研究所。pCAMBIA-1391Z Enrico Scarpella, Erik J. Simons and Annemarie H. Meijer. Multiple Regulatory Elements Contribute to the Vascular-specific Expression of the Rice HD-Zip Gene Oshoxl in Arabidopsis. Plant and Cell Physiology 200546(8) 1400-1410 ；中国农业科学院作物科学研究所。中国春小麦陈锋，何中虎，陈东升，张春利，夏先春.中国春小麦籽粒硬度 puroindoline基因等位变异检测.中国农业科学，2007，40 ) :217-224 ；中国农业科学院 作物科学研究所；原始来源不清。实施例1、PR0_TaFbox2 (TaFbox2的启动子)序列的发现一、ra0_Mx)x2 序列的发现1、BAC混合池的筛选(I)BAC混合池保存的菌种混勻后取5ul接种到LB培养基中，摇床转速220rpm、 37°C培养过夜，碱裂解法提取质粒DNA，根据TaFbox基因开放阅读框设计引物进行扩增，对 阳性混合池进行下一步的筛选。( 将阳性BAC混合池的保存菌液稀释之后，涂布在LB固体培养基表面，37 °C过夜 培养，然后挑取5倍于混合池中克隆数的单克隆接种于384孔板中，37°C培养过夜，培养基 冷冻保存。(3)用每块384孔板中的所有单克隆制备成混合池，接种于LB培养基中培养过夜， 碱裂解法提取质粒DNA，PCR检测。(4)对上步中呈阳性克隆的混合池进行阳性单克隆筛选。将384孔板中16个横行 (A-P)和对个纵列(1-24)中的克隆分别混合，共得到40个更小的克隆混合池。分别以其 菌液为模板，用等位特异性PCR引物扩增，检测是否含有阳性克隆。含有阳性克隆的横行和 纵列的交叉点就是可能的阳性单克隆；对384孔板中相应位置的单克隆用PCR引物加以验 证。2、BAC DNA 的提取Qi agen Large-Construct Kit 提取 BAC DNA03、测序M BigDyeR Terminator v3. 1 Cycle Sequencing Kit(ABI) ^fIlJPCR SiS, 测序使用 ABI3730 XL DNA Analyzer。 利用中国春BAC克隆测序，获得了小麦TaFbox2基因的启动子PR0-TaFboX2，全长 3076bp (见序列表的序列1)。二、PR0_TaFbox2 序列分析1、转录元件结合位点对启动子3KB区域进行分析，在翻译起始密码子上游除了核心元件外，含有多个 与生物胁迫和非生物胁迫诱导相关的转录元件结合位点(见表1)，表明其所控制的下游基
权利要求
1.一种DNA片段，为如下1)或2)或3)的DNA分子1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。
2.含有权利要求1所述DNA片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
3.如权利要求2所述的重组载体，其特征在于所述重组载体为在pCAMBIA-1391Z的 多克隆位点插入权利要求1所述DNA片段得到重组质粒。
4.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于所述重组载体为将序列1所示DNA片 段插入pCAMBIA-1391Z的Mil和EcoRI酶切识别位点间得到的重组质粒。
5.扩增权利要求1所述DNA片段的全长及其任意片段的引物对。
6.权利要求1所述DNA片段在促进逆境胁迫条件下目的基因表达中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述逆境胁迫为干旱胁迫和/或盐胁迫。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述目的基因为GUS基因。
9.权利要求1所述DNA片段在促进目的基因在植物种子中特异性表达中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述目的基因为GUS基因。
全文摘要
本发明公开了一种诱导型启动子。本发明提供的启动子，为如下1)或2)或3)的DNA分子1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。本发明公开的小麦耐盐相关基因TaFbox2的启动子PRO-TaFbox2序列，该启动子核苷酸序列全长为3076bp。对启动子2kb区域进行分析，含有多个与生物胁迫和非生物胁迫诱导相关的转录元件结合位点，表明其所控制的下游基因应该受胁迫诱导的表达。该发明能作为植物源的诱导型表达载体在生物工程中具有很好的应用前景。
文档编号C12N15/11GK102071203SQ200910237908
公开日2011年5月25日 申请日期2009年11月25日 优先权日2009年11月25日
发明者刘旭, 张学勇, 温小杰, 王兰芬, 蒲文, 郝晨阳 申请人:中国农业科学院作物科学研究所