专利名称：大豆GmFTL1蛋白和GmFTL2蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，特别是涉及两个大豆开花基因及其在植物光周期和开 花时间调节中的应用。
背景技术：
大豆是重要的农作物之一，是植物蛋白质、食用油、生物柴油以及异黄酮和卵磷脂 等次生代谢产物的重要来源。因为大豆是短日植物，开花受光周期的严格控制，因而不同区 域间的优异品种不能相互引种、生育期也受环境光周期的制约ahang et al.，2008)。如果 能降低大豆对光周期的敏感性，突破大豆开花对光周期的限制，就能解决大豆的引种问题， 从而实现各区域间优质品种的相互交换，丰富各地优异种质资源，调节大豆生育期，提高大 豆产量和品质。以往解决大豆光周期敏感性主要是通过杂交的方法获得新品种，但是，这种 育种方法具有对亲本的依赖性强和周期长等缺点，到目前为止尚未获得大豆光周期广适应 性品种。对拟南芥等植物的研究表明，植物的光周期是受极其复杂的调节网络控制的 (Mouradov et al. ,2002 ；Turck et al. ,2008) 但是，其中一个关键基因对开花时间的调 节起着至关重要的作用，它就是Flowering Locus T (简称FT)，它在叶片中产生，通过维管 组织系统运输到生长点并诱导生长点形成花(Blazquez and ffeigel,2000 ；Lee et al.， 2000 ；Samach et al.，2000 ；Turck et al. ,2008) 因而,FT 蛋白被称为成花素(Corbesier et al.，2007 Jaeger and ffigge,2007 ；Mathieu et al. , 2007)。该成花素的表达可以降低 植物对光周期的敏感性，促进植物开花。FT基因的功能在不同的植物中有报道(Bohlenius et al. , 2006 ；Hsu et al. , 2006 ；Yan et al. ,2006 ；Corbesier et al. , 2007 ； Jaeger and ffigge,2007 ；Lin et al. ,2007 ；Mathieu et al. ,2007 ；Tamaki et al. ,2007 ；Liand Dubcovsky, 2008)，但在大豆FT基因的功能及其应用未见报道。通过调节大豆开花基因表 达来改变植物对光周期的敏感性和开花时间也没有报道。
发明内容
本发明的目的是提供两个大豆开花基因及其在植物光周期和开花时间调节中的 应用。包括(1)克隆两个大豆开花基因GmFTLl和GmFTL2 ;(2)提供基因及其编码蛋白的序 列；C3)提供这两个基因在育种中的应用，尤其是在调节植物光周期以及开花时间中的应用。为达到上述目的，本发明的技术方案提供一种大豆GmFTLl蛋白，其具有如SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功 能的氨基酸序列，以及大豆GmFTL2蛋白，其具有如SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列或该序 列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。本发明还提供编码上述的大豆GmFTLl蛋白和大豆GmFTL2蛋白的基因。大豆 GmFTLl蛋白的基因具有如SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个核苷酸形成的具有同等功能的核苷酸序列。大豆GmFTL2蛋白的基因具有如SEQ IDNo. 4所示的核苷酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个核苷酸形成的具有同等 功能的核苷酸序列。本发明GmFTLl和GmFTL2(全称为Glycine max Flowering Locus T Like丄和幻是从大豆垦农18 (Glycine max L. Kennong 18)中克隆到的两个基因，该基 因编码蛋白的氨基酸序列相互间的同源性为94.3%，与拟南芥FT蛋白质的同源性分别为 67%和73%。并且GmFTLl和GmFTL2蛋白与拟南芥FT具有相同的保守域。因此，GmFTLl 和GmFTL2与拟南芥FT基因具有类似促进开花的功能。但是，GmFTL 1和GmFTL2的蛋白质序 列与拟南芥FT蛋白有重要不同。在重要功能域中，大豆GmFTLl和GmFTL2的蛋白质第1 位氨基酸残基为谷氨酰胺⑴)，第1 位是苯丙氨酸(F)，第132位是精氨酸(R)，第150位 氨基酸残基是亮氨酸(L)，而拟南芥相应部位是亮氨酸(L)、甘氨酸(G)、苏氨酸(T)和异亮 氨酸(I)。这些差异导致GmFTLl和GmFTL2的活性比拟南芥FT高。大豆GmFTLl和GmFTL2 基因主要在开花前期和开花期的叶中表达。本发明包括通过各种方法获得的、如SEQ ID No. 1-2所示氨基酸序列或该序列经 替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的衍生蛋白质以及编码这些衍生 蛋白质的基因。本发明将GmFTLl和GmFTL2基因构建到表达载体p35S-GW，并在大肠杆菌DH5a中 扩繁。通过农杆菌介导转化方法，将P35S-GW携带的GmFTLl和GmFTL2基因转入拟南芥，获 得拟南芥转化植株。实验结果表明，GmFTLl和GmFTL2具有降低植物对光周期的敏感性并 促进拟南芥开花的作用。本发明还包括含有GmFTLl和GmFTL2核苷酸序列或其片段的克隆载体或各类表达 载体、含有所述载体的宿主细胞、含有所述核苷酸序列或其片段的转化植物细胞和转基因 植物。上述技术方案具有如下优点1、提供了大豆GmFTLl和GmFTL2基因及其编码的蛋白本身；2、过表达GmFTLl和GmFTL2基因改变植物生育期、促进植物开花。过表达大豆开 花基因GmFTLl和GmFTL2明显促进植物(拟南芥)开花，使开花时间缩短，生育期缩短。因 而，GmFTLl和GmFTL2具有调节花期，可用于解决杂交育种中的花期不遇问题、各种作物、 蔬菜、水果、花卉的生育期控制问题、光周期敏感性问题和引种问题。而且，大豆GmFTLl和 GmFTL2的效应明显比拟南芥FT基因的效应强。
图1是本发明大豆开花基因GmFTLl和GmFTL2编码蛋白的结构分析；图2为本发明实施例3的植物表达载体p35S-GW ；图3为本发明实施例4的克隆中间载体pGWGC ；图4为本发明实施例5的大豆开花基因GmFTLl促进拟南芥开花图；图5为本发明实施例6的大豆开花基因GmFTLl促进拟南芥开花图；图6为本发明实施例7的大豆开花基因GmFTLl促进拟南芥开花图；图7为本发明实施例8的大豆开花基因GmFTLl促进拟南芥开花图；图8为本发明实施例9的大豆开花基因GmFTL2促进拟南芥开花4
图9为本发明实施例10的大豆开花基因GmFTL2促进拟南芥开花图；图10为本发明实施例11的大豆开花基因GmFTL2促进拟南芥开花图；图11为本发明实施例12的大豆开花基因GmFTLl和GmFTL2的表达水平；图12为本发明实施例13的大豆开花基因GmFTLl和GmFTL2在细胞核中的定位。
具体实施例方式下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式
作进一步详细描述。以下实施 例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1 大豆开花基因GmFTLl和GmFTL2的克隆利用正向引物ATGCCTAGTGGTAGTAGGAAC (如SEQ ID No. 5所示)和反向引物 TCAAAATGTTCTACCACCAGA (如 SEQ ID No. 6 所示)从大豆垦农 18 (Glycine max L. Kennong 18)中克隆并测序获得GmFTLl和GmFTL2，其基因序列如SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示; 由其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1和SEQ IDN0. 2所示。实施例2 大豆开花基因GmFTLl和GmFTL2编码蛋白的结构分析(见图1)大豆开花基因的GmFTLl和GmFTL2蛋白序列之间的同源性大于94. 3%，C端的功 能域与拟南芥高度同源，但存在重要区别。如大豆GmFTLl和GmFTL2的蛋白质第1 位氨 基酸残基为谷氨酰胺⑴)，第1 位是苯丙氨酸(F)，第132位是精氨酸(R)，第150位氨基 酸残基是亮氨酸(L)，而拟南芥相应部位是亮氨酸(L)、甘氨酸(G)、苏氨酸(T)和异亮氨酸 (I)。这些差异导致GmFTLl和GmFTL2的活性比拟南芥FT高。实施例3 大豆开花基因GmFTLl和GmFTL2植物表达载体大豆开花基因GmFTLl和GmFTL2构建在图2所示的植物表达载体p35S_GW中，用 于在植物中过表达大豆开花基因GmFTLl和GmFTL2，研究其功能。植物的转化方法采用农杆 菌介导法进行。植物中的筛选标记为Bar。实施例4 大豆开花基因GmFTLl和GmFTL2所用克隆的中间载体为pGWGC (见图3)。从实施例1中扩增获得的PCR产物直接按照TA克隆方法克隆到pGWGC上。克隆 前，pGWGC事先用Ahd I内切酶水解已获得T载体。连接产物转化大肠杆菌DH5 α，并在其 中扩繁，阳性克隆经过测序筛选获得实施例1所示的序列。应用实施例实施例5 大豆开花基因GmFTLl促进拟南芥开花一转化系I从实施例3获得的拟南芥转化植株与其亲本(野生型C0L)在长日植株生长室中 的条件(16小时光照/8小时黑暗的光周期，光强80 μ m0l*m_2· s—1)下同时一起培育，直至 转化植株开花(约20天)。图4显示大豆开花基因GmFTLl转化拟南芥，导致拟南芥早开 花，对光周期不敏感。如图4所示，其中右图为转基因植株，左图为对照。说明大豆GmFTLl 具有开花活性，可以促进植物开花。实施例6 大豆开花基因GmFTLl促进拟南芥开花一转化系II从实施例3获得的拟南芥转化植株与其亲本(野生型C0L)在长日植株生长室中 的条件(16小时光照/8小时黑暗的光周期，光强80 μ m0l*m_2· s—1)下同时一起培育，直至 转化植株开花(约20天)。图5显示大豆开花基因GmFTLl转化拟南芥，导致拟南芥极早开 花，对光周期不敏感。如图5所示，其中右图为转基因植株，左图为对照。说明大GmFTLl具有开花活性，可以促进植物开花。实施例7 大豆开花基因GmFTLl促进拟南芥开花一转化系III从实施例3获得的拟南芥转化植株与其亲本(野生型C-0L)在长日植株生长室中 的条件(16小时光照/8小时黑暗的光周期，光强80 μ m0l*m_2· s—1)下同时一起培育，直至 转化植株开花(约20天)。图6显示大豆开花基因GmFTLl转化拟南芥，导致拟南芥极早开 花，对光周期不敏感。如图6所示，其中右图为转基因植株，左图为对照。说明大豆GmFTLl 具有开花活性，可以促进植物开花。实施例8 大豆开花基因GmFTLl促进拟南芥开花一转化系IV从实施例3获得的拟南芥转化植株与其亲本(野生型C0L)在长日植株生长室中 的条件(16小时光照/8小时黑暗的光周期，光强80 μ m0l*m_2· s—1)下同时一起培育，直至 转化植株开花(约20天)。图7显示大豆开花基因GmFTLl转化拟南芥，导致拟南芥早开 花，对光周期不敏感。如图7所示，其中右图为转基因植株，左图为对照。说明大豆GmFTLl 具有开花活性，可以促进植物开花。实施例9 大豆开花基因GmFTL2促进拟南芥开花一转化系I从实施例3获得的拟南芥转化植株与其亲本(野生型C0L)在长日植株生长室中 的条件(16小时光照/8小时黑暗的光周期，光强80 μ m0l*m_2· s—1)下同时一起培育，直至 转化植株开花(约20天)。图8显示大豆开花基因GmFTL2转化拟南芥，导致拟南芥极早开 花，对光周期不敏感。如图8所示，其中右图为转基因植株，左图为对照。说明大豆GmFTL2 具有开花活性，可以促进植物开花。实施例10 大豆开花基因GmFTL2促进拟南芥开花一转化系II从实施例3获得的拟南芥转化植株与其亲本(野生型C0L)在长日植株生长室中 的条件(16小时光照/8小时黑暗的光周期，光强80 μ m0l*m_2· s—1)下同时一起培育，直至 转化植株开花(约20天)。图9显示大豆开花基因GmFTL2转化拟南芥，导致拟南芥极早开 花，对光周期不敏感。如图9所示，其中左图为转基因植株，右图为对照。说明大豆GmFTL2 具有开花活性，可以促进植物开花。实施例11 大豆开花基因GmFTL2促进拟南芥开花一转化系III从实施例3获得的拟南芥转化植株与其亲本(野生型C0L)在长日植株生长室中 的条件(16小时光照/8小时黑暗的光周期，光强80 μ m0l*m_2· s—1)下同时一起培育，直至 转化植株开花(约20天)。图10显示大豆开花基因GmFTL2转化拟南芥，导致拟南芥早开 花，对光周期不敏感。如图10所示，其中右图为转基因植株，左图为对照。说明大豆GmFTL2 具有开花活性，可以促进植物开花。实施例12 大豆开花基因GmFTLl和GmFTL2主要在开花前期和开花期的叶片中表 达，在叶柄和茎中高水平表达。如图11所示。通过利用实时定量荧光PCR(quantitative real time RT-PCR)测定大豆开花基 因GmFTLl和GmFTL2表达。图中，短线前面字母表示植株的发育时期，后面字母表示器官。 U，单叶；T为复叶(T后面的数字为复叶的顺序)；F，花；Pd，荚；Pt，叶柄(其后数字表示不 同时期的荚)；R，根；HH，上胚轴；EH，下胚轴；SAM，生长点；St，茎；L，侧生叶；C，子叶实施例13 大豆开花基因GmFTLl和GmFTL2编码蛋白定位于细胞核中大豆开花基因GmFTLl和GmFTL2与GFP的融合基因，通过基因枪法转化拟南芥原生质体和大豆叶片。转化细胞中GFP荧光信号表示大豆开花基因GmFTLl和GmFTL2编码蛋 白的定位。图12显示大豆开花基因GmFTLl(A和C)和GmFTL2 (B和D)编码蛋白在拟南芥 原生质体(A和B)和大豆叶片(C和D)中定位于核。 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰 也应视为本发明的保护范围。序列表
<110>中国农业科学院作物科学研究所
<120>大豆GmFTLl蛋白和GmFTL2蛋白及其应用
<130>KHP09113517. 7
<160>6
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>175
<212>PRT
<213>GmFTLl
<400>1
Met Pro SerGlySerArgAsnProLeuValValGlyArgVallieGly
151015
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202530
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354045
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505560
Tyr Thr MetValMetValAspProAspAlaProSerProSerAsnPro
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859095
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<210>2
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<213>GmFTL2
<400>2
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1
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Gly
Ala
Tyr
65
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Val lie
Asn Arg
35 Asn Gln 50
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Phe Thr Gly Pro Pro Thr
Phe
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Arg 130 Glu
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Pro
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Val Leu Arg Glu
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Asn 100 Gly
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Arg
Phe
Gly
Val
Val
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Ser
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Val Gly Pro Phe Leu Lys
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lie Val Tyr Glu
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His Trp Leu Glu
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Val
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Val
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Asp Ser Tyr
lie Pro Glu
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Gly Trp Gly
Phe Val Leu Arg
Ser 170
Leu 155 Gly
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Val Gly Arg
Ser 110 Arg
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Ala
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Glu
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Ala
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1.大豆GmFTLl蛋白，其特征在于，其具有如SEQID No. 1所示的氨基酸序列或该序列 经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.大豆GmFTL2蛋白，其特征在于，其具有如SEQID No. 2所示的氨基酸序列或该序列 经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
3.编码权利要求1所述的大豆GmFTLl蛋白的基因。
4.编码权利要求2所述的大豆GmFTL2蛋白的基因。
5.如权利要求3所述的基因，其特征在于，其具有如SEQID No. 3所示的核苷酸序列或 该序列经替换、缺失或添加一个或几个核苷酸形成的具有同等功能的核苷酸序列。
6.如权利要求4所述的基因，其特征在于，其具有如SEQID No. 4所示的核苷酸序列或 该序列经替换、缺失或添加一个或几个核苷酸形成的具有同等功能的核苷酸序列。
7.含有权利要求3-6任一项所述基因或其片段的载体。
8.含有权利要求7所述载体的宿主。
9.含有权利要求3-6任一项所述基因或其片段的转化植物细胞。
10.权利要求3-6任一项所述的基因或其片段在调节植物光周期和开花时间中的应
全文摘要
本发明公开了一种大豆GmFTL1蛋白和GmFTL2蛋白，其具有如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。过表达大豆开花基因GmFTL1和GmFTL2可明显促进植物(拟南芥)开花，使开花时间缩短，生育期缩短。可用于解决杂交育种中的花期不遇问题、各种作物、蔬菜、水果、花卉的生育期控制问题、光周期敏感性问题和引种问题。
文档编号C12N15/63GK102079779SQ200910237919
公开日2011年6月1日 申请日期2009年11月26日 优先权日2009年11月26日
发明者傅永福, 张晓玫 申请人:中国农业科学院作物科学研究所