果进行序列比对，得到每个克隆中待检测4个CpG位点的甲 基化状态。分析结果表明亚硫酸盐转化效率均达到98%或以上，符合亚硫酸盐转化实验要 求，表明BSP分析结果可靠。结果显示在第3个CpG的位点（112bp)发生了甲基化，对照组 未甲基化，说明该位点的甲基化可能是CLSTN2基因低表达及骨性关节炎致病相关的原因 之一。此外，在第2个CpG的位点（79bp)发生了部分甲基化。
[0102] 实施例5甲基化特异性PCR(MSP)
[0103] I. CLSTN2基因甲基化及非甲基化引物设计与合成
[0104] 引物设计后送公司合成。
[0105]表 4MSP引物
[0106]
[0107] 2.MSP反应体系
[0108] 表5MSP反应体系
[0109]
[0110] 反应条件：预反应：94°C5min;反应35个循环（94°C30秒，60°C30秒，72°C30 秒）；延伸72°C5min，反应结束后取出进行琼脂糖凝胶电泳分析。
[0111] 3.实验结果
[0112] 非甲基化特异性引物的扩增产物存在，甲基化特异性引物的扩增产物不存在即为 非甲基化；非甲基化特异性引物的扩增产物不存在，甲基化特异性引物的扩增产物存在即 为甲基化。电泳结果显示：37例骨性关节炎患者滑膜组织中，甲基化阳性的有26例，基因 甲基化率为70. 27%，9例对照滑膜组织中甲基化阳性的仅有2例，基因甲基化率为22. 22% (见表6,图1)。
[0113] 表6骨性关节炎组和对照组CLSTN2基因甲基化情况
[0114]
[0116] 实施例6WB方法检测骨性关节炎滑膜中CLSTN2的表达
[0117] -、蛋白质样品制备及定量
[0118] I.RIPA裂解液（Beyotime)进行蛋白质样品制备，操作步骤如下：
[0119] 将滑膜组织自冰箱取出，用滤纸擦拭组织上的PBS溶液，称取重量，并将滑膜组织 置于机械组织匀浆器中，1:10组织比裂解液的重量体积比例加入相应体积的裂解液进行匀 浆，10000-14000g离心3-5分钟，取上清液，按1:1加入样品缓冲液强力混匀后置于100度 的水浴箱水浴加热3-5分钟，1000 Og离心10分钟，取上清液，将其转入另一洁净的试管中。
[0120] 2.利用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行总蛋白定量
[0121] 采用康为世纪微量BCA蛋白定量试剂盒（货号：CW2011)，具体步骤见其说明书。
[0122] 二、SDS-聚丙烯酞胺凝胶电泳（SDS-PAGE)
[0123] 1.蛋白质样品变性：
[0124]a)根据BCA蛋白质浓度测定结果，每个凝胶加样孔中加入相同质量的总蛋白提取 物。按照每1微升蛋白样品加入0. 25微升蛋白上样缓冲液的比例，混合蛋白样品和蛋白上 样缓冲液（5X)。
[0125]b) 100°C或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。
[0126] c)冷却到室温后，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。
[0127] 2?胶板制备：
[0128] 采用Bio-Rad公司的微型垂直板电泳装置制备0. 75mm厚的凝胶，照说明书安装好 玻璃板后，先在小烧杯中配制5ml 10%的分离胶，配方如下：
[0129] 表7分离胶配方
[0130]
[0131] 混匀后立即灌胶，然后加Iml蒸馏水覆盖，室温下放置约30min待胶聚合后，用蒸 馏水洗2-3次，再用滤纸吸干。然后制备2ml5%的浓缩胶，配方如下：
[0132] 表8浓缩胶配方
[0133]
[0134] 混匀后立即灌胶，插入样品梳，避免产生气泡，待胶凝固后，取出样品梳，后用蒸馏 水和IX蛋白电泳缓冲液先后冲洗样品孔。
[0135] 三、上样及电泳
[0136] 将凝胶板装在电泳装置上，内槽中加满IX蛋白电泳缓冲液，外槽中IX蛋白电泳 缓冲液应超过铂丝，按顺序上样。在末端泳道中加入蛋白质质量标准蛋白梯度。电泳时蓝 色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。
[0137] 四、蛋白质印迹
[0138] 1.按照上述方法先进行SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白。
[0139] 2.预先用转印缓冲液浸泡NC膜、滤纸、海棉垫。SDS-PAGE结束后取出凝胶，去除 浓缩胶，在Tris/甘氨酸缓冲液中漂洗数秒，然后置于转印缓冲液中浸泡15-30min。打开 电转印夹，每侧垫上一块专用的用转印缓冲液浸泡透的海棉垫，再各放一块转印液浸透的 滤纸，滤纸与海面垫大小相同或与NC膜，凝胶大小相同均可，将凝胶平放在阴极侧滤纸上， 最后将NC膜平放在凝胶上，去除气泡，夹好电转印夹。在电泳槽加满电转印液，插入电转印 夹，将电泳槽放入冰箱内（电转印液之前要放入冰箱内预冷），连接好电极，接通电流，转印 夹的NC膜应对电泳槽的正极。
[0140] 3.封闭：用IXTBS漂洗一次。加入含5%的无脂奶粉TBS封闭缓冲液，置于振荡 培养箱中进行封闭；
[0141] 4. -抗杂交：弃封闭液，加入用一抗稀释液稀释的一抗（Anti-CLSTN2 antibody(abl56205))杂交溶液，置于4°C杂交过夜，第二天在振荡培养箱中进行杂交；
[0142] 5.回收一抗杂交液，用TBST洗膜3次；
[0143] 6?弃TBST，加入用封闭缓冲液稀释的二抗（GoatAnti-RabbitIgG，HRP Conjugated(CW0103))杂交溶液，置于振荡培养箱中进行杂交；
[0144] 7.弃二抗溶液，用TBST洗膜3次；
[0145] 8. ECL化学发光及图像采集和分析：按照高灵敏度化学发光检测试剂盒（康为世 纪货号CW0049B)，具体步骤参照说明书。
[0146] 9.以P-Actin作为内参进行数据标准化，以对照组滑膜组织中CLSTN2作为参照 样本，计算实验组中CLSTN2蛋白的相对表达水平。
[0147] 五、实验结果
[0148] 结果显示，37例骨性关节炎患者组中有14例阳性，9例对照组中有6例阳性， CLSTN2蛋白阳性率分别是37. 84%和66. 67%，两组差异具有统计学意义。进一步对骨性关 节炎患者组内CLSTN2蛋白表达和基因甲基化状态做相关性分析，结果见图2,23例CLSTN2 蛋白表达阴性的患者里有17例都出现甲基化阳性，表明CLSTN2蛋白表达和基因甲基化呈 负显著相关性。
[0149] 表9骨性关节炎患者组内CLSTN2蛋白表达和基因甲基化相关性分析
[0150]
【主权项】
1. 一种骨性关节炎诊疗试剂，其特征在于，所述诊疗试剂组分中的一种或几种用于检 测或降低序列表中SEQ ID NO. 3的CpG岛甲基化程度。2. 根据权利要求1所述的诊疗制剂，其特征在于，所述诊疗试剂组分中的一种或几种 用于检测或降低序列表中SEQ ID NO. 3的第112bp处CpG岛甲基化程度。3. 根据权利要求1所述的诊疗试剂，其特征在于，采用BSP测序法对SEQ ID NO. 3的甲 基化程度进行检测，优选采用引物序列为序列表SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5进行BSP测 序检测。4. 根据权利要求1或2任意一项所述的诊疗试剂，其特征在于，采用甲基化特异性PCR 法对甲基化程度进行检测，优选采用引物序列为序列表SEQ ID NO. 6到SEQ ID NO. 9进行 甲基化特异性PCR法对甲基化程度进行检测。5. 根据权利要求1所述的诊疗试剂，其特征在于，采用下列方法中任意一种或几种的 组合对甲基化程度进行检测：甲基化敏感的限制性内切酶方法、NaHSOJi、芯片技术方法； 所述NaHSO 3法包括BSP测序法、联合NaHSO 3限制性分析法、甲基化特异性PCR、荧光定量法； 所述芯片技术方法包括甲基化高密度芯片、差异甲基化杂交、甲基化特异性寡核苷酸芯片。6. 权利要1-5任意一项所述的诊疗试剂在制备骨性关节炎诊疗工具中的应用。7. -种检测CLSTN2基因的试剂在制备诊断骨性关节炎诊断制剂中的应用。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，诊断制剂中含有检测CLSTN2基因表达量 和/或检测CLSTN2基因甲基化程度的试剂。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，采用下列方式中的一种或几种检测 CLSTN2基因表达量：荧光定量PCR试剂盒、基因芯片、ELISA法、胶体金法，优选采用引物序 列为序列表SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2进行CLSTN2基因表达量检测。10. -种治疗骨性关节炎的制剂，其特征在于，所述制剂中含有促进CLSTN2基因的转 录或表达的试剂或化合物。
【专利摘要】本发明涉及甲基化CLSTN2基因及其应用，更具体的涉及CLSTN2基因、CLSTN2基因的甲基化检测及其在诊治骨性关节炎中的应用。发明通过转录组测序分析筛查出在骨性关节炎患者中低表达的基因CLSTN2，甲基化测序分析显示CLSTN2基因在病例组中呈高甲基化，进一步的实验验证基因CLSTN2在骨性关节炎患者膝关节软骨组织中低表达，同时该基因在患者膝关节软骨组织中甲基化程度明显高于正常组。本发明提供了一种新的骨性关节炎诊治靶点，具有重要的临床应用价值。
【IPC分类】A61K45/00, C12Q1/68, G01N33/68, A61P29/00, A61P19/02
【公开号】CN105087822
【申请号】CN201510629984
【发明人】杨承刚, 任静
【申请人】北京泱深生物信息技术有限公司
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年9月29日