一种检测羊四种病原菌的多重pcr检测用引物及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种病原体检测技术，特别是用于检测羊体内肺炎克雷伯氏菌、奇异变形杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌的多重PCR检测用引物及多重PCR检测方法。
[0002]
【背景技术】
[0003]近年来，随着我国养羊业向规模化、集约化方向发展以及各类畜禽疫病发病种类的不断增多，羊群疾病发生的种类在不断增加，而且发病率显著上升，肺炎克雷伯氏菌、奇异变形杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、布氏杆菌和葡萄球菌等是导致羊群发病的主要细菌性病原菌(贾俊元，2009)，而且细菌多重感染发生日益频繁、越来越普遍，给规模化养羊场造成巨大的经济损失，严重地威胁到羊养殖业的持续发展。牛钟相等(1996)报道了山羊“猝死症”是由肺炎克雷伯氏菌与凝结芽孢杆菌的混合感染导致，房海等在2005年报道了一起肺炎克雷伯氏菌导致小尾寒羊死亡。沙门氏菌和大肠杆菌都是目前世界公认的重要致病菌，包玉花等在2003年研究发现，羊大肠杆菌病一年四季均可发生，但多发于冬春舍饲时期，发病急、死亡快，可引起严重的腹泻和败血症，是危害我国养羊业的重要传染病之一；而薛俊龙2011年报道，羊大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的一种急性细菌性传染病，各种年龄的羊都易感，临床上以严谊腹泻和败血症为特征，在我国内蒙，青海，宁夏，云南，山西，山东等地，该病均有发生，加之从业人员技术水平却相对滞后，使得羊大肠杆菌病成为规模化养殖场的常见病和多发病，严重影响着养羊业的发展。
[0004]当前检测致病细菌方法还是以传统的细菌分离培养鉴定为主，然后进一步用免疫学方法进行血清分型及生化鉴定。传统细菌学检测方法每次仅能鉴定一种病原菌，检测周期长、灵敏度低，操作繁琐，因此，临床上迫切需要一种能够快速同时鉴定多种病原菌混合感染的检测方法。多重PCR是在常规PCR基础上改进并发展起来的一种DNA扩增技术，一次可以检测多个基因，实现了对多种病原菌的同步检测。有研究以Salmonella的invA、ompC、IpaB 和 hilA 基因，E.coli 的 HlyA、rfbE 和 phoA 基因，K.pneumoniae 的 mrkA、mrkD 基因为靶基因，建立单一或双重PCR方法检测不同的病原菌，对于肺炎克雷伯氏菌、奇异变形杆菌、沙门氏菌和大肠杆菌4种导致毛皮死亡病原菌的四重PCR检测方法国内外均未见有关报道。本发明建立一种能够同时检测肺炎克雷伯氏菌、奇异变形杆菌、沙门氏菌和大肠杆菌的四重PCR检测方法，为快速检测导致羊发病的致病菌，及时采取有效的防制措施提供依据。
[0005]随着分子生物学的发展，PCR已成为细菌检测的重要方法之一。多重PCR由Chamberian等于1988年提出以来，与常规PCR相比，多重PCR简化了检测程序，更为快捷和经济，在细菌混合感染检测上具有较大优势。应用PCR方法检测病原菌的关键是选择特异的保守基因作为靶基因，设计合适的引物，经综合分析，本研究选取肺炎克雷伯菌III型菌毛结构基因(mrkA)、奇异变形杆菌尿素酶合成的正向调节因子R基因(ureR)、沙门氏菌侵袭性抗原保守基因(invA)、大肠杆菌碱性磷酸酶基因(PhoA)基因作为检测的靶基因。K.pneumoniae mrkA基因是其特有的编码III型菌毛的基因'Sedmmllei invA基因是编码侵染上皮细胞表面蛋白的基因，与该菌致病性密切相关，是沙门氏菌属特有的coli phoA基因是其持家基因，存在于所有E.coli中；而/5.aerygiflosa toxR基因是其特有的毒素基因。因此，选取以上基因作为检测靶基因能够保证检测的准确性和特异性。多重PCR影响因素较多而且复杂，本研究选取对扩增效率影响较大的退火温度、Mg2+浓度、dNTP浓度、Taq聚合酶浓度和引物浓度5个参数进行优化，获得较好的敏感性结果，可同时扩增4条目的片段，最低检出限可达14 cfu/mLo该方法临床验证结果与常规检测结果一致，具有较好的实际应用价值，对快速检测肺炎克雷伯氏菌、奇异变形杆菌、沙门氏菌和大肠杆菌具有重要价值，对预防由这4种病原菌引起的羊发病具有重要意义。
[0006]
【发明内容】
[0007]针对现有技术检测羊细菌病多重感染时，检测周期长和敏感性低的缺点，本发明提供了一种检测羊四种病原菌的多重PCR检测用引物及检测方法。可以同时检测肺炎克雷伯氏菌、奇异变形杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌，主要通过研究上述四种病原菌的特性，分别设计4对特异性引物进行多重PCR反应，扩增产物加入上样缓冲液后，再置于含溴化乙锭的琼脂糖凝胶中，进行电泳检测，通过检测结果即可判定上述四种病原菌是否存在，整个检测方法敏感性高、特异性好、操作简便、迅速。
[0008]为了实现上述发明目的，本发明提供了一种检测羊四种病原菌的多重PCR检测用引物，所述引物为:
肺炎克雷伯氏菌上游引物，其核苷酸序列如SED ID N0:1所示，
肺炎克雷伯氏菌下游引物，其核苷酸序列如SED ID N0:2所示，
奇异变形杆菌上游引物，其核苷酸序列如SED ID N0:3所示，
奇异变形杆菌下游引物，其核苷酸序列如SED ID N0:4所示，
大肠杆菌上游引物，其核苷酸序列如SED ID N0:5所示，
大肠杆菌下游引物，其核苷酸序列如SED ID N0:6所示，
沙门氏菌上游引物，其核苷酸序列如SED ID N0:7所示，
沙门氏菌下游引物，其核苷酸序列如SED ID N0:8所示。
[0009]为了更好的实现发明目的，本发明还提供一种多重PCR检测方法，所述检测方法是用于非诊疗目的，包括采用如下引物:
肺炎克雷伯氏菌上游引物，其核苷酸序列如SED ID N0:1所示，
肺炎克雷伯氏菌下游引物，其核苷酸序列如SED ID N0:2所示，
奇异变形杆菌上游引物，其核苷酸序列如SED ID N0:3所示，
奇异变形杆菌下游引物，其核苷酸序列如SED ID N0:4所示，
大肠杆菌上游引物，其核苷酸序列如SED ID N0:5所示，
大肠杆菌下游引物，其核苷酸序列如SED ID N0:6所示，
沙门氏菌上游引物，其核苷酸序列如SED ID N0:7所示，
沙门氏菌下游引物，其核苷酸序列如SED ID N0:8所示；
分别以肺炎克雷伯氏菌、奇异变形杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌的全基因组DNA为模板进行多重PCR扩增反应，并将获得的PCR扩增反应产物加入上样缓冲液后，再置于含溴化乙锭的琼脂糖凝胶中，进行电泳检测，验证弓I物的特异性。
[0010]所述引物为利用以肺炎克雷伯氏菌III型菌毛结构基因、奇异变形杆菌尿素酶合成的正向调节因子R基因、沙门氏菌侵袭性抗原保守基因、大肠杆菌碱性磷酸酶基因设计的4对特异性引物。
[0011]所述多重PCR扩增反应的反应体系为每50yL反应体系中:5.0 μ L含Mg2+的10XPCR buffer [750mmol/L Tris-HCl (ρΗ8.8)，200mmol/L (ΝΗ4) 2S04，0.1 % Tween 20，25mmol/L MgCl2]、2.5 mmol/L 的 dNTP 5.0 μ L、5U/μ L 的 Taq 聚合酶 0.5 μ L、肺炎克雷伯氏菌的DNA模板I μ L、奇异变形杆菌的DNA模板I μ L、大肠杆菌的DNA模板I μ L、沙门氏菌的DNA模板I μ L、引物分别为浓度均为25 pmol/yL的肺炎克雷伯氏菌上游引物和肺炎克雷伯氏菌下游引物各1.2 μ L、浓度均为25 pmol/yL的沙门氏菌上游引物和沙门氏菌下游引物各0.9 μ L、浓度均为25 pmol/ μ L的大肠杆菌上游引物和大肠杆菌下游引物各0.8yL、浓度均为25 pmol/yL的奇异变形杆菌上游引物和奇异变形杆菌下游引物各
1.1 μ Lo
[0012]所述肺炎克雷伯氏菌为肺炎克雷伯菌ATCC 700603，沙门氏菌为ATCC14028伤寒沙门氏菌，大肠杆菌为ATCC8739大肠埃希氏菌，奇异变形杆菌为ATCC12453奇异变形杆菌。
[0013]所述多重PCR扩增反应的条件为:上样缓冲液浓度为IX，dNTPs浓度为0.25mmol/L，Mg2+浓度为2.5 mmol/L，退火温度55 °C，延伸时间45s，循环次数30次。
[0014]所述上样缓冲液为:含0.25界1:%的溴酸蓝，0.25界1:%的二甲苯青、40wt%的鹿糖，余量为水。
[0015]所述上样缓冲液与PCR扩增反应产物体积比为1: 5。
[0016]所述含溴化乙锭的琼脂糖凝胶中